Produção de insulina

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TUTORIAL 4 - GENÉTICA
● Tipos de obtenção de insulina para humanos e vantagens e desvantagens dos
dois processos:
As insulinas podem ser classificadas em humanas e análogos à insulina humana. A insulina
de origem humana (NPH e Regular) é desenvolvida em laboratório, a partir da tecnologia de
DNA recombinante e os análogos são preparações de insulina que sofreram alteração na
cadeia de aminoácidos para melhorias no tempo de ação. A insulina pode ser obtida através
da extração de células do pâncreas de bovinos e suínos, a insulina produzida pelo suíno é
mais parecida com a humana. Os três tipos de insulina ( humana, suína e bovina) causam
efeito semelhante no homem e são denominadas insulinas regulares ou simples ou de ”
single peak” (único pico de ação). Só que a insulina humana é menos imunogênica (gera
menos defesas imunológicas), enquanto a do boi é a mais imunogênica, por isso são
selecionadas pela necessidade do paciente em adquirir efeitos rápidos ou mais lentos
dessas substâncias.
● Por que a insulina recombinante é mais segura e como ocorre o processo de
alergia:
Apesar da semelhança entre a insulina bovina e suína à insulina humana, sua ligeira
diferença pode ser notada pelo sistema imunológico causando reações alérgicas em alguns
pacientes que acabam produzindo anticorpos contra o hormônio, neutralizando sua ação e
resultando em respostas inflamatórias nos sítios de injeção. Outra preocupação eram as
possíveis complicações a longo prazo, decorrentes da injeção regular de uma substância
estranha. Ao injetar a insulina regularmente o sistema imune pode em algum momento
identificar aquela substância como estranha, utilizando as células apresentadoras de
antígeno para estimular a produção de anticorpos elas geram uma resposta alérgica à
insulina.
Já a insulina produzida pela tecnologia do DNA recombinante apresenta a vantagem de
eliminar a possibilidade de contaminantes ou agentes infecciosos que podem estar
presentes nas proteínas purificadas de animais. Além de não ser reconhecida como
estranha porque foi sintetizada por DNA humano, então não gera resposta alérgica.
A bactéria E. coli foi a primeira utilizada, mas atualmente, esse procedimento também é
realizado utilizando células de leveduras, já que elas secretam uma molécula de insulina
humana quase completa, com estrutura tridimensional perfeita. Isso minimiza a necessidade
de procedimentos de purificação caros e complexos. A Saccharomyces cerevisae é a
levedura predominante para produção de insulina em larga escala. Além das cepas de
E. coli e leveduras, animais transgênicos e sistemas de expressão vegetais também podem
ser empregados para a produção deste hormônio recombinante.
● Como obter uma Bactéria recombinante (tecnologia do DNA recombinante):
As bactérias recombinantes são originadas pela clonagem genética. Considerando que as
bactérias são seres assexuados, elas se dividem gerando outra bactéria, que é um clone
idêntico a ela já que só tem um único material genético sendo compartilhado. Por isso, a
técnica central do DNA recombinante consiste em clonar o material genético de interesse ao
de uma bactéria hospedeira. O DNA tem que ser isolado a partir de enzimas de restrição,
presentes em bactérias e com função de proteger seu material genético fazendo cortes no
DNA quando elas são atacadas por bacteriófagos. As enzimas de restrição reconhecem
porções específicas do DNA de 4 a 8 pares de bases e fazem cortes nessas regiões, um
em cada fita da dupla-hélice. A primeira enzima descoberta foi da bactéria E. coli e hoje
essas enzimas são purificadas em laboratórios.
1. As enzimas de restrição cortam a porção do DNA contendo o gene de interesse para o
pesquisador.
2. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias
cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
3. A enzima de restrição é utilizada para clivar o plasmídeo
(DNA) bacteriano. Esses fragmentos de DNA do humano, ao ser
cortado, gera pontas que são complementares ao plasmídio
porque foram clivados com a mesma enzima.
4. O plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA
humano (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola”
os dois fragmentos, catalisando a ligação fosfodiéster e
produzindo o DNA recombinante, que será introduzido em uma
bactéria hospedeira.
5. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo
seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante
crescem, formando colônias. Após muitas gerações de
bactérias, os genes expressam proteínas humanas, que são
purificadas (separadas) das bactérias. A partir desse método é
possível produzir várias proteínas humanas.
● Mecanismo de obtenção da insulina recombinante, desde a amplificação do
DNA humano responsável pela síntese da insulina até as modificações pós
traducionais realizadas em laboratório:
1. A insulina humana é extraída de células pancreáticas para obtenção do gene da
produção de insulina que fica na porção superior do cromossomo 11, o DNA é clivado por
enzimas de restrição na região específica contendo a informação para produção de insulina
e multiplicado por PCR.
2. Um DNA plasmidial é extraído de uma
bactéria e cortado com as mesmas enzimas de
restrição que clivaram o DNA humano, formando
um plasmídeo vetor.
3. O gene humano da produção de insulina é
inserido no vetor plasmidial, tendo seus
fragmentos selados pela enzima ligase,
formando o DNA recombinante.
4. O DNA recombinante é introduzido em células
bacterianas hospedeiras. As bactérias
recombinantes multiplicam-se em um tanque de
fermentação e produzem a insulina humana. A
insulina é extraída e purificada, pronta para uso.
- PCR: A Reação em cadeia da polimerase é
uma técnica usada para gerar várias cópias do DNA, ela é feita por uma enzima DNA
polimerase que faz novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A enzima
utilizada é a Taq polimerase porque ela é muito resistente ao calor. Para esse processo
ocorrer são colocados primers no DNA em locais que o pesