ENZIMAS APRESENTAÇÃO - COMPLETA

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parâmetros cinéticos de reações catalisadas por enzimas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
FÍSICO-QUÍMICA EXPERIMENTAL – QMC5411
PROFESSORA: VERA LÚCIA AZZOLIN FRESCURA BASCUNAN
 ACADÊMICOS: AMANDA GODOI DE CÓRDOVA, ISADORA BRAUN 
HÁGATA SUSAN CRUZ, NATHÁLYA MATOS SALVADOR 
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OBJETIVOS
 
Acompanhar um processo reacional por espectrofotometria. Determinar os parâmetros cinéticos de reações catalisadas por enzimas.
 
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MATERIAIS
Reagentes: solução de catecol 0,05 mol L-1 ; 1/2 batata descascada; água oxigenada comercial (~10 %).
Vidraria: 10 cubetas para espectrofotômetro; 1 porta-cubetas; 1 pipeta graduada de 5 mL; 1 pipeta graduada de 0,2 mL; 1 pipeta Pasteur; 1 béquer pequeno para guardar o extrato da batata.
Equipamentos: 1 termostato; 1 espectrofotômetro.
Outros: papel filtro; funil de vidro; 1 proveta pequena; 1 espremedor de batatas; 1 gral de porcelana para o banho de gelo; 1 faca para legumes
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PARTE EXPERIMENTAL 
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Procedimento
O termostato foi ligado à 25ºC; 
 Após, ligou-se o espectrofotômetro e foi colocado uma cubeta com água no suporte de amostra do aparelho e acertado o zero da absorvância no comprimento de onda (max) de 458 nm. 
Preparou-se 100 ml de catecol 0,05 mol L-1
 Preparou-se também um extrato de batata amassando meia batata descascada. Este foi filtrado o amassado com papel-filtro recolhendo o líquido diretamente numa proveta pequena em banho de gelo. Foi mantido este filtrado em banho de gelo durante todo o experimento.
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Procedimento
 Colocamos 0,5 mL de catecol 0,05 mol L-1 + 2,5 mL de água na cubeta, 
Depois colocamos a cubeta no suporte de amostra do espectrofotômetro e deixamos termostatizar por 5 minutos. Retiramos a cubeta do espectrofotômetro adicionamos 1 gota de H2O2 comercial e, agindo com rapidez, adicionamos 0,1 mL de extrato de batata, colocamos a tampa na cubeta e agitamos suavemente a solução. Colocamos a cubeta no aparelho e fizemos a primeira leitura de absorbância (Ao), disparando imediatamente o cronômetro.
Foram feitas leituras de 20 em 20 segundos durante cerca de 4 a 5 minutos. 
 Repetimos variando as quantidades de catecol para 0,75; 1,0; 1,25 ; 1,5 mL, sempre completando o volume final na cubeta com água até 3,0 mL 
Repetimos o experimento na temperatura de 35ºC e ao final do experimento deixamos a solução da última leitura de (A ) no espectrofotômetro e fizemos um espectro do produto final.
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ENZIMAS
Enzimas são grupos de substâncias orgânicas de natureza normalmente proteica com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras, catalisando reações químicas que, sem a sua presença, dificilmente aconteceriam. Isso é conseguido através do abaixamento da energia de ativação necessária para que se dê uma reação química, resultando no aumento da velocidade da reação e possibilitando o metabolismo dos seres vivos.
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Efeito das enzimas na energia de ativação
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ENZIMAS
Fatores que influenciam a atividade catalítica das enzimas:
- concentração enzimática
- temperatura
- concentração do substrato
- pH
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 Efeito do pH em uma reação enzimática
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ENZIMAS
Fatores que influenciam na velocidade da reação:
- concentração da enzima
- concentração do substrato
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ENZIMAS 
Na indústria de alimentos:
- São catalisadores de uso consagrado, sendo específicas para cada substrato. A Renina (quimosina) foi a precursora, sendo aprovada pelo FDA em 1991.
- Principais exemplos: glucoseoxidase, hidrolases, oxiredutases, lipoxigenase, alfa-amilase, beta-amilase, invertase, isomerases, carboidralases. 
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ENZIMAS
Enzimas podem substituir aditivos químicos pois:
- são naturais
- não alteram as propriedades dos alimentos
- preservam o ambiente
- não influenciam a saúde do consumidor
- possuem maior segurança no processamento
