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478 GLOSSÁRIO Ocular.1)Relacionadoaoolho.2)A peçadeummicroscópio. Oócito.Célulano ovárioderivadadeumoogônioque,após a meiose,produzumóvulo;umovoprimitivono ovário. Opsonização.Processopeloqualaspartículassãoengloba- dascomanticorposoucomplementosparaaumentaraafini- dadede fagócitosqueapresentamreceptoresde anticorpos ou complementosparaapartícula. Orquite. Inflamaçãodos testículos.Tambémchamadade testistite. Ovariectomia.Remoçãodosovários. Ovelha.Fêmeaadultado carneiro. Oviduto. Tubo atravésdosqual o óvulo é transportadoao úteroeondenormalmenteocorrea fertilização. Ovulatória, onda. Liberaçãoabundantede GnRH e de gonadotrofinaem respostaà retroalimentaçãopositivade estradiolparainduzira ovulação. Paracelular,transporte.Movimento transepitelialde flui- dosesolutosatravésdosespaçosintercelulares. Parácrino.Produzidopor umacélulaatuandosobrecélulas adjacentesparamodificaroumodularo desenvolvimentode proliferação. Parto.Processofisiológicopeloqualo úteroprenheexpulsao fetoe aplacentadoorganismomaterno(trabalhodeparto). Pedigree.Umaárvorefamiliardesenhadacomsímbolosgené- ticospadrões,mostrandomodelosdeherançaparacaracteres fenotípicosespecíficos.Uma representaçãodosancestraisde umindivíduooudeumafamília;umaárvoregenealógica. Pineal, glândula.Glândulaendócrinalocalizadana basedo cérebroequesecretao hormôniomelatonina. Piometra.Acúmulo de pusdentroda luz uterinaassociado cominfecção. Pirexia.Elevaçãodatemperaturacorporalacimadonormal. Tambémchamadadefebre. Placenta.Aposiçãooufusãodasmembranasfetaisaoendo- métrioparapermitirtrocasfisiológicasentreo fetoe amãe. É resultantedeváriosgrausde interaçõesfeto-maternase é ligadaao embriãoporumcordãodevasossangüíneos. Placentoma.Em ruminantes,o cotilédonefetal fusiona-se comascarúnculas,quesãoprojeçõesespecializadasdamuco- sauterina,paraformarplacentomasouunidadesfuncionais. Plasmalema.Membranacelular. Plasmática,célula.Uma célulaB ativadaquesintetizagran- desquantidadesdeanticorpos. Poliespermia.Imediatamenteapósafertilização,asuperfície do ovo (zonapelúcida)modifica-separaimpedira fusãode espermatozóidesadicionais.Quando essemecanismofalha, um ou mais espermatozóidesentram no ovo formando embriõespoliplóides. Poliéstricos estacionais.Animais que começamo ciclo estralduranteestaçõesespecíficasdereprodução. Porcentagemdenascimentode cordeiros.Númerodecor- deirosnascidosde 100ovelhasexpostasao acasalamento. Pré-parto.Antes do parto/trabalhodeparto. Primípara.Animal prenhepelaprimeiravez. Primordial. 1)Relativoaogrupoembrionáriodecélulasque sedesenvolveemumórgãoou estrutura.2) Formadoduran- te o estágioinicial dedesenvolvimento. Progesterona.1) Principal esteróideovariano produzido pelocorpolúteo,secretadopelofolículoà épocadaondade gonadotrofina.2) Esteróidesexual secretadopelo tecido luteínicoe pelaplacenta.Age comoo "hormôniodagesta- ção"esuprimeaatividadedo miométriodurantea gestação. Prostaglandina.1) Substânciaquímicaproduzidapeloorga- nismoe queprovocacontraçõesdamusculaturauterina.2) Grupo de ácidosgraxoshidróxi não-saturadosde vinte car- bonoscomum anel ciclopentano.Mais intimamenteasso- ciadascom,areproduçãoestãoaPGFza,quedesempenhaum papelna luteólisee no parto,e aprostaglandinaEz. Protamina.Qualquerumadeumgrupodeproteínassimples, altamentebásicas,ricasemargininaesolúveisemágua;elas neutralizama açãoanticoagulantedaheparina. Pseudogestação.Falsagestaçãodevidaaoprolongamentoda açãoluteínica(persistênciado corpolúteo,diestroprolonga- do). Persistênciado corpolúteoalémdesuavidaútil cíclica (égua)ouassociadacomacúmulodefluidosno útero(cabra). Puberdade.1) Modificaçõesfísicase bioquímicas,associadas com a ativaçãodo eixo hipotálamo-hipófise-gonadal,que levamà funçãoreprodutivado adulto.2) A idadeemqueos órgãosreprodutivostornam-sefuncionalmenteativos. Puerpério. Período pós-parto,definido como o espaçode tempoentreo partoe a voltado organismomaternoaoseu estadonormaldenão-gestante. Purulento. Contendo,expurgandoou produzindopus. Quimera. Indivíduo com populaçõescelularesde maisde umgenótipo,produzidopordoisou maiszigotos. Reabsorção.Absorção de restosteciduaisou fluidospelo organismo. Receptor. Proteína presentena membranacelular que se liga a um hormônio cognatoe controla seuefeitosobrea morfologiacelulare/ouatividade. Receptor de célula T. Molécula presentena superfíciede célulasT que se liga especificamentea um determinado antígenoquandoesteestálocalizadocomum complexode histocompatibilidademaior de proteínaspresenteem uma célulaqueapresentaantígeno.O receptordecélulaT, queé umaproteínadiméricaformadapor umasubunidadea e ~, ou uma subunidade y e °, confereespecificidadedirecionada àscélulasT, assim,elasreconhecemapenasum ou poucos antígenos.Sob condiçõesapropriadasa ligaçãodo receptor decélulasT aoseuantígenolevaà ativaçãodacélulaT. Recessivo.Alelo expressosomenteemcondiçãodehomo- zigoto. Retroalimentação,alça.Mecanismodecomunicaçãoentre osováriose o eixohipotálamo-hipófise. Retroalimentaçãonegativa,alça. Processopelo qual um hormôniosecretadopor um órgão-alvo(p. ex.: o ovário) emitesinal ao eixo hipófise-hipotálamoparasecretarhor- môniosestimulantes(p. ex.:LH e FSH) paraseremreajus- tadosaoestadoprimitivo. Sangramento,metaestro.Presençadesangueno corrimen- to vulvarde48 a 72horasapóso cio. É devidoa hemorra- giaspetequiaisno endométrio.