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NUTRIÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA @larirodrigues.b 1 Eletroforese dos ácidos nucleicos em gel de agarose Uma das técnicas mais fundamentais em laboratórios de pesquisa e diagnóstico. Princípio da técnica é baseada na Lei de Coulomb de atração e repulsão das cargas elétricas. Em pH neutro/ alcalino, o fosfatos do DNA e RNA, ficam desprotonados e portanto, negativos. Quando submerso em uma matriz porosa de gel em que é submetido a um campo elétrico de pólos opostos onde as moléculas migram em direção ao pólo positivo (ânodo). A separação das moléculas é realizada pelo tamanho que elas apresentam. Matriz: Agarose e Poliacrilamida AGAROSE: polímero sintético não tóxico. Permite a separação de moléculas de tamanhos variáveis – 0,2Kb a 50Kb (1Kb = 1000 pb – par de bases); POLIACRILAMIDA: polímero sintético de componentes tóxicos. Permite a separação de moléculas menores que 1Kb. Existe uma porcentagem proporcional da quantidade de polímeros na hora do preparo que vai determinar o tamanho dos poros. Gel de agarose Não é tóxico; Rápida polimerização; Pode ser reutilizado algumas vezes; Método analítico ou preparativo (purificação de DNA); Utiliza o Brometo de Etídio como corante que é mutagênico; Precisa ser revelado em câmera de luz UV. Preparar gel de agarose 0,8%; Conhecer os fatores que afetam a eletroforese em gel de agarose; Analisar o padrão de bandeamento em função dos ácidos nucléicos presentes na amostra. Preparo do gel de agarose 1. Pese 0.4 g de agarose em um erlenmeyer de 125 mL; 2. Adicione 50 ml de tampão TBE 1X. Misture; Introdução sol state Initial gel final gel structure ≈ 45°C ≈ 100°C ≈ 100°C ageing pore double helix Objetivos Material Procedimentos NUTRIÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA @larirodrigues.b 2 3. Aqueça em microondas até que a agarose se dissolva por completo; 4. Deixe a preparação esfriar até 45°C. Em seguida, verta em bandeja de acrílico contendo o pente desejado. OBS: Para a correta formação das canaletas, o pente não pode tocar o fundo da bandeja; 5. Esperar por aproximados 20 a 30 minutos até que o gel solidifique. Retire o pente com cuidado para não danificar as canaletas. Aplicação da amostra de DNA 1. Coloque 3μL de cada amostra de DNA em microtubos limpos separados (DNA genômico de salmão e DNA do Vírus Lambda); 2. Adicione 3μL tampão de carregamento da amostra (TA) – tem uma coloração que permite a visualização da corrida no gel de agarose; 3. Adicione 4μL água deionizada a cada tubo. Misture com auxílio da ponteira; 4. Aplique as amostras nas canaletas, de tal forma que cada canaleta receba uma amostra de DNA; 5. Cubra o gel com TBE 1 X (permite que a corrente elétrica passe e a corrida aconteça) até que ele esteja totalmente submerso; 6. Tampe a cuba de eletroforese. Ajuste a fonte para a voltagem desejada (80V). Coloração da amostra com brometo de etídeo 1. Desligue a fonte após a corrida. O azul de bromofenol presente no tampão de carregamento deve estar a 2 cm da extremidade do gel de agarose; 2. Retire o gel de agarose e coloque-o em uma bandeja de plástico; 3. Adicione 20μl de brometo de etídeo. Tampe a bandeja. OBS: Use luvas ao manusear o brometo, pois ele é mutagênico; 4. Agite por 20 minutos. Retire o gel com cuidado e coloque-o sobre o transiluminador. Abaixe a proteção de acrílico e somente depois ligue a luz UV; 5. Analise os resultados. Tampão concentrado Água destilada Cuidado! O frasco estará quente. Despejar ESPERAR Aula Prática NUTRIÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA @larirodrigues.b 3
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