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Equação de Michaelis-Menten
Propuseram que as reações catalisadas por enzimas ocorrem em duas etapas: a enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reação.
RAPIDA		LENTA
v1 = k1 [E] [S]
v2 = k2 [ES]
v3 = k3 [ES]
A concentração total da enzima é: [ET] = [E] + [ES]
Tratamento de dados 
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TRATAMENTO DE DADOS
4.1 Calcule as concentrações de catecol (substrato) usadas no experimento, ou seja, as concentrações finais dentro da cubeta. 
Utilizando a equação M1V1 = M2V2, temos:
Solução 1: 0,05x0,50 = M₂x3,0 C=0,0083 mol/L
Solução 2: 0,05x0,75 = M₂x3,0 C=0,0125 mol/L
Solução 3: 0,05x1,00 = M₂x3,0 C=0,0167 mol/L
Solução 4: 0,05x1,25 = M₂x3,0 C=0,0208 mol/L
Solução 5: 0,05x1,50 = M₂x3,0 C=0,0250 mol/L
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E utilizando a equação C = (At - A0 / A∞ - A0 ) . C0, obtemos os seguintes valores:
Valores calculados da Concentração de acordo com o tempo para T = 25° C
t (s)
C1
C2
C3
C4
C5
0
0
0
0
0
0
20
1,08
2,83
2,70
8,25
1,10
40
1,64
4,05
4,75
1,06
1,30
60
2,18
5,08
6,41
1,24
1,58
80
2.59
5,95
7,61
1,37
1,73
100
3,01
6,67
8,92
1,48
1,84
120
3,33
8,26
9,81
1,56
1,92
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Valores calculados da Concentração de acordo com o tempo para T = 35° C
t (s)
C1
C2
C3
C4
C5
0
0
0
0
0
0
20
2,65
4,82
9,45
1,32
1,28
40
3,64
6,52
1,15
1,59
1,93
60
4,46
7,97
1,28
1,73
2,09
80
5,17
8,99
1,37
1,82
2,20
100
5,76
9,74
1,43
1,88
2,25
120
6,16
1,02
1,47
1,90
2,28
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4.2. Calcule a velocidade inicial (Vo) para todas as corridas cinéticas, fazendo um gráfico de concentração versus tempo. 
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Vo é obtido a partir do coeficiente angular (tangente do ângulo de inclinação) da porção linear dos gráficos concentração versus tempo. 
 Vo = Δy/ Δx = C₂-C/t₂-t
Utilizando-se apenas os dois primeiros pontos o resultado segue na tabela. Para 25°C e 35°C.
A
ΔCo
Vo
1
1,08 x 10-3
5,40 x 10-5
2
2,83 x 10-3
1,41 x 10-4
3
2,70 x 10-3
1,35 x 10-4
4
8,25 x 10-3
4,12 x 10-4
5
1,10 x 10-2
5,5 x 10-4
A
ΔCo
Vo
1
2,65 x 10-3
1,32 x 10-4
2
4,82 x 10-3
2,41 x 10-4
3
9,45 x 10-3
4,72 x 10-4
4
1,32 x 10-2
6,60 x 10-4
5
1,28 x 10-2
6,40 x 10-4
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4.3. Calcule KM e Vmax para a enzima, nas duas temperaturas adotadas, como mostrado na Figura 2. 
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4.4. Leia o item 2.2 d) do Atkins, Volume 3, pág 35 e, usando o método das velocidades iniciais, aplique seus dados para determinar a “ordem” parcial da reação que você estudou. Qual foi o valor encontrado? 
 Para determinarmos a lei de velocidade podemos usar o método de isolamento, que consiste em considerar que todos, exceto um, dos reagentes estão em excesso, assim podemos considerá-los constantes e portanto igual à concentração inicial dos mesmos. Assim, a verdadeira lei assumiu forma de primeira ordem (pseudoprimeira ordem) . Podemos então, achar a dependência entre a velocidade e concentração de cada um e chegando, no final, à lei de velocidade geral.
O método das velocidades iniciais, é muitas vezes acoplado ao método do isolamento, portanto imaginamos que a lei de velocidade inicial , v0, é dada por v0= k [A 0]a com o A 0 isolado e , fazendo logaritmo dos dois lados da equação temos: Ln v0 = Ln k + a Ln [A 0]a
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Portanto, usando a equação do slide anterior podemos construir o gráfico:
4.5. Um outro modo de verificar a ordem da reação é fazendo uma representação gráfica do ln da concentração versus tempo. Se linearizar são grandes as chances de que o processo estudado seja de primeira ordem. Neste caso, de “pseudo”-primeira ordem (por que?). Considerando que (A¥ - At) ~ [Catecol], (onde A¥ e At são as absorvâncias no tempo infinito e no tempo t, respectivamente) faça um gráfico de ln (A¥ - At) x tempo e confirme (ou não) a ordem da reação. 
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4.6. A representação especificada acima permite calcular, usando o valor do coeficiente angular, a constante de velocidade observada da reação na temperatura estudada. Faça isso para duas temperaturas e determine o valor da Energia de Ativação da reação usando a relação
de Arrhenius.
Equação da reta da Amostra 1
para T = 25ºC:
y = A + Bx
y = 0,241 - 0,0041x
ln[A] = ln[Ao] – kt
k1 = - 0,0041
 
Equação da reta da Amostra 1 para T = 35ºC:
y = A + Bx
y = - 0,791 – 0,0097x
ln[A] = ln[Ao] – kt
k2 = - 0,0097
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Relação de Arrhenius:
ln k1/k2 = (Ea/R) [1/T2 – 1/T1]
ln (-0,0041/-0,0097) = (Ea/R) (1/298 – 1/308)
-0,861138911 = (Ea/1,987) (1,089514512 x 10-4)
Ea = - 15705,00435 = - 1,57 x 104 
4.7 Faça um espectro de absorção vs. comprimento de onda (l) do produto da reação e discuta porque as cinéticas foram acompanhadas em 458 mn
QUESTIONÁRIO
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6.1. Leia o item e, pág. 47, Volume 3 do Atkins, 6a. Edição e, a partir do mecanismo proposto no Esquema 1, deduza a lei de velocidade representada pela Equação 1.
 
 k1 [E][S]
 [ES] = -------------- (1)
 K2 + k3
[E] = concentração da enzima livre 
 [E]0 = concentração total da enzima ; portanto:
 [E]0 = [E]+[ES] (2)
 
Substituindo (2) em (1):
 k1 ([E]0 – [ES] )[S]
 [ES] = -------------------------- 
 K2 + k3
 k1 [E]0 [S]
 [ES] = ------------------------ 
 k2 + k3 + k1[S]
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Portanto a Velocidade de formação do produto é:
 
