Tema 5_EstrRepDNA

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Genética 2008/2009
Tema 5. 
Estrutura molecular e replicação 
do material genético: 
A composição e estrutura do DNA. 
Replicação do DNA e síntese do 
DNA. Replicação descontínua. 
Isolamento e caracterização de 
fragmentos de DNA particulares.
Genética 2008/2009
Estrutura molecular e replicação 
do material genético: a 
composição e estrutura do DNA.
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A composição e estrutura do DNA
• Descoberta da estrutura do DNA: 
Watson & Crick, Nature 1953
Uma das descobertas cientificas mais importantes do século XX
WOC
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•Nobel em 1962
James Watson (1928– ), Francis 
Crick (1916–2004), e Maurice 
Wilkins (1916–2004).
Rosalind Franklin (1920–1958)
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A composição e estrutura do DNA
• O DNA é uma hélice dupla 
composta por duas cadeias 
complementares que 
giram para a direita em 
direcções opostas.
• As cadeias estão 
compostas por “miles” de 
nucleótidos.
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A composição e estrutura do DNA: 
nucleótidos
• Açúcar: 2-desoxirribose
• Base azotada
• Grupo Fosfato
nucleósido
nucleótido
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A composição e estrutura do DNA: 
nucleótidos
• Bases azotadas: 
– Adenina (A) - Timina (T)
– Guanina (G) - Citosina (C)
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A composição e estrutura do DNA: 
a cadeia simples de nucleótidos
Ligação fosfodiester
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As cadeias têm polaridade
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A composição e estrutura do DNA
• Antes da descoberta da estrutura do DNA, Erwin 
Chargaff desenvolve um método para medir a 
concentração das bases.
• A percentagem de C+G é diferente em espécies 
diferentes e constante para as células do mesmo 
organismo e dentro da mesma espécie.
A T G C G+C
Escherichia coli 24.7 23.6 26 25.7 51.7
Zea mays 26.8 27.2 22.8 23.2 46.0
Drosophila melanogaster 30.8 29.4 19.6 20.2 39.8
Homo sapiens 29.8 31.8 20.2 18.2 38.4
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A composição e estrutura do DNA
Regras de Chargaff
[A] = [T]
[G] = [C]
[A] + [G] = [T] + [C] 
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A composição e estrutura do DNA: 
emparelhamento de Watson & Crick
[A] = [T] [G] = [C]
Os nucleótidos das duas cadeias estão unidos por ligações de 
hidrogénio entre as bases complementares (purina e pirimidina). 
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Cadeias complementares e antiparalelas
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Forma B do DNA
Gira para a direita. Estrutura comum.
Empilhamento das bases:
Bases planas e hidrofóbicas.
Empilhamento dá estabilidade à hélice.
Major groove
(22 Å)
Minor groove
(12 Å)
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Os resíduos expostos 
no major groove são 
mais dependentes da 
identidade da base 
azotada.
Implicações para a 
união específica de 
proteínas.
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Outras formas do DNA
Hélice tripla.
Fragmentos curtos.
Sequência rica em purinas (A, G).
Utilidade em investigação e clínica
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Outras formas do DNA
Gira para a esquerda.
Regiões ricas em GC.
Água 75% 
Mais bases por volta.
Pouco abundante.
Estrutura comum
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Forma Z do DNA
• 1979, Alexander Rich
• Aparece em certas regiões 
ricas em GC onde as 
bases estão rodadas e não 
são paralelas ao eixo 
central
• Estável quando as bases 
são metiladas: importante 
na regulação da expressão 
génica em eucariotas.
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Relação entre estrutura e função
• Estrutura capaz de auto-replicação.
• Contém toda a informação necessária para 
o funcionamento e 
organização celulares.
• Estrutura/informação 
capaz de ser alterada.
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Relação entre estrutura e função: 
auto-replicação 
Watson & Crick, 1953
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A ordem das bases contém a informação 
genética: número de combinações quase 
infinito.
Relação entre estrutura e função: 
informação 
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• Mutações transmissíveis: emparelhamento 
incorrecto das bases na replicação.
Relação entre estrutura e função: 
alteração
C
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Replicação do DNA e síntese do 
DNA. Replicação descontínua.
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Auto-replicação do DNA: 
duplicação do material genético.
• A replicação do DNA 
permite a duplicação do 
material genético antes da 
divisão celular.
• Durante a replicação, cada 
cadeia parental permanece 
intacta e serve de molde 
para a síntese da cadeia 
complementar.
• O resultado é a formação 
de duas moléculas de DNA 
de dupla hélice que são 
iguais à cadeia original.
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Auto-replicação do DNA é semiconservativa:
experiência de Meselson-Stahl (1958)
Conceitos:
• Bactérias a crescer num meio de cultura com 
15N tem DNA mais denso (1.722 g/cm3) que 
quando crescem em 14N (1.708 g/cm3).
• Ultracentrifugação em CsCl: formação de 
gradiente mais concentrado e denso no fundo 
dos tubos.
• DNA de distinta densidade pode ser separado 
em gradiente de CsCl.
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• Escherichia coli em 15N durante varias gerações: 
DNA “pesado”.
• Transferidas à 14N.
• Extracções de DNA após 0, 1, 2, 3 gerações.
• Ultracentrifugação em CsCl.
• Predição de Menselson & Stahl:
Auto-replicação do DNA é semiconservativa:
experiência de Meselson-Stahl (1958)
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15N
14N
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Predição do modelo conservativo
Resultados
Generação
0
1
2
4
3
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Replication fork
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Estabilização das hélices
• Helicases (E. coli: DnaB): Desenrolam a dupla 
hélice no replication fork.
