Prática Electroforese Protocolo

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Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra 
Departamento de Ciências da Vida 
Genética 
 
Electroforese de Produtos de PCR 
 
A electroforese em gel de agarose é o método mais 
utilizado actualmente para analisar uma amostra de DNA, 
detectar a presença de contaminantes, isolar moléculas de 
diferentes tamanhos ou conformações e separar fragmentos 
de DNA após tratamento com enzimas de restrição. Este 
método baseia-se no seguinte princípio: se uma molécula é 
colocada num campo eléctrico, migrará para o eléctrodo 
apropriado a uma velocidade (ou mobilidade electroforética) 
proporcional à força a que está submetida e à sua carga. Uma 
mistura de diferentes moléculas (ou fragmentos de molécula) pode ser resolvida 
electroforeticamente com base (1) na dimensão da molécula, (2) na forma e 
conformação da molécula e (3) na grandeza da carga total da molécula. 
Podem utilizar-se diferentes tampões em electroforese sendo, porém, o mais 
utilizado o Tris-borato-EDTA (TBE) a pH 8.3-8.5. A este valor de pH, só os grupos 
fosfato do ácido nucleico estão ionizados de modo que a mobilidade electroforética 
depende apenas do peso molecular do ácido nucleico. 
A agarose é um polissacarídeo linear de galactose e galactose anidra, com 
grupos substituintes que podem ser: sulfato, piruvato, carboxilo, entre outros. As 
soluções de agarose polimerizam a uma temperatura próxima dos 40ºC, obtendo-se 
uma matriz cuja malha (dimensões dos poros) pode variar consoante a concentração 
em agarose (0.3% a 2%). Assim, escolhendo convenientemente a concentração de 
agarose podem separar-se moléculas de DNA cujo número de pares de bases varia 
entre 1000 a 50000 (gel a 0.3%) ou entre 200 a 3000 (gel a 2%). Para separar 
fragmentos de DNA de dimensões inferiores a 200 pares de bases é preferível usar 
outro tipo de gel (co-polímeros de acrilamida e bisacrilamida). 
Neste trabalho usar-se-á uma tina de electroforese horizontal, com gel de 
agarose submerso, o que tem várias vantagens. A preparação do gel é muito simples 
e as amostras depositam-se facilmente. A migração das amostras no gel pode ser 
acompanhada durante o processo, se se incorporar azul de bromofenol na própria 
mistura a colocar no poço. Após a migração, as bandas originadas podem ser 
observadas sob luz UV, se o gel for corado com um corante que seja fluorescente (p.e 
brometo de etídio ou GelRed®. Pode ser corado após a corrida electroforética, por 
exemplo, usando também por exemplo brometo de etídio1, por imersão do gel neste. 
Também pode haver coloração por incorporação do próprio corante no gel aquando da 
sua preparação, podendo-se usar também neste caso GelRed®. 
1
 O brometo de etídio é um agente mutagénico potente, pelo que deve usar sempre 
luvas e colocar num recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este 
corante. Neste trabalho, usaremos como substituinte deste o GelRed®., pois é menos tóxico. 
 
Material 
 Produtos de PCR (amplificados na última aula) 
 Balança 
 Espátula 
 Balão de Erlenmeyer 250 ml 
 Proveta 50 ml 
 Micropipetas 
 Tina de electroforese 
 Transluminador de UV 
 Parafilme 
 Microtubos de 1.5 µl 
 Microondas 
 
 
Reagentes 
 Agarose 
 Tampão TBE 10x (diluído depois para 1x) 
 Solução de deposição 
 GelRed® 
 Marcador de peso molecular 100bp 
 
 
Metodologia 
 
 Pesar 0,75 g de agarose, directamente para um balão Erlenmeyer de 
250 mL; 
 Adicionar 50 mL de tampão electroforético 1x TBE; 
 “Cozer” a solução no microondas durante aproximadamente 5 minutos 
na potência máxima, até entrar em ebulição e apresentar um aspecto 
translúcido que significa total dissolução da agarose; 
 Deixar arrefecer um pouco a solução; 
 Adicionar 2,5µl de GelRed à solução no Erlenmeyer. 
 Verter a solução sobre um tabuleiro de acrílico selado. Colocar o pente, 
eliminar bolhas de ar que se possam ter formado e deixar polimerizar o 
gel à temperatura ambiente numa superfície plana. 
 
Durante a polimerização, preparam-se as amostras da amplificação do DNA: 
 
 Num microtubo de 1,5 mL, misturar 25µL da mistura de PCR e 5 µL de 
solução de deposição. 
 Colocar o gel polimerizado numa tina de electroforese horizontal, e cobrir 
totalmente o gel e os poços com o tampão electroforético 1x TBE. 
 Depositar as amostras nos poços do gel. No primeiro e no último poço, 
incluir 5 µL do marcador de peso molecular GeneRuler DNA Ladder Mix 
(100bp) (BioLine). Verificar que as amostras estão colocadas do lado do 
pólo negativo (cor preta) e que a migração será no sentido do pólo 
positivo (cor vermelha); 
 Colocar a tampa na tina, ligar os cabos à fonte e iniciar a electroforese a 
90V tendo o cuidado de verificar se há desprendimento de bolhas dos 
eléctrodos, devido à electrólise e se, passados alguns minutos, o azul de 
bromofenol já começou a migrar no sentido correcto; 
 Após migração julgada conveniente (azul de bromofenol sensivelmente a 
¾ do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica da fonte, desligar 
os cabos e retirar a tampa da tina. 
 Retirar o gel cuidadosamente para não partir; 
 Colocar com cuidado o gel no transluminador de UV. 
 Captar a imagem. 
 Analisar as bandas obtidas. 
 Registar numa matriz a presença/ausência de cada uma das bandas 
(para registar polimorfismos). 
 
 
 
Análise dos géis por presença/ausência de bandas 
 
 
 
.