 d[P] k3 [E]0[S] d[P] Vmáx [S]
 ------ = ------------- ou então ------ = V0= ------------
 dt kM + [S]	 dt kM + [S]
6.2. Por que a velocidade aumenta com a concentração do substrato?
 E se aumentássemos mais ainda a concentração do substrato, o que aconteceria com a velocidade?
 O aumento da concentração do substrato faz com que se tenha uma maior quantidade de partículas ou moléculas confinadas num mesmo espaço. Isso aumenta a quantidade de choques entre elas e aumenta também a probabilidade de ocorrerem colisões eficazes que resultem na ocorrência da reação.
 Em concentrações de substrato muito baixas, a velocidade inicial de reação é quase proporcional à concentração da concentração do substrato. Entretanto, a proporção que a concentração do substrato aumenta, a taxa inicial passa a crescer menos. Com o posterior aumento na concentração do substrato, a taxa de reação torna-se essencialmente independente da concentração do substrato e aproxima-se assintoticamente a uma taxa constante.
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6.3. O que faz as enzimas tão eficientes?
Aumento da concentração dos reagentes na superfície da enzima
Orientação correta do substrato
Aumento da reatividade dos reagentes
Indução da deformação física do substrato
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6.4. Porque a reação foi acompanhada a 458 nm e não em outro ? 
 A polifenoloxidase é uma enzima do grupo de oxidação e redução que catalisa a remoção do hidrogênio de polifenóis (no presente experimento, o catecol) passando-o para o oxigênio molecular, formando água e as quinonas correspondentes:
  A enzima a ser utilizada neste experimento será extraída de uma batata. Para acompanhar a reação será usada a espectrofotometria, uma vez que a orto-benzoquinona absorve fortemente na região em torno de 458 nm. 	 
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6.5. Qual a definição e o significado de KM e Vmax? O que
tornaria o valor de KM maior? Ou menor? Como a medida
do valor de KM pode ajudar na interpretação do
mecanismo? 
Vmax é a velocidade máxima da enzima, este valor não pode ser aumentado pois neste estado a enzima já esta com todos os seus sítios ocupados. Para aumentar a velocidade da enzima a partir dai, só aumentando sua quantidade.
Km é o valor da concentração que corresponde a metade de Vmax no gráfico concentração do substrato versus velocidade da catalise. Ele indica a afinidade da enzima pelo substrato. Quanto menor o Km, maior é a afinidade entre os dois.
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6.6. A concentração da enzima interfere no resultado? 
 As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Elas aceleram a velocidade de uma reação por diminuir a ENERGIA LIVRE DE ATIVAÇÃO da mesma, sem alterar a termodinâmica da reação, ou seja, A energia dos reagentes e produtos da reação enzimática e de sua equivalente não enzimática são idênticas.
A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação.
Uma reação enzimática pode ser expressa pela seguinte equação:
E + S <==> [ES] ==> E + P
A velocidade de uma reação enzimática depende das concentrações de ENZIMA e de SUBSTRATO.
As enzimas atuam oferecendo para os substratos um local para aderirem e é onde a reação irá ocorrer. o lugar adequado para o encaixe das moléculas reagentes é o centro ativo da enzima.
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A concentração da água oxigenada interfere no resultado? Por que colocamos água oxigenada? 
Se adicionarmos um pedaço de batata à água oxigenada, veremos que a decomposição dessa substância é acelerada, provando que há a presença da enzima catalase na batata.
A catalase é uma enzima (tipo de proteína que acelera reações) produzida pelos animais, vegetais e bactérias, também pode ser chamada de hidroperoxidase. É intracelular, está ligada ao processo de decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2 = água oxigenada).
Resumindo, a concentração da água oxigenada interfere sim na reação, pois a enzima catalase utilizada neste experimento será extraída da batata. E para obter a catalase depende da concentração de água oxigenada, já que para a catálise da água oxigenada, é necessário que a enzima se junte à h2o2.
A temperatura interfere? De que modo? 
Sabe-se que a velocidade das reações químicas aumenta com a elevação da temperatura. Todavia, nas reações catalisadas por enzimas, a velocidade tende a diminuir quando a temperatura passa de 35 °C ou 40 °C. Isso ocorre porque, em temperaturas elevadas, alteram-se as estruturas secundária e terciária da enzima, afetando a sua configuração espacial. Como a ligação da enzima ao substrato depende da forma da molécula da enzima (mecanismo "chave-e-fechadura"), se a mesma for alterada, conseqüentemente a função também será.
Em temperaturas superiores a 70 °C, as reações enzimáticas geralmente cessam, pois habitualmente ocorre desnaturação completa e irreversível da maioria das enzimas.
Existe uma temperatura na qual a atividade da enzima é máxima. É a temperatura ótima de ação da enzima.
6.7. Qual a diferença entre a constante de velocidade observada para uma cinética não catalisada e para uma cinética catalisada pela enzima? 
	A velocidade de uma reação aumenta porque o catalisador fornece um caminho alternativo entre reagentes e produtos. Esse novo caminho tem energia de ativação mais baixa do que o caminho original à mesma temperatura. Ele aumenta a velocidade de uma reação química sem ser consumido durante a reação. 
	O catalisador não afeta a composição do equilíbrio de uma mistura reacional. Ele pode acelerar a velocidade com que uma reação atinge o equilíbrio, mas não afeta a composição do equilíbrio, pois ambas as reações, direta e inversa são aceleradas no caminho catalisado, o que deixa a constante de equilíbrio inalterada. 
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6.8. O que é inibidor enzimático, quais os tipos de inibição e os principais fatores que diminuem a atividade de uma enzima? Qual a influência da temperatura sobre a reação enzimática?
Existem dois tipos de inibidores, os irreversíveis e os reversíveis. 
Os irreversíveis ligam-se a enzima irreversivelmente, inativando a enzima pelo resto de sua vida útil.
Os reversíveis dividem-se em dois grupos, competitivos e nao-competitivos. 
 Os competitivos se ligam a enzima no mesmo sitio ativo de seu substrato e pode ser revertido pelo aumento do próprio substrato. Estes não afetam a Vmax, somente o Km. 
 Já os nao-competitivos não se ligam ao mesmo sitio do substrato, ou seja,
eles diminuem a Vmax, mas não alteram o Km.
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6.8.1. Qual a influência da temperatura sobre a reação enzimática?
DESNATURAÇÃO PROTEICA. As enzimas, como proteínas, estão sujeitas a esse processo, que pode ocasionar a perda de atividade. 
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52
Obrigada!
54
OH
OH
+
O
2
O
O
2 H
2
O
+
enzima
catecol

-benzoquinona