• Proteínas estabilizadoras das cadeias simples 
(SSB): grande afinidade por cadeias simples 
de DNA, evitam a renaturação do DNA.
• Topoisomerases: cortam e selam a dupla 
cadeia para libertar tensões de torção
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Iniciação da replicação do DNA.
• A replicação é realizada pelas DNA 
polimerases.
• Formam ligações fosfodiester entre o novo 
nucleótido e o 3’-OH do nucleótido da 
cadeia.
• Não iniciam cadeias de DNA: é necessário 
primers de RNA complementares do sítio de 
início.
• Complexo enzimático encarregado de 
formar os primers.
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Diferenças DNA-RNA
Nucleótidos unidos como no DNA.
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• Procariotas: 
– Primase (tipo de RNA polimerase).
– Primers de 2-5 nucleótidos.
• Eucariotas:
– Primosoma com DNA polimerase 
– Primers de 12 ribonucleótidos + 20-25 
deoxyribonucleótidos (RNA + DNA)
Iniciação da replicação do DNA.
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Alongamento
• DNA polimerases: 
ligação fosfodiester 
entre o grupo 3’–OH 
do último nucleótido 
da cadeia e o P 
interior do nucleósido 
trifosfato.
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Alongamento
• Eucariotas: DNA polimerase δ
• Procariotas: DNA polimerase III
–Complexos de várias enzimas que unem 
à cadeia simples do DNA e adicionam os 
novos nucleótidos. 
–A adição do nucleótido depende de que 
seja o complementar da base presente 
na cadeia parental.
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Alongamento e correcção
• DNA polimerase: 1 
erro em cada 10000 
nucleótidos.
• Mecanismo de 
correcção dos erros 
na cópia do DNA: 
DNA polimerases δ 
e III tem capacidade 
exonuclease 3’-5’.
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Replicação descontínua
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Replicação descontínua
3’
5’
5’
3’
Proc: 1000-2000 pb
Euc: 100-200 pb
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Replicação descontínua
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Replicação descontínua:
finalização em procariotas
5’-3’ exonuclease, polimerase
5’ 3’
5’
3’
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Replicação descontínua:
finalização em procariotas
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Replicação descontínua: finalização em eucariotasGenética 2008/2009
Diferenças entre procariotas e eucariotas.
Eucariotas
Procariotas, virus
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Replicação de moléculas circulares de DNA.
Processo em Escherichia coli.
Cadeia parental
Novas cadeias duplas
Replicação θ (theta)
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Replicação θ de moléculas 
circulares de DNA.
Replication origin: sítio de início da replicação.
Replication fork: região de separação das cadeias parentais e 
síntese da nova cadeia.
Unidirectional or bidirectional. A maioria são em duas direcções
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Replicação de moléculas circulares de 
DNA de virus: rolling-circle replication.
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Replicação do DNA em eucariotas.
DNA linear, replicação bidireccional, múltiplas 
origens de replicação. 
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Replicação do DNA.
• Velocidade de replicação em procariotas: 
1500 nucleótidos/segundo.
• Velocidade de replicação em eucariotas: 
10-100 nucleótidos/segundo.
• Múltiplas origens, cada 40.000 
nucleótidos: replicação mais rápida: 15-30 
minutos/cromossoma, 5-10 horas em 
total.
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Para sumarizar (E. coli):
DNA pol I
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Aplicações da replicação do DNA:
Isolamento e caracterização de 
fragmentos de DNA
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Aplicações da replicação do DNA:
Isolamento e caracterização de 
fragmentos de DNA
• Hibridação de ácidos nucleicos
• PCR
• Sequenciação
• Uso clínico de análogos de dideoxynucleótidos
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Hibridação de ácidos nucleicos
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Hibridação de ácidos nucleicos
Só há hibridação se as 
sequências 
complementares 
tiverem o tamanho 
suficiente.
Podem existir 
mismatches (bases 
não complementares), 
a quantidade depende 
das condições 
experimentais.
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Hibridação de ácidos nucleicos
• Detecção de sequências determinadas.
• Tracking de marcadores genéticos em 
pedigrees e no estudo de doenças 
genéticas.
• Detecção de genes semelhantes: procura 
de famílias génicas com genes de função 
semelhante.
• Detecção de genes conhecidos em 
diversas espécies.
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Hibridação de ácidos nucleicos:
Southern blot
• Corte do DNA genómico com enzimas de 
restrição.
• Electroforese em gel.
• Transferência para uma membrana de 
nitrocelulose para fixar os fragmentos.
• Hibridação com sonda marcada 
(radioactiva).
• Visualização.
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Hibridação de ácidos nucleicos
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Polymerase Chain Reaction 
(PCR)
• Amplificação exponencial de fragmentos 
de DNA (RNA).
• Kary B. Mullis, premio Nobel 1993.
• Replicação do DNA in vitro.
– DNA polimerase
– DNA molde
– Precursores (nucleósidos trifosfato)
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Polymerase
Chain
Reaction
1 molécula
107
25 ciclos
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Processo exponencial.
• 10-100 moléculas DNA molde
• Ferramenta fundamental em investigação 
básica.
• Aplicações clínicas: detecção de patógenos 
e parasitas. 
• Investigação forense: quantidades 
mínimas de DNA.
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VNTR: Variable number of tandem 
repeats, highly variable 
microsatellites
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Sequenciação
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Sequenciação
PCR com uma mistura dos 
quatro deoxyribonucleósidos 
tri-fosfato + uma pequena 
quantidade dum dos 
dideoxyribonucleósidos 
marcados com fluorescência.
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Uso clínico de análogos de 
dideoxynucleotidos
Moléculas semelhantes aos dideoxynucleotidos que são usadas para 
impedir a replicação do HIV.
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