É apenasumaindicaçãode quea vacaesteveemcio enão temqualquerrelaçãocoma concepção. Seminíferos,túbulos.T úbulosenroladospresentesnos tes- tículosequecontêmcélulasqueproduzemespermatozóides. Sephadex.Nome comercialdepartículasdegelcompostas dedextranasligadasemcruzamento;usadascomopeneiras molecularesnafiltraçãodegeleparapesquisaemtranspor- tedeovos. Sinapse.Pareamentoíntimodecromossomoshomólogosna meiose. Somáticas,células.Qualquercélulanão-germinativaque compõeo corpodeumorganismo. Taxa de nascimentode cordeiros(fecundidade).Número decordeirosnascidosdeovelhasparidas. Teca. Bainhade revestimento,tal comoaquelaquecobre umtendãoou umfolículoovarianovesicular. Tendão.Faixade tecidofibrosoclaroe resistenteque liga ummúsculoa um osso.As fibrasmuscularessefundemna extremidadedeumtendão,enquantoaoutraextremidadeé ligadaa umosso. Testículo. Uma de duasglândulasem formade ovo, que produzespermatozóides,normalmentesituadano escroto. Testosterona.Hormônio esteróideproduzidopor células dos testículos,independentesdas células que produzem espermatozóides.Um estrógenocirculanteprimário. Tiroxina. Hormônioativoquecontémiodo,produzidonor- malmentenaglândulatireóide,queauxilianaregulaçãodo metabolismo;produzidasinteticamenteouextraídadaglân- dulatireóideemformacristalinaparao tratamentodedis- túrbios tireoidianos,como hipotireoidismo,cretinismoe mixedema.Tambémchamadadetetraiodotironina. Toracolombar.Relaciona-seàsregiõestorácicae lombarda espinha. Transuterina, migração. Migração de embriõesde um cornouterinoparao outro,poiso espaçouterinoé comum emsuínosfacilitandoa distribuiçãoigualnosdoiscornos. GLOSSÁRIO 479 Trofoblasto. No início do desenvolvimento,é a camada externado blastocisto,quedáorigemàsmembranasextra- embrionárias.No desenvolvimentoposterior,o termorefe- re-seàscélulasepiteliaisdocórion. Túnica. Camadaderevestimentodetecido. Ultra-sonografiatransretal.Examedeultra-somatravésdo reto. Vesicular. 1) De, ou relacionadoa, vesículas.2) Quecon- témvesículas. Viviparidade.Nascimentodedescendentesvivos,emcom- paraçãocomovoviviparidade(posturadeovos). GLOSSÁRIO DEABREVIAÇÕES COMUNS ACTH ADH AFP AlDS AMH AMP AMPc ARC ATP BBB BBT bFGF BP BSA CDP ClC CL CRH CSF D&C D&E DES DHEA DHT DMB DMSO DNA DNAc EF EGF ELISA Hormônioadenocorticotrófico Hormônioantidiurético a-proteínafetal Síndromeda imunodeficiênciaadquirida (HIV) Hormônio antimülleriano Monofosfatodeadenosina AMP cíclico ComplexorelacionadoàAidsTrifosfatodeadenosina Barreiracérebro-sangüínea Temperaturabasaldo corpo Fatordecrescimentodefibroblastobásico Pressãosangüínea Albumina séricabovina 5'-fosfatodecitidina Imunocomplexoscirculantes Corpo lúteo(singular) Hormônio liberadordecorticotrofinas Fatorestimulantedecolônias Dilataçãoe curetagemdoútero Dilataçãoe evacuaçãodo útero Dietilestilbestrol Diidroepiandrosterona Diidrotestosterona Diazobenziloximetil Dimetil sulfóxido(MelSO) Ácido desoxirribonucléico DNA complementaraoRNA Fatordealongamento Fatordecrescimentoepidérmico Ensaioimunoabsorventeligadoa enzimas 480 GLOSSÁRIO FCF FCS FGF FIV FRP FSH FSH-RH GnRH GHRH GLC GM-CSF GTT hCB hCG hMG hMT HPLC HSV IA ICM IF IFN IFN-g Ig IGFS IL-l IL-6 1M IRM IUGR IUGR-LBW IV kDa LBW LH LH-RH LH-RF LI LPS Freqüênciacardíacafetal Sorofetalbovino Fatordecrescimentodefibroblastos Fertilizaçãoin vitro Proteínaderegulaçãofolicular Hormôniofolículoestimulante Hormônio liberadordohormôniofolículo estimulante Hormônio liberadordegonadotrofinas Hormônioliberadordohormôniodocres- cimento Cromatografiadegáslíquido Fatorestimulantedecolôniasdegranuló- citos-macrófagos Testedetolerânciaàglicose Sanguedo cordãoumbilicalhumano Gonadotrofinacoriônicahumana Gonadotrofinadamenopausahumana Tumormamáriohumano Cromatografialíquidadealtapressão Vírus herpessimples Inseminaçãoartificial Massacelularinternadeblastocistos Técnicasde imunofluorescência Interferon Interferon-g Imunoglobulina Fatorsérico decrescimentosemelhanteà insulina Interleucina-l Interleucina-6 Intramuscular Imagemderessonânciamagnética Retardamentodocrescimentointra-uterino Baixopesoaonascerpor retardamentodo crescimentointra-uterino Intravenoso Quilodálton Baixopesoaonascer Hormônio luteinizante Hormônio liberadordohormônioluteini- zante Fator de liberaçãodo hormônio luteini- zante Inibidor luteinizante Lipopolissacarídeos MI MIS MT NA NGF NK PAF PAGE PBL PBS PDGF PG PGEz PGFz PIF PMSG PVS RNA RNAr RRA SMC STH TBG TC TDF TGF TGF-a TGF-b TNF VIP Macrófagos SubstânCiainibidoramülleriana Mitocôndria Anticorpo neutralizador Fatordecrescimentonervoso Célula matadoranatural Fatordeativaçãodeplaquetas Eletroforesedegelpoliacrilamida Linfócitosdo sangueperiférico Soluçãosalinatampãofosfatada Fatorde crescimentoderivadodeplaque- tas Prostaglandinas ProstaglandinaEz ProstaglandinaFz Fator inibidordeprolactina Gonadotrofinaséricadeéguaprenhe Espaçoperivitelino Ácido ribonucléico RNA ribossômico Ensaioderadiorreceptor Somatomedina-c Hormônio somatotrófico Globulina carreadorade tiroxina Tomografiacomputadorizada Fatordedeterminaçãotesticular Fatordecrescimentotransformador Fator-adecrescimentotransformador Fator-bdecrescimentotransformador Fatordenecrosetumoral Peptídeointestinalvasoativo UNIDADES DEMEDIDA mg }J.g ng pg UI Miligrama(10-3g) Micrograma(10-6g) Nanograma(10-9g) Picograma(10-1Zg) UnidadeInternacional KPEND1cEs - .I ApÊNDICE I NúmerodeCromossomosdasEspéciesBovinae,Equinaee Caprinae NOME COMUM NÚMERO FUNDAMENTALNOME CIENTÍFICO NÚMERO DE CROMOSSOMO (2N) Bovino doméstico Bantengo(bovinoselvagemdeJava,Bornéu) Zebu Iaque(bovídeoselvagemdaÁsia Central) Bisãoeuropeu Bisãoamericano Gaur,bisãoindiano Niala Búfalodo Congo Búfaloafricano Búfaloasiático Anoa N ilgai Antílope dequatrocornos Sitatunga Bostaurus Bosbameng Bosindicus Bosgrunniens Bisonbonasus Bisonbison Bosgaurus Tragelaphusangasi Synceruscaffernanus Synceruscaffercaffer Bubalusbubalis Anoadepressicornis Boselaphustragocamelus Tetracerusquadricornis Tragelaphusspekei 60 60 60 60 60 60 58 55 54 52 48 48 46 38 30 62 62 62 62 62 62 62 58 60 60 58 60 60 38 58 Cavaloselvagemda Mongólia Eqüinodoméstico Jumento Jumentoafricano JumentoselvagemdaMongólia Jumentoselvagemdo Tibet JumentoselvagemdaPérsia ZebradeGrevy Zebraafricana ZebradeGrant Zebradasmontanhas Equusprzewalskii Equuscaballus Equusasinus Equusasinusafricans Equushemionus Equuskiang Equusonager Equusgrevyi Equusburchelli Equusburchelliboehmi Equuszebra 66 64 62 62 56 56 56 46 44 44 34(?) 94 94 104 104 104 104 104 78 82 82 60 Caprinodoméstico Ibex Marcar Antílope de Saiga Aoudad Carneirodo Afeganistão Ovino Kara-Tau Ovino doméstico Muflon, carneiroselvagem Carneiroocidental Carneirocanadense CarneirodeLaristan Carneiro almiscarado Tahr do Himalaia CabradasMontanhasRochosas Caprahircus Capraibex Caprafalconeri Saigatatarica Ammotraguslervia Ovis ammoncycloceros Ovis ammonnigimontana Ovis aries Ovis musimon Ovis orientalis Ovis canadensis Ovis ammonlaristanica Ovibosmoschatus Hemitragusjemlahias Oreamnosamericanus 60 60 60 60 58 58 56 54 54 54 54 54 48 48 42 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60(?) 60 60 60 60 60 481 ApÊNDICEII NúmerodeCromossomose HabilidadeReprodutivaemHíbridosdeEqüinos, Bovinose Caprinos Pai ESPÉCIE E NÚMERO DE CROMOSSOMOS(2N) Mãe HÍBRIDOS, NÚMERO DE CROMOSSOMOS(2n) HABILIDADE REPRODUTIVA Cavalo selvagemdaMongólia, 66 (E. przewalskii) Jumento, 62 (E. asinus) Eqüinodoméstico, 64 (E. caballus) Jumentoafricano, 62 (E. asinusafricanus) JumentoselvagemdaMongólia, 56 (E. hemionus) ZebradeGrevy, 46 (E. grevyi) Zebraafricana, 44 (E. burchelli) Jumento, 62 (E. asinus) Eqüinodoméstico,64 (E. caballus) Eqüino doméstico,64 (E. caballus) Jumento,62 (E. asinus) 65 63 (Mulaouburro) 63 (Bardoto) Fertilidade(?) Estéril Machosestéreis,fêmeasférteis sóemcondiçõesmuito excepcionais Fértil Fértil (?) Estéril Estéril Estéril Bisãoamericano, 60 (Bisonbison) Bisãoamericano, 60 (Bisonbison) Bovino doméstico, 60 (Bostaurus) Jumento,62 (E. asinus) Jumento,62 (E. asinus) Eqüino doméstico,64 (E. caballus) Jumento,62 (E. asinus) Zebradasmontanhas,34(?) (E.zebra) 62 59 55 (Zebróide) 53 (Zebronkey) 48 Fêmeasférteis MachosFI estéreis MachosFI estéreis Caprinodoméstico, 60 (Caprahircus) Caprinodoméstico, 60 (Caprahircus) Ovino doméstico, 54 (Ovisaries) Carneirocanadense, 54 (Oviscanadensis) Zebu,60 (Bosindicus) Bovinodoméstico,60 (Bostaurus) Bisãoamericano,60 (Bisonbison) 60 60 (Catalo) 60 (Catalo) Fetosa termo,mashíbridosnão sobrevivem Embriõessãoreabsorvidosou abortadosàs6 semanasde gestação Ambos os_sexosférteis Fertilidadereduzida 482 Ovino Barbary,58 (Ammotraguslorvia) Ovino doméstico,54 (Ovisaries) 59(?) 57 Muflon,54 (Ovismusimon) Ovinodoméstico,54 (Ovisaries) 54 54 ApÊNDICElU PreparodeSoluçõesFisiológicas SOLUÇÃO TAMPÃO FOSFATADA DULBECCO (PBS) Parafazer10I: CaClz.2HzO MgS04' 7HzO NaCI KCI NazHP04 KHzP04 Glicose Sulfatodeestreptomicina PiruvatodeNa PenicilinaG sódica 1,32g 1,21g 80 g 2g 11,5g 2g lOg 0,5g 0,36g 1.000.000unidades a Podeserpesadaantecipadamenteeguardadaindefinidamenteemvidra- ria estérilsobrefrigeração. bPodeserpesadaantecipadamentee guardadaemvidrariaestérilsob refrigeraçãopor um mês.Não adicionaro CaClz e o MgS04 a não ser poucoantesdo uso. Antes deusar: 1. Dissolva NaCl, KCl, NazHP04' KHzP04' glicose, estreptomicina,piruvatode Na e penicilinaem 8 1de águadistiladae deionizada. 2. DissolvaCaClz e MgS04.7HzO em2 1de águadestila- dae deionizada. 3. Adicione 2 1 a 8 1 com agitaçãoconstante.(Outros métodospara dissolveressesingredientesfreqüente- mentelevamà formaçãodeumprecipitado.) 4. Adicionesoro bovino tratadopor aquecimento(1%) imediatamenteantesdo uso para a recuperaçãodos embriõese adicione10%de soroparaa estocagemdos embriões. PreparodeSoluçõespara Estocagem Duassoluçõesparaestocagem: 1. Soluçãotampãofosfatadamodificada Sorofetalbovino (FCS) PBS +20%FCS 2. PBS +20%FCS Glicerol Meio deresfriamento(10%glicerol,v/v) 40ml 10ml 50ml 45ml 5 ml - 50ml COMPOSIÇÃO DE ALGUMAS SOLUÇÕES E SOLUÇÕES TAMPÃO COMUNS SoluçãodeBaker: Glicose NazHP04 KHzPO4 NaCl Adicione águadestiladaa 100ml 3g 0,6g 0,01g 0,2g SoluçãodeJoel: 80 ml dedextrosea 5,42%emáguadestilada 20 ml de0,125NzMgClz emáguadestilada a b SoluçãodeLocke: CaClz KCl NaHC03 NaCl Adicioneáguadestiladaa100ml 0,24g 0,42g 0,1g 9,0g Soluçãofisiológica: NaCl , Adicione águadestiladaa 100ml 0,85g SoluçãotampãodeRingermodificada: NaCl KCl KHzPO 4 MgSO4. 7HzO HCl tris 120mM 5mM 10mM 5mM 1mM SoluçãodeRinger-Locke: NaCl KCl CaClz NaHC03 Glicose(opcional) Água 9,5g 0,075g 0,1-0,2 g 0,1-0,2 g 1,0g 1.000ml SoluçãodeRinger-Tyrod: NaCl KCl CaClz MgSO4 NaHC03 Glicose (opcional) Água 8,0g 0,2g 0,2g 0,1-0,2g 0,5-1,0g 1,0g 1.000ml SoluçãodeScott: Bicarbonatodesódio Sulfatodemagnésio Água destilada 3,5g 20,0g 1.000ml A soluçãodeScottdeveserusadaapenasquandoa água detorneirafor "dura"e devesertrocadacomfreqüência,p. ex.,apósa lavagemde 20a 25diapositivos. 483 484 ApÊNDICES BSS deHankssembicarbonato(previamenteesteriliza- daporautoclave): Penicilina 250unidades/ml Estreptomicina 250J-Lg/ml Kanamicina 100J-Lg/ml ou gentamicina 50 J-Lg/ml AnfotericinaB 2,5 J-Lg/ml (Todasaspreparaçõesestéreis,guardara -20°C.) Dexametasona1mg/ml(100x). Estajá vemesterilizadaemfrascosdevidro.Paradissol- ver,adicione5 ml deáguacomseringa,removaediluapara atingirumaconcentraçãode1mg/ml.Façaalíquotaseguar- de a -20°C. Betametasonae metilprednisolonapodemser preparadasdamesmamaneira. Penicilina (p. ex.,cristapenbenzilpenicilinasádica). 1.000.000unidadesporfrasco Use 4 frascose 400ml deBBS deHanks Preparecomoparakanamicina;concentraçãofinal de 10.000unidades/ml. Soluçãotampãofosfatada(PBS) (Dulbecco"A"): Tabletesoxáide,Code BR14a, 1 tabletepor 100ml de águadestilada Distribuae autoclave. Guardena temperaturaambiente,pH 7,3,osmolalidade 280mOsm/LKg PBSB contémcálcioe magnésioe deveserpreparadoe esterilizadoseparadamente.Se necessário,misture com PBSA poucoantesdo uso. ApÊNDICEIV Técnicaparaa DeterminaçãodaConcentraçãoEspermática comHemocitômetro EQUIPAMENTO RECOMENDADO Platelet/WBC Unopette@ Microcollection system (Becton-Dickinson,Rutherford, New Jersey) - Reservatóriosplásticoscontendo1,98ml de oxalato deamôniotampãoa 1% - Pipetascapilaresdevidrode 20).lIcomprotetoresde plástico Câmara de contagem(hemocitômetro)de Neubauer e lamínulas Calculadora de laboratório com unidade de contagem (variaçãode0-999) TÉCNICA 1. Misture muito bem o sêmenpara uma distribuição homogêneadascélulasespermáticas. 2. Mistureo sêmencomumdiluenteadequado(tal como o oxalatode amôniotampãoa 1%) a umadiluiçãode 1:100(p.ex.,20).l1desêmenpara1,98ml dediluente). 3. Coloque um hemocitômetró limpo (câmara de Neubauer)sobreumasuperfície'planae cubracomuma lamínulaapropriada. 4. Misturemuitobemo sêmendiluídoepreenchaimedia- tamenteas duas câmarasdo hemocitômetrocom o material.Não preenchaascâmarasdemasiadamente. 5. Espere5 minutosparao sêmenassentarantesde iniciar a contagem.O hemocitômetropode ser colocadoem umaplacadePetri umidificadae cobertaparaprevenir desidrataçãoduranteo períododeespera. 6. A câmaradeNeubauerconsistede9 quadradosgrandes. Com um microscópiode contrastede fasede 200X, conte todasascabeçasde espermatozóidesque estive- remdentrodo grandequadradocentral,queé subdivi- dido em 25 quadradosmenores.As cabeçasdosesper- matozóideslocalizadassobreaslinhasdecadaumdesses quadradosdevemserincluídasnacontagemsomentese estiveremsobrea bordasuperiorou esquerda.As cabe- çassobrea bordainferior ou direitade cadaquadrado não devemsercontadas. 7. A contagemdosespermatozóidesdeveserfeitasepara- damenteemcadaumadascâmarasdo hemocitômetro. Se a contagemespermáticade duascâmarasvariarem maisde 10%,desprezeos resultadose preparecâmaras dehemocitômetrosadicionaisparaa recontagem. 8. Certifique-sedefinalizaro processodecontagemfocali- zandologoabaixoda lamínula,porquealgumesperma- tozóidepoderáteraderidodo ladodebaixodela. CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA 1. Estabeleçaa médiada contagemespermáticade duas câmaras. 2. As dimensõesda grandeárea central da câmarade Neubauersão I mm (largura)X 1 mm (altura) X 0,1 mm (espessura)paraum volumede 0,1 mm3.Como a concentraçãoespermáticaé normalmenteregistradaem númerodeespermatozóidesporcentímetrocúbico(cc), eladevesermultiplicadapor umfatorde 10.000. 3. Comoo sêmenfoi diluídonaproporçãode 1: 100antes, a contagemespermáticafinal devesermultiplicadapor umfatoradicionalde 100. 4. EXEMPLO: Contagemdo sêmendiluído na câmara1 = 240 Contagemdo sêmendiluído na câmara2 =250 Contagemespermáticamédia=245 Concentraçãoespermáticacelular= 245 X 104X 102Jccou 245 X 106Jcc 485 ApÊNDICEV PreparodeColoraçõesEspermáticas COLORAÇÃO DE PAPANICOLAOU O corantedePapanicolaoudistinguecommuitaclareza componentescelularesbasófilosde acidófilose permiteum examedetalhadodo padrãoda cromatinanuclear.Por esse motivo,essemétodoérotineiramenteusadoparao diagnós- tico citológico.A técnicada coloraçãode Papanicolaoué útil tambémpara a análiseda morfologiaespermáticae, ainda,no examedecélulasgerminativasimaturas. 1. Preparodo espécime.O esfregaçodevesercuidado- samentesecadoao ar e, então,fixadoem partesiguaisde etanol(95%)e éterde5 a 15minutos. 2. Coloração.Os esfregaçosfixadosdevemsercorados daseguintemaneira: Etanol80%1 Etanol70% Etanol50% Águadestilada HematoxilinadeHarrisouMayer Águacorrente Etanolácido Águacorrente SoluçãodeScott3 Águadestilada Etanol50% Etanol70% Etanol80% Etanol95% OrangeG6 Etanol95% Etanol95% EA-504 Etanol95% Etanol95% Etanol95% EtanoI99,5% Xilol (3 cubascomcorante) 10dipS2 10diPs 10diPs 10diPs Exatamente3 minutos 3 a 5 minutos 2 diPs 3 a 5 minutos 4 minutos 1dip 10diPs 10dips 10diPs 10diPs 2 minutos 10diPs 10diPs 5 minutos 5 diPs 5 diPs 5 diPs 2minutos Aproximadamente 1minutoemcadacuba Troqueo xilol casoele fique leitoso.Monte imediata- mentecomDepexou qualqueroutromeiodemontagem. SOLUÇÕES DE ESTOCAGEM Preparesoluçõesa 10%separadasdecadaumdoscoran- tesdaseguintemaneira: EosinaY 10g em 100ml deáguadestilada BismarckmarromY 10g em 100ml deáguadestilada Verde-claroSF 10g em 100ml deáguadestilada Parapreparar200ml de acimadaseguintemaneira: EosinaY BismarckmarromY Verde-claroSF corante, misturea solução 50ml 10ml 12,5ml Completepara2.000ml cometanol95%;adicione4 g de ácidofosfotungsticoe 0,5 ml desoluçãosaturadadecar- bonatode lítio. Misturebeme guardea soluçãoa tempera- tura ambienteem vidros de cor castanho-escura(âmbar) muito bemfechados.A soluçãoé estávelpor 2 a 3 meses. Filtre antesdeusar. Constituintesdo OG6: CristaisOrangeG Água destilada Etanol95% Ácido fosfotungstico 10g 100ml 1.000ml 0,15g Soluçãodeestocagemnúmero1: Prepareumasoluçãoaquosaa 10%conformesegue:Cristal OrangeG 10gem100mldeáguadestilada.Agitebemedeixe descansarà temperaturaambienteemfrascosdecorcastanho- escura(âmbar)duranteumasemanaanteS"deusar. Soluçãode estocagemnúmero2 (OrangeG, soluçãoa 0,5%): Soluçãodeestocagemnúmero1 Preparecometanol95% para1.000ml 50ml 1Verifiquea acidezdaáguaantesdeprepararosdiferentesgrausdo etano\. O pH deveser7,0. ZUm dipcorrespondea aproximadamente1segundo.(Dip significamergu. lhar a lâminaemsoluçãoe retirá-Iaemseguida- N.T.). 3A soluçãode Scott é usadaquandoaáguadetorneiraé "dura". 4O corantedePapanicolaoupreparado(EA50 eOG6) podeseradquiridono comércio.Geralmente,asmesmascompanhiasmanufaturamo preparadode hematoxilina.Usualmente,oscorantesdisponíveiscomercialmentesãosatis- fatórios,porémelespodemserpreparadosno laboratórioa um preçobem menor.Os corantespodemserpreparadosdaseguintemaneira: EosinaY 486 10g BismarckmarromY 10g Verde-claroSF, amarelado 10g Água destilada 300ml Etanol95% 2.000ml Ácido fosfotungstico 4g Soluçãosaturadadecarbonatode lítio (emáguadestilada) 0,5 ml BelseyMA, Elliasson R, GallegosAJ, Moghissi KS, PaulsenCA, Prasad MRN. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction, WHO Special Programme of Research,Developmentand ResearchTraining in Human Reproduction. Singapore:PressConcern, 1980. Para preparara soluçãofinal de 1.000ml do corante, adicione0,15g deácidofosfotungsticoa 1.000ml da solu- çãodeestocagemnúmero2; misturebememfrascoscasta- nho-escurosbemfechadosà temperaturaambiente.Filtre antesdeusar.A soluçãoé estávelpor 2 a 3 meses. HematoxilinadeHarrissemácidoacético: Hematoxilina(cristaisescuros) Etanol95% Sulfatoamôniodealumínio Águadestilada Óxido demercúrio 8g 80ml 160g 1.600ml 6g Paraprepararamisturacorante,dissolvao sulfatoamônio de alumínioem águadestiladaporaquecimento.Dissolvaos cristaisdehematoxilinaemetanol95%.Adicioneasoluçãode hematoxilinaaosulfatoamôniodealumínio.Aqueçaamistura a 95°C. Removadachamae,sobagitação,adicionevagarosa- menteoóxidodemercúrio.A soluçãoadquirecorpúrpura-escu- ra.Mergulheimediatamenteorecipienteembanho-mariafrioe filtrequandoasoluçãoestiverfria.Guardeemfrascosescurosà temperaturaambientee deixedescansarpor48horas.Diluaa quantidadenecessáriaempartesiguaiscomáguadestiladaefil- trenovamente. CoranteGiemsa: Coloque uma camadade álcool metílico não-diluído sobrea lâmina. Deixedescansarpor 10minutos. Drenee sequeao ar. Cubraa lâminacomcoranteGiemsa(17gotasdasolu- çãode estocagemGiemsaemáguadestiladasuficiente paraobtero volumefinal de5 ml). Deixedescansarpor20 minutos. Lavecomáguadestilada. CorantedehematoxilinadeMeyer: Coloque uma camadade formaldeídoa 10% sobrea lâmina. Deixedescansarpor 1minuto. Lavecomáguadestilada. Core por2 minutoscomhematoxilinadeMeyer. Lavecomáguadestilada. Corantecristalvioleta-rosabengala: Coloqueumacamadade clorazene(cloraminaT) (5% emáguadestilada)sobrea lâmina. Deixedescansarpor5 minutos. Lavecomálcool95%. Mergulheemcristalvioleta(25%emáguadestilada) Deixedescansarpor8 minutos. Lavecomálcool95%. Mergulheemrosabengala(1% em águadestilada)por 8 segundos. Lavecomáguadestilada. ApÊNDICES 487 CorantedeBryanparaespermatozóides,corantedeGraham e Leishmanparasangues: Fixe a lâminaemformalina(10%por3minutosesub- seqüentementeem etanol95% por 3 minutose etanol 70%por3 minutos,troqueemcadaterceiravez). Lave com águadestiladapor 3 minutose megulheem alfanaftolpor4,5minutos. Lave em águade torneirapor 15 minutose adicione pironinaB por 2 minutos. Mergulhe3 vezesemáguadetorneira. Adicione corantede Bryanmodificadopor 15minutos (descriçãoa seguir). Mergulhe3 vezesemácidoacéticoa 1%., Lave em águade torneirapor 1 minuto e adicioneo corantedeLeishmanparasanguepor5 minutos. Mergulhe3 vezesemáguadetorneirae sequeaoar. Coranteparaespermatozóides(Bryanmodificado): Ácido acéticoa 1% Eosinaamarela Verderesistente Naftol amareloS 1.500ml 0,5g 0,5g 0,5g Misture muito bem e guardeem frascofechado.Filtre o coranteantesdeusar. CorantedeLeishmanparasangue(soluçãodeestocagem): Junte 0,5 g de azulde metilenoeosinadoe 300 ml de álcoolmetil absoluto(MeOH). Misturemuitobeme deixeenvelheceremlocalescuro na temperaturaambientedurante7 dias. Coloqueo coranteemumaestufa(35°C a37°C) por2 dias. A soluçãodeestocagemestáprontaparausoe deveser guardadaemfrascoescurobemfechado,longedo calor edaluz. . Soluçõesde estocagemalternativasparacorarsangue podemseradquiridasno comércio,comoo corantede Jennere o deWright parasangue.A duraçãodetempo envolvidocom essescorantesdeveservariadana fase Leishmando procedimentopara conseguirresultados comparáveis. Soluçãotampão:Junte 2 tabletestampão,pH 6,8,com 200ml deáguadestilada.(Não sendousadade imedia- to, verifiqueo pH antesdo uso.) Corante de Leishmanparasangue(soluçãode execu- ção):Junte 10ml desoluçãodeformaldeídocom90IT,l1 deEI0H 95%.(0,1gdeacetatodecálciopodeseradi- cionadapor 200ml desoluçãoparaassegurarpH neu- tro 7,0). 5UlsteinM, Capell, HolmesK, PaulsenCA. Nonsymptomaticgenital tract infection andmale infettility.ln: Human Semenand Fettility Regulationin Men. St. Louis:Mosby, 1976. 488 ApÊNDICES Formalinaalcoólica:Junte 10ml desoluçãodeformal- deídocom90ml deEtOH 95%;0,1g deacetatodecál- cio podeseradicionadapor200ml desoluçãoparaasse- guraro pH neutro7,0. Alfanaftol:Dissolva1gdealfanaftolem100mldeálcool etílico40%(EtOH). Poucoantesdousoinicial,adicione 0,2ml desoluçãodeperóxidodehidrogênioa3%. PironinaY: Junte 1 g de pironina,4 ml de anilinae 96 ml deEtOH 40%. Citrato desódiotampão:Misture7 g decitratodesódio com 11deNaCl 0,9e ajusteo pH a 7,5. CorantedeBryan/LeishmanparaEsfregaçosdaMorfologiadoFluidoSeminal Nota:Useesfregaçosdeamostrasrecentes,secosaoar,elâminaslimpas. Formalinaalcoólica10% 1minuto Álcooletílico(EtOH)80% 5minutos EtOH 70% 5minutos EtOH 50% 5minutos Alfanaftol 4minutos Renovetodavez Troquea cada3 vezesa Troquea cada3 vezes Troquea cada3 vezes Troquea cada3 dias Adicione 0,4ml deperóxidodehidrogênioa 3% a 200ml dealfanaftolpoucoantesdo usoinicial; asoluçãopermane- ceativapor3 diasà temperaturaambiente. Águacorrentedetorneira PironinaY Águacorrentedetorneira Citrato desódiotampão Águadestilada CorantedeBryanmodificado Ácido acético1% Águacorrentedetorneira Tampãoe corantedeLeishman 15minutos 4minutos 3dipsb 3 minutos 1minuto 15minutos 2diPs 1minuto 30minutos Correntevagarosamente Renovea cadasemana Correntevagarosamente pH 7,5j renovea cadavez Renovea cadavez Renovea cadaduasvezes Renovea cadavez Correntevagarosamente Renovea cadavez Filtre 50ml doestoquedeLeishman;adicionetampão150ml pH 6,8efiltre denovo imediatamenteantesdo uso. Águacorrentedetorneira 1 a 2dips Correntevagarosamente Secarao ar (nãosujar) aTroqueacada30 lâminasseestiverusandoumacubapara10lâminas. bCadadipdeveteraproximadamente1 segundodeduração. CONSIDERAÇÕES ESPECIAIS 1. A pironina Y, os corantesde Bryanmodificadose de Leishmandevemserfiltradosantesdousoinicial.Além disso,o tampãoe o corantedeLeishmanemusodevem serfiltradosantesdo usopararemovero corantepreci- pitado. 2. A intensidadedocorantefinalpodeseraumentadapela coloraçãopor tempomaior no corantede Leishman tampãoou podeserdiminuídapor lavagensrepetidas. Confiraa intensidadedesejadacomo microscópioantes demontara lâmina. 3. o peróxidode hidrogêniodeteriora-serapidamentena presençadeluz;assim,asoluçãodeestocagema3% deve serguardadaemumrecipientedeâmbarno escuro. O corantedeLeishmandeestocagémdeveserenvelhe- cido antesdousoguardando-opor 7 diasna temperatu- ra ambienteno escuroseguindo-seincubaçãode35°C a 37°C por 2 diastambémno escuro.A soluçãoenve- lhecidaé estávelpor 1 mêssemantidaemumrecipien- te lacradono escuro. 4. ApÊNDICEVI PreparodeTripsinapara OócitoZona..freedeHamster Diluentetampãodetripsina Cloreto desódio Citrato trisódico Tricina [N-tris(hidroxi-metil)metilglicina] Fenolvermelho Águadestilada 6,0g 2,9g 1,79g 0,005g 1.000ml Mexaos ingredientesatédissolução,ajusteo pH para7,8. Filtre compapeldefiltro n° 1Whatman. Avie e autoclave. Osmolalidade=290nOsmfkg. Tripsinaparaestocagem(2,5%em0,85%(0,14M) NaCl) Soluçõesdetripsinapodemsercompradasno comércio. Alternativamente,parafazerumasolução2,5%em 0,85% N aCI, mexapor 1 hora na temperaturaambienteou10 horasa 4 oCoCasoa tripsinanão sedissolvacompletamen- te,clareieporfiltraçãoempapeldefiltro Whatmann° 1. Esterilizepor filtração,transformeem alíquotase con- servea-20°C. Nota: A tripsinaé disponívelem estadobruto (p. ex., Difco 1:250)oupreparaçõespurificadas(p. ex.,Sigma[3X] recristalizada). ApÊNDICEVII AvaliaçãodosCromossomosdosÓvulos Mórulasoublastocistossãoincubadospor2horasa37°C emmeiodeculturadetecido(TC) 199ao qual foi adicio- nado Colcemid (0,5 g/ml). Então, eles são colocadosem citratode sódio0,9% em tubosde centrífugasiliconizados por 10minutose dissociadoscuidadosamentepor aspiração comumapipetaPasteursiliconizada.Depoisdenova incu- baçãopor10minutos,o tubodeensaioécentrifugadoa 800 rpmpor 5 minutos,e o sobrenadanteremovidoé substituí- do porálcoolacéticofixador. As preparaçõesem estadobruto contêmváriasoutras proteasesquepodemserimportantesna dissociaçãocelular, masquetambémpodemserprejudiciaisparacélulasmais sensíveis.A práticacomuméempregara tripsinaemestado brutoa não serqueo dano celularreduzaa viabilidadeou queocorraumcrescimentoreduzido,quandoentãosedeve usara tripsinapurificada.A tripsinapurapossuiatividade específicamaiore por issodeveserusadaemconcentração proporcionalmentemaisbaixa,p. ex.,0,05%ou 0,01%. Tripsinafosfatoverene(TVP) Tripsina(Difco 1:250) 25mg(ou1ml Fluirou Gibco2,5%) SoJuçãosalinatampão fosfatada(PBS) EDTA dissódico(2 HzO) Sorodepintainho(fluir) 98ml 37mg 1ml Misture PBS e EDTA e autoclave,então,adicioneo sorodepintainhoe a tripsina. Quandoestiverusandotripsinaempó,esterilizeporfil- traçãoantesde adicionaro sorode pintainho. Divida em alíquotase guardea-20°C. As preparaçõessãoguardadasdurantea noite a 4 °C e, apósaremoçãodofixadorporcentrifugação,adicioneácido acéticoaquosoa 45%.As célulasdissociadassãoressuspen- didasem seguidaa umasegundatrocade ácidoacético,e pequenasgotasdasuspensãosãocolocadassobreumalâmi- na devidro aquecidaa 56°C sobreumaplacaaquecedora. As lâminassão,então,coradascomcarbolfucsina. 489 ApÊNDICEVIII Livros/Companhiasde FIV 490 Zygote:TheBiologyofGametesand Early Embryos (Zigoto:A BiologiadosGametas e EmbriõesNovos) Essaobracompreende:.gametogênese; . interação espermatozóide-ovo; . ativaçãodegametas;.polaridadeemoócitose zigotos;.controle do ciclo celular;. interaçõescélula-célula;.geraçãodenovaslinhagenscelulares. A estruturabásicade umembriãoé estabelecida logoapósafertilizaçãoegeralmenteemdiversasdivi- sõesde clivagem.Essa publicaçãocentraliza-sena regulaçãoespacial/temporaldoscomponentescelula- resdentrodo oócito/zigoto,vai da programaçãodas informaçõesemdesenvolvimentodurantea oogêne- se,atravésdesuasmodificaçõesduranteafertilização, atéa integraçãodosprimeirosgenomasembrionários maternos. a. Células espermatogênicashumanas imunorrotuladas paraproacrosinacom 404 mAb (fluorescênciaamarela)e contracoradascombrometodeetídio(fluorescênciaverme- lha). Célulasbinucleadas,provavelmenteumaespermátida gigante arredondada,mostrando imunorreaçãoem duas áreasnão-comunicantesadjacentesacadanúcleo(setas).A maior célula adjacentedo monócito nuclear (acima,à esquerda)não mostraqualquerimunorreaçãoà proacrosina. A escalarepresenta5}.1m. b. Avaliaçãodamaturidademeióticadecélulasespermato- gênicas humanas usando dupla cor FISH com sondas 015Z1 (manchasfluorescentesazul-claras).Os núcleossão contracorados com OAPI (fluorescência azul-escura). Espermatócitosprimários na primeira prófase meiótica mostrandoquatrocópiasde ambasasseqüênciasvisualiza- dasde ONA, correspondentesa doisbivalentes,consistin- do cadaum emduascromátides. c. Célulasdo ovo e outrascélulasderivadasdo tecidoovu- lar deBrassicanapus.Barras= 10}.1m.Célula do ovo in situ (setapreta)emumsacodeembrião(setabranca)apóstrata- mentoparaclarear. CambridgeUniversity Press,North American Branch,40 West 20thStreet,New York, NY 10011-4211,USA. ApÊNDICES 491 In Vitro Fertilizations(FertilizaçãoIn Vitro) BRIAN DALE DiretordepesquisaStazioneZoologia,NáPoles e KAY ELDER Diretordetreinamento,BournHall Clinic, Cambridge D CAMBRIDGE~ UNIVERSITY PRESS 1. Técnicasde microinseminaçãoinclueminjeçãosubzonal(SZI), injeçãointracitoplasmáticade espermatozóides (lCSI), perfuraçãozonal(ZD) edissecçãoparcialzonal(PZD). 