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Para ser um bom marcador molecular tem que preencher 
determinados parâmetros: 
1) Polimorfismo (a matéria prima de um geneticista é a 
variabilidade); 
2) Co-dominância (as diferentes formas de um marcador devem 
ser detectáveis em organismos diploídes de modo a distinguir os 
homozigóticos dos heterozigóticos); 
3) Não epistático (o seu genótipo pode ser lido a partir do fenótipo, 
qualquer que seja o genótipo nos outros loci); 
4) Distribuição uniforme ao longo do genoma, detecção fácil, 
rápida e pouco dispendiosa; 
5) Insensível ao meio (o genótipo pode ser deduzido do fenótipo, 
qualquer que seja o meio)
Uma das características fundamentais de um bom marcador 
molecular é a sua reprodutibilidade intra e inter laboratórios.
Figura 10 – Representação esquemática dos quatro passos em que consiste a análise de RFLP (adaptado de: www.scq.ubc.ca).
Tecido vegetal
Extracção de DNA Clivagem do DNA com enzimas de restrição
Separação dos fragmentos de DNA 
por electroforese
Southern Blot
Hibridação
Eliminaçãoda hibridação inespecífica
Película detectora dos fragmentos 
padrão
Análise de fragmentos
RFLP de DNA total
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Esquema PCR
Marcadores de 
primers 
arbitrários 
Marcadores 
STS 
(Sequence 
tagged sites)
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RAPDs - Random Amplified Polymorphic DNA
Esta técnica foi descrita em 1990 por uma equipa da DuPont 
Co. (Williams et al., 1990), que a denominou de RAPD.
É um processo de análise simples que requer uma simples 
reacção de PCR (com baixas temperaturas de annealing, p.e. 
35ºC) e primers curtos (10 oligonucleótidos) de sequência e 
arbitrária, que se ligam ao DNA molde em direcções 
convergentes.
A amplificação destes fragmentos de DNA genómico irá estar 
na base da detecção de polimorfismos, que posteriormente 
serão de fácil identificação através de uma separação 
electroforética. 
Cada primer pode amplificar em simultâneo vários loci ao 
longo do genoma e originar fragmentos de tamanhos variados. 
Primer
Molécula de DNA
Fragmentos amplificados
Separação electroforética
Figura 12 – Representação esquemática do princípio da análise genética por RAPD (adaptado de: (Vicent and Fulton, 2003).
RAPD – exemplificação da técnica
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AP-PCR – Arbitrary Primed Polimerase Chain Reaction
Tendo como base a tecnologia de RAPD, Welsh e McClelland 
(1990) desenvolveram uma derivada desta análise, cujo 
objectivo era obter impressões genéticas de indivíduos 
(fingerprinting). 
Esta técnica difere da anterior, uma vez que usa primers com 
20 ou mais bases (p.e. primer M13 de sequência universal) e os 
dois primeiros ciclo da amplificação ocorrem a baixas 
temperaturas (com elevadas concentrações de primers), 
seguidos de 35 a 40 ciclos com temperaturas elevadas (com 
adição de nucleótidos marcados radioactivamente). 
DAF – DNA Amplification Fingerprinting
Em semelhança à tecnologia anterior, esta análise também é uma 
derivada de RAPD. Desenvolvida por Caetano-Anollés et al. 
(1991), engloba o uso de primers muito pequenos (p.e. 5 a 8 
bases) em elevadas concentrações.
Estas duas últimas tecnologias, surgem como uma alternativa à 
tecnologia RAPD, no entanto apresentam-se com um maior grau 
de complexidade na sua aplicação e análise.
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ISSRs (Inter simple sequence repeats)
Descritos por Zietkiewicz et al. (1994), baseiam-se na 
amplificação das regiões que se localizam entre as regiões 
SSR. 
É realizada uma reacção de amplificação, cujos primers
são baseados nas repetições SSRs (microssatélites) e 
podem ser apresentadas em várias metodologias: 1) 
amplificação com apenas um primer; 2) amplificação com 
dois primers de características similares em simultâneo; 3) 
combinação entre um primer ISSR e um primer de 
sequência arbitrária (p.e. RAPD). 
Em contrapartida, é um marcador dominante, o que por 
vezes limita a sua aplicação. 