2. VariaçõesdefertilizaçãoapósICSI. PN: pronúcleo;CP: corpopolar a.doispronúcleos;doiscorpospolares b. trêspronúcleos;umcorpopolar c. umpronúcleo;doiscorpospolares d. sempron6cleo;umcorpopolar e.clivageminicial 3. Variaçõesnamaturidadedoovoencontradasapóstratamentocomhialaseedissecçãodacorona. a.vesículagerminativa b.metáfaseI c. metáfase11 4. GradientesdedensidadeBoyant. (a-b)duasfasesdegradientesantesedepoisdacentrifugação. c. minigradiente 5. TesteARIC: umapopulaçãodeespermatozóidesésubmetidaaocálcioionóforoA23187erotuladacomlectinafluo- rescenteparaaçúcaresdesuperfícieespecíficos.A áreabrancaindicafluorescência. I. acrossomaintacto 11. reaçãoincompletadoacrossoma 111.reaçãocompletadoacrossoma IV. espermatozóidesmortos V. espermatozóidesanormais 6. Colocaçãodeembriõesdentrodeumacriopalhetaantesdacongelação. 7. Espermatozóidesdentrodeagulhaparamicroinjeçãoantesdainjeção. 8. Pipetasparainjeçãoeconservação. DaleB (1996)In: GregerR, WindhorstU (eds).ComprehensiveHumanPhysiology.SpringerVerlag,Berlin. JohnsonM, EverittB (1990)EssentialReproduction.BlackwellScientificPublications,Oxford. SagataN (1996)Meioticmetaphasearrestin animaloocytes:itsmechanismsandbiologicalsignificance.Trendsin Cell Biology6:22-28. YanagimachiR (1994)MammalianFertilization.In: KnobilE andNeill J (eds).The Physiologyof Reproduction. RavenPress,New York,pp 189-317. (vejaa ilustraçãona Páginaseguinte) 492 ApÊNDICES 1 Q)~ SZI =@= ZD ICSI PZD (aI Nucléolos 2 ;./~ /r~~~~ .~ <b'~ 2 PN, 2" CP Fertilização monospérmica 3 PN, 1"CP Diginiamonospérmica "'0 (e) (d'O rrflG)) ~ Nenhum pronúcleo; 1" CP, Não-fertilizado Pronúcleo único, 1 ou 2 CP, ativado? (conferir novamente mais tarde) 3 w ~~~ ~ .. . Zonapelúcida, t3 Espaço penvltelino Nucleo GV '. ' /"~~ °"'00'00oortlOOI::a Nooloolo~ ' Vesícula germinativa MetáfaseI (GV rompido,CP ainda não extruso) .~ ~rimeirocorpúsculopolar ,. o A",ad, "9,,00100Idad,.00ooplooma Metáfase11,extrusãodo primeirocorpúsculo polar 4 (ai r (b) r I (el [ Clivageminicial 6 Nome, 1 Data, Ciclo NQ, Embrião NQ F3 Local do (~ b '- Arl\oUem nao 7k ~ _20~ aproximadamente- ~, -100" L- 6-71'- ~ :::> ::::> Pipetaparainoculação (dimensõesaproximadas) Pipeta para conservação (dimensões aproximadas) Sêmen 85091>7 95% :5a an Outros/anormais - '( 11 111 IV V ApÊNDICES 493 CASMED INTERNATIONAL LTD Castle House 39Nork Way Banstead, Surrey SM7 1PB Tel no (0)1737 379898 Fax no (0)1737 379890 VAT reg. no. GB676 1951 03 Co Reg. no. 3192716 Marcasmicroscópicaspróximasà extremidadeda agulhaparamelhoraro desempenhoda imagem quandoestiverusandoultra-som .. "'" líquido folicular Visfada extremidadeda agulha Secção mostrandoa direçãodofluido transversal Fabrica também:.Agulhas para coleta de oócitos de ampla variação.Cateterespara IUI e transferênciade embriões.Agulhas para aspiração de cistos.Guias para sondas de ultra-som. Líquidode lavagem A Casmedtemdistribuidoresnamaio- riadospaísesdoOrienteMédioe ficará satisfeitaemfornecerseusnomese endereçosdesdequesolicitados. Contrastede fase(A e E) e Nomarski(B-D e F) EMBRYOTECH LABORATORIE~ me E9323AndoverStreet. Wilmington,MA 01887. USA ~T_I: 508.658.4600 ISi!Fax:508.658.5777 QE-mail: embryoteC@aol.comand/or W_b Sit_: www.embrvotech.com @ EMBRYOTECH'" ApÊNDICE IX Fertilizaçãoln VitroporMicroinjeção Fertilizaçãoinvitropormicroinjeção. 494 ApÊNDICES 495 SEPARAÇÃO ESPERMÁTICA INSTANTÂNEA EM TUBOS DEWANG EN. WANG Estesistemareúneautilizaçãodetubosdeseparaçãorecentementeprojetadose métodosinovadores.Váriosfenômenos biológicose biofísicose princípiosteóricosbásicosforamaplicadosno sistemadeseparaçãoespermáticainstantânea:.Espermatozóidesnão-patológicosnãotransferemmicrorganismos. . O padrãodamotilidadee acapacidadeswimupdeespermatozóidesinfectadosoupatológicossãolimitadosou perturba- dos..Quantomaisrápidaamigraçãoespermáticae maioradistânciavencida,maisnormaissãoosespermatozóides..Espermatozóidesdiferentesdoesperadoparao seuestágiodedesenvolvimentoou aquelescomdistúrbiosmorfológicose fisiológicospodemseridentificadosporalgumascaracterísticas,comovelocidadese distânciasdiferentesdemigração..Espermatozóidesaltamentemóveispodemserseparadosfacilmentedeoutrascélulasvivas,comoleucócitos,célulasver- melhasdo sangue,linfócitose restoscelulares..O meiodeculturadetecidospossuibaixaviscosidade,quenãofavoreceaaderênciadosmicrorganismosaosespermato- zóidesextremamentemóveis..A gravidadeespecíficadeumpelletespermáticoé maiorquea do meiodeculturade tecidos,de modoqueo pelletcai rapidamenteparao fundodo tubodeWang,permitindoa migraçãodosespermatozóidesmóveis..A velocidadee a direçãodamigraçãoespermáticasãobastantediferentesdosmovimentosaleatóriospassivosou ativos dosmicrorganismos. . O sistematubulardeWang é umatécnicamultidirecionaldedesafio/migração(MCM). Ela não é apenasumasimples técnicadeswimup.Aos espermatozóidesépermitidomigraremmúltiplasdireções,passandoatravésdecurvaturascom ânguloscríticos,cuidadosamenteprojetadase computadorizada8.O desafioefetuadofacilita a seleçãode espermatozói- desdealtaqualidade. . EssasfórmulasforambaseadasnasteoriasdaequaçãodeBernoullie na aplicaçãodahidrodinâmica. F.N. WANG SEPARAÇÃO ESPERMÁTICA INSTANTÂNEA (TempoReal) REVISÃO DOSTUBOS DEWANG E TECNOLOGIAS RELACIONADAS ARCHIVES OF ANDROLOGY, 34:13-32(1995) o pacienteé periodica- menteintectado não 60 M/ml 6' I 60%móveis 60% moriologicamente normais Sim(1) < 63 <:63 Oligozoospermia Astenozoospermia Teratospermia Normospermia <:3ml um M3 dois M3 <3 ml IVF(2)um 82 IUAI um 82 <:3ml um M2 dois M2 <3 ml um 81/82 dois M2 ;,3 ml um M1/M2 dois M1/M2 (1) N. deWBC maiordo que6 emsêmenín naturasobcampode altopoder. (2)A seleçãodotubodeWangparaGIFT.ZIFT ouTET é IdênticaàquelaparaFIV. (3) São sugeridosmaistubosdeWangparamaispreparaçõesespermáticas. Seleção do tubo de Wangcorreto. 496 ApÊNDICES y '11- ~x1 6cm ~ B 18) y 6cm _",\,1'o-, Ibl y 911~ I '. 4!+-x t- 6cm D 0\ 6em 'I ~I , ,. .