NN(CA)n
(CA)nNN
Repetição CA
NN(CA)n
(CA)nNN
Repetição CA
DNA Genómico
Produto de PCR amplificado com o primer (CA)nNN
Produto de PCR amplificado com o primer NN(CA)n
ISSR – exemplificação da técnica
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Isolado Origem geográfica
4,74CT1 Rabal (área não-ultramáfica)
4,28CT5 Rabal (área não-ultramáfica)
7,43MT5 Morais (área ultramáfica)
2,17MT5 Morais (área ultramáfica)
7,47MT5 Morais (área ultramáfica)
5,37MT5 Morais (área ultramáfica)
1,19MT9 Morais (área ultramáfica)
7,15MT5 Morais (área ultramáfica)
6,19MT5 Morais (área ultramáfica)
Identificação e origem geográfica dos isolados de Cenococcum geophilum. T1: tipo
morfológico 1; T5: tipo morfológico 5; T9: tipo morfológico 9. Cada isolado foi
identificado de acordo com a seguinte nomenclatura: n.º do esclerócio x, da caixa de
Petri x, colhido do solo da árvore x, da área seleccionada, Morais (M) – área
ultramáfica ou Rabal (C) – área não-ultramáfica (controlo), pertencendo ao tipo
morfológico x.
Padrões de bandas obtidos por PCR com o primer (GATA)4 nos isolados de Cenococcum 
geophilum em gel de agarose (1,5 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1; 
4,28CT5; 7,43MT5; 2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas 
1-9 respectivamente. Controlo, linha 10. Marcador 100 bp, linha M.
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Padrões de bandas obtidos por PCR com o primer (GTG)5 nos isolados de Cenococcum
geophilum em gel de agarose (1,5 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1;
4,28CT5; 7,43MT5; 2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas
1-9 respectivamente. Controlo, linha 10. Marcador 100 bp, linha M.
Padrões de bandas obtidos por PCR com o primer (GGAT)4 nos isolados de Cenococcum
geophilum em gel de agarose (1,5 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1;
4,28CT5; 7,43MT5; 2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas
1-9 respectivamente. Controlo, linha 10. Marcador 100 bp, linha M.
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Padrões de bandas obtidos por PCR com o primer (TCC)5 nos isolados de Cenococcum
geophilum em gel de agarose (1,5 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1;
4,28CT5; 7,43MT5; 2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas
1-9 respectivamente. Controlo, linha 10. Marcador 100 bp, linha M.
Padrões de bandas obtidos por PCR com o primer (GA)8 nos isolados de Cenococcum
geophilum em gel de agarose (1,5 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1;
4,28CT5; 7,43MT5; 2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas
1-9 respectivamente. Controlo, linha 10. Marcador 100 bp, linha M.
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Clusters resultantes da análise UPGMA com base em todos os dados fornecidos pelos
primers de microsatélites, evidenciando a separação entre os três tipos morfológicos, e
dentro do tipo 5, o agrupamento entre os isolados 7M.
SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
Este tipo de marcador resulta da conversão das bandas de 
RAPD, por exemplo. Uma marca SCAR é um produto de 
amplificação RAPD ou ISSR (banda) que é extraído de um gel e 
posteriormente clonado num vector e sequenciado. 
Posteriormente, este fragmento é re-amplificado com primers
específicos (16-24 pb) e são analisados os resultados obtidos.
Apresenta vantagem em relação aos RAPDs uma vez que é 
convertido num marcador co-dominante e mais reprodutível. 
No entanto trata-se de uma técnica mais exigente e requer algum 
conhecimento da sequência que se manifesta de acordo com a 
herança mendeliana e apresenta uma maior exigência em termos 
operacionais. 
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Gel RAPD
Banda polimórfica
Extracção da banda polimórfica e
clonagem num vector
Sequenciação do fragmento e amplificação
apenas das bandas com interessePadrão de bandas mais fácil de interpretar
Banda polimórfica
Figura 14 – Representação esquemática da metodologia SCAR (adaptado de: Vicent e Fulton, 2003).
SCAR – sequence characterized amplified region 
(exemplificação da técnica)
Localização dos primers no cistrão do rDNA e respectivas regiões 
amplificadas. Adaptado de White et al. (1990).