~/ '," , . -,'.' "'.., 11 P A ~I- ~10 E }:::I p Microscópio 'fiF"" ~ ~~~:::~roCamada 1 - ":",,,:,,',h'_.:.C', G , f]] I:.' ':" ;! '111 lUA) G> IVF.ET &J GIFT @ ô <5 A: Tubo de Wang padrão (vista frontal). Posição em pé com um braço lateral com 6 em de comprimento e inclinação de 90°. B: Tubo de Wang oblíquo (vista fronto-ventral): (a) com um braço lateral com inclinação de 30°, (b) com inclinação de 45°, c: Tubo de Wang complexo (vista frontal). Posição superior em pé com quatro lentes convexas em simetria com aquelas da parede do fundo e duas hastes adicionais ligadas à parede anterior do componente inferior do tubo. D: Meio de cultura de tecido é colocado em um tubo de Wang com uma pipeta Pasteur longa. E: A suspensãode espermatozóides é injetada dentro do tubo de Wang. F: Depois da incubação, o meio de cultura de tecido dentro do tubo de Wang fica em três camadas distintas: a camada 1 é acentuadamen- te turva, a camada 2 é turva e a camada 3 é clara e contém espermatozóides de muito boa qualidade. A imagem dos espermatozóides em migração e os parâmetros espermáticos podem ser checados diretamente com microscópio antes da coleta. G: Espermatozóides de alta qualidade são coletados do tubo de Wang. Pressionando-se o braço lateral, o tubo de Wang é cortado. H: Espermatozóides de alta qualidade são liberados do braço lateral do tubo de Wang comprimindo a rolha de silicone com o dedo pole- gar e o indicador. I: O tubo de Wang, a rolha de silicone e o meio de cultura de tecido são colocados na incubadora antes dos tubos serem preenchidos com o meio de cultura de tecido. VIVO Sem reação Com reação MORTO Sem reação Com reação ApÊNDICES 497 6CM 1 D, 3Ó~5 (Acima) Análise espermáticaassistidapor computadorHamilton-Thorn (CASA) aplicadoparadiferenciarespermatozóidescome sem reaçãoe vivose mortos. (Abaixo)SistemadetubodeWangparaseparaçãode espermatozóidesparaFIV. 498 ApÊNDICES Avaliaçãodeexperimentoscomculturadecélulasusandoa técnicadefluorescência. ~- Espermatozóides congelados-desconqelados Lavagem com solução de Pereol! (500 g 10 minutos) 2 mlde sêmen 2 mlde Pereol!30% / Culturapor28 horasa 39°C 2 mlde Pereol!45% emineUbado { rade CO2 Aglomerado de TCM-199 + es ermatozóide, , Gonadotrofinas OMelO Oestradiol Pré-ineubaçãopor6-8 horasa 39°C10%FCS emincubadorade CO2(3 milhõesml-1) . Dóollo,ma'"""(1Q-15i "'p"'m,""óld~','.-. I capacitados~ Inseminação (10 milhões de espermatozóides ml-1) ApÊNDICES 499 Sistemadefertilizaçãoinvitro(Universidadede Kyoto)parabovinos.(Iritanie colaboradores.) (CortesiadoProfessorlritani.) Os númerosde páginasem itálicoindicam figuras; os números seguidospor um t indicamtabelas. Abortamento,269 (vertambémemanimal específico) causasinfecciosas,270-274 embovinos,270-271,271t emeqüinos,272,273t emovinose caprinos,271,272t emsuínos,272,273t causasnão-infecciosas,267-270,270t embovinos,270-271 emeqüinos,272 emovinose caprinos,271,273 emsuínos,272 toxinasdeplantasqueprovocam,334- 335,336t,339 Abortamentoenzoóticoemovelhas (EAE),271 Abortamentoepizoóticobovino (EBA), 271 Acasalamento,295-296(vertambémem animalespecífico) padrões,297t Acrosina, 114-115 Acrossomo,97 grânulopersistente,knobbed,312 reaçãodo,na fertilização,114t,117 seqüênciadeeventos,121 Adeno-hipófise,hormônios,38-39 Alfatoxinas,338 Alpacas,219 abortamentoinduzido,226 anatomia,reprodução fêmea,219 macho,228-230 capacidadereprodutiva,229-230 colheitadesêmen,229-230,231 comparaçãodostratosreprodutivos femininosde Ihamas,220t comportamentosexual fêmeas,224 machos,229-230 desenvolvimentofolic'ular,220-222 estaçãosexualde fêmeas,219-220 machos,229-230 falhasreprodutivas,226-227,231-232 abortamento,228-229 defeitoscongênitose adquiridos, 226-227,231-232 descidatesticularretardada,231,232 endometrite,226-227 mucometra,228 perdaembrionária,228 perdafetal,228 piometra,228 priapismo,232-233 fertilizaçãoin vitro,233-234 funçãodo corpolúteo,223-224 gêmeos,228-229 gestação,224 diagnóstico,225-226 inseminaçãoartificial,232-233 níveisdeprogesteronaemfêmeasapós a cobertura,228t níveisde testosterona,duranteo ano, 23lt ovulação,222-223 parto,226 produçãoe característicasdo sêmen, 230-232 puberdade fêmeas,219 machos,228-230 puerpério,226 transferênciaembrionária,232-234 Amamentação,supressãodaciclicidade, 153,155 Amamentação/mamadas(vertambém Gestação) comportamentomaterno,301-302 estropós-partoe ovulação,62 Anáfaselag,309 Análise espermáticaassistidaporcom- putador(CASA), 497 atividadeespermicida,455-458,460 motilidadeespermática,373,374,453 Anatomia dareprodução fêmea,13,14-15(vertambémemanimal específico) cérvixuterina,24-27 comparada,22 diferenciaçãoembrionária,13,14 genitália,externa,28 histologiafuncional,16t infecção,morfologiadascélulas ciliadas, 19 ovários,13-17 ovidutos,17-21 sistemaimune,componentes, 349-350 ultra-estrutura,25 / INDICE útero,21-24 vagina,27-28 macho,3 (vertambémemanimal específico) descidadostestículos,4-5 desenvolvimento,3-6, 5t diferenciaçãoembrionária,14 epidídimose ductosdeferentes,7 glândulasacessórias,8-10 anatomiacomparativa,8-9,9 função,9-10 pênise prepúcio,10-11 testículoseescroto,5-7 Andrógeno ligadoa proteína,47-48, 104-105 Androgenones,123 Andrógenos,42-43,105-106 Anéis anulares,25 Anestro, 261-262 causas,263 Aneuploidia,309 Animais delaboratório característicasseminais,11t transgênicos,320-321 microinjeçãodeDNA, 320-324 tecnologiada célula-tronco embrionária,323-325 transferênciagênicamediadapor retrovírus,324 Animais transgênicos(vertambém Engenhariagenética) aplicaçãoe uso,320t,320-321 definição,320-321 desenvolvimento,319 metodologiausadaemtransferência de genes,320t quadrocronológico,320t produçãode domésticos,324-328 biorreatoresanimais,325-326 construçãodegenes,325-326 metodologia,324-326 microinjeçãodeDNA, 322 modelosruminantes,326-328 modelossuínos,325-327,327t tratosdeprodutividade,326 visãogeral,324-325 produçãoemlaboratório,320-325 microinjeçãodeDNA, 320-324 outrastecnologias,324-325 tecnologiade célula-tronco embrionária,323-325 transferênciadegenesmediadapor 501
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