   

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Padrões de IGS1 obtidos por PCR dos isolados de Cenococcum geophilum em gel de 
agarose (1,2 %) corado com brometo de etídio. Isolados 4,74CT1; 4,28CT5; 7,43MT5; 
2,17MT5; 7,47MT5; 5,37MT5; 1,19MT9; 7,15MT5; 6,19MT5, linhas 1-9, 
respectivamente. Marcadores 100 bp e 1 Kbp, linhas M e m, respectivamente.
Tamanho aproximado (bp) dos loci do cistrão do rDNA amplificados por PCR dos
isolados de Cenococcum geophilum .
Isolados
Loci
4,74CT1 4,28CT5 7,43MT5 2,17MT5 7,47MT5 5,37MT5 1,19MT9 7,15MT5 6,19MT5
ITS1 600 700 700 700 700 700 250 700 700
ITS2 350 350 350 350 350 350 350 350 350
ITS total 950 1050 1050 1050 1050 1050 600 1050 1050
NS3/NS4 600 600 600 600 600 600 600 600 600
SR1R/NS4 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300
NS3/SR6 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300 1300
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Sumário dos resultados dos padrões de restrição obtidos com 7 endonucleases nos
vários loci do cistrão do rDNA amplificados por PCR em isolados de Cenococcum
geophilum. Tx = isolados do tipo morfológico x; — = sem sítio de restrição; Ø = sem
variação entre isolados; Dv = digestão variável.
Loci do rDNA
Endonucleases ITS1 ITS2 NS3/NS4 SR1R/NS4 NS3/SR6
Alu I
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9;
Discrimina
alelos entre
isolados T5
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Ø; Dv
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
EcoR I — Ø — — —
Hinf I
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9;
Discrimina
alelos entre
isolados T5
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9
Ø
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Hind III
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9;
Discrimina
alelos entre
isolados T5;
Dv
Discrimina
alelos entre T1
e T5/9; Dv
Ø; Dv Ø; Dv
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9; Dv
Msp I
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9;
Discrimina
alelos entre
isolados T5
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9 Ø
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9
Pst I
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9; Dv
Discrimina
alelos entre
isolados T5;
Dv
Ø; Dv Ø; Dv
Discrimina
alelos entre
T1/5 e T9; Dv
Taq I
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9
Discrimina
alelos entre
T1/9 e T5
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9
Discrimina
alelos entre T1,
T5 e T9
PCR + Digestão + Electroforese
CAP – Cleaved amplified polimorphic sequences = PCR-RFLP
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AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism
Esta técnica foi desenvolvida em 1990 numa empresa de biotecnologia 
holandesa Keygene (Vos et al., 1995), e representa uma tecnologia que 
permite a obtenção de um grande número de marcadores moleculares 
distribuídos pelo genoma de procariotas e eucariotas. Este marcador 
combina a especificidade da digestão com enzimas de restrição e o poder 
prático da técnica de PCR. 
A análise de AFLP consiste em quatro etapas: 
1) o DNA genómico do indivíduo é clivado com duas enzimas de 
restrição, uma com elevada e outra com reduzida frequência de 
corte (p.e. MseI e EcoRI); 
2) adaptadores específicos ligam-se aos terminais dos fragmentos de 
DNA genómico originados pela digestão das enzimas de restrição;
3) uma fracção destes fragmentos gerados é amplificada por duas 
reacções de PCR, uma designada de pré-amplificação e uma outra 
mais específica e selectiva; 
4) os fragmentos amplificados são separados em gel de alta resolução.
DNA Genómico
Ligação de adaptadores
Pré-amplificação
Amplificação selectiva
Corte com enzimas de restrição
AFLP Fingerprinting
AFLP – princípios da técnica
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Restrição por EcoR I e Mse I
AFLP
Fragmentos gerados pelas duas enzimas de restrição
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Ligação dos adaptadores específicos
Amplificação pré-selectiva
Fragmentos amplificados
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Amplificação Selectiva
4,74CT1
4,28CT5
7,43MT5
2,17MT5
7,47MT5
5,37MT5
1,19MT9
7,15MT5
6,19MT5
Electroferogramas obtidos com o par de primers selectivos EcoR I-TGC e Mse I–CTA para
os isolados de Cenococcum geophilum. Em todos os fluorogramas atribui-se a cor laranja
aos picos do marcador interno de peso molecular ROX-500 e a cor azul para os picos
correspondentes aos fragmentos detectados.
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4,28CT5
4,74CT1
1,19MT9
6,19MT5
7,43MT5
7,15MT5
100
56
55
94
5,37MT5
7,47MT5
2,17MT5
100
100
54
Árvore de consenso obtida a partir dos
electroferogramas de AFLP para os isolados de
Cenococcum geophilum.
Sequenciação de DNA
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SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
Os SNPs são marcadores cujo polimorfismo é baseado na 
substituição de uma única base entre sequências homólogas. 
Ocorrem mais frequentemente que qualquer outro marcador e 
localizam-se muito próximo, ou até mesmo inseridos nos 
genes de interesse. 
Figura 20 – Identificação de SNPs (adaptado de: Vicent and Fulton, 2003).
ESTs (Expressed Sequence Tags)
As ESTs são pequenos fragmentos de DNA (200 a 500 pb) 
obtidos por sequenciação de uma ou de duas extremidades de 
um gene expresso de uma biblioteca de cDNA . 
É de bastante eficácia quando se quer identificar um novo gene 
e, em plantas, já foram identificados mais de 1 000 000 
sequências EST (www.ostp.gov).
mRNA
Transcriptase reversa
RNA
cDNA
Degradação do RNA/Síntese da dupla cadeia de DNA
Dupla cadeia de DNA
Primer Primer
5’ EST 3’ EST
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Microarrays
Esta tecnologia permite a análise da totalidade do genoma em micro 
chips (Microarrays). 
Baseia-se na hibridação entre pequenos oligonucleótidos e cDNA 
marcado com fluorocromos, num chip (suporte físico). Quando se 
verifica complementariedade entre o oligonucleótido e o cDNA, é 
emitida fluorescência e é identificado e quantificado o fragmento de 
DNA em estudo.
Os microarrays são usados no diagnóstico da expressão de genes e 
na construção de mapas genéticos.
Representação esquemática dum microarray
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Cromossomas mitóticos observados ao 
microscópio óptico (n = 6) em hifas de 
C. geophilum (isolado 4,28CT5) 
coradas com carmim (× 2740).
Número de cromossomas (n)
6 7 8Isolados
Frequência de metafases
4,74CT1 2 - -
4,28CT5 10 - -
7,43MT5 27 - 7
2,17MT5 20 - 2
7,47MT5 20 - -
5,37MT5 20 3 4
1,19MT9 6 - -
7,15MT5 12 - -
6,19MT5 11 - 2
Números cromossómicos e frequência de metafases em isolados de C. geophilum. 
Marcador Citogenético
Cromossomas mitóticos observados ao microscópio óptico (n = 8) em hifas de 
Cenococcum geophilum (isolado 2,17MT5) coradas com carmim (× 2740).
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Isolados
 Rf
2,17MT5 7,43MT5 1,19MT9 4,28CT5
Loci 0 ppm 30 ppm 0 ppm 30 ppm 0 ppm 30 ppm 0 ppm 30 ppm
0,21 + + + + + + + +
0,25 + + + + + + + +
0,29 - - - - + + - -
0,35 - - + - - - - -
0,45 - - + - - - - -
ACPH-2
0,52 - - + - - - - -
ACPH-1 0,84 - - + - - - - -
Formas moleculares de fosfatases ácidas (ACPH) em isolados de C. geophilum 
expostos a duas concentrações de Ni (0 e 30 ppm). + Isoenzima expressa; -
isoenzima não expressa.
Ni adicionado ao meio de cultura (ppm)Isolados
0 5 10 15 20 30
4,28CT5 0,26 a 0,25 ab 0,26 a 0,25 ab 0,23 ab 0,19 b
2,17MT5 0,16 a 0,21 a 0,23 a 0,20 a 0,16 a 0,15 a
1,19MT9 0,17 a 0,20 a 0,18 a 0,17 a 0,17 a 0,18 a
7,43MT5 0,30 a 0,31 a 0,31 a 0,35 a 0,33 a 0,35 a
Biomassa (g) dos isolados de 
C. geophilum nas diversas 
combinações 
isolado/concentração de Ni 
adicionado ao meio de 
cultura, após 8 semanas.
Marcador 
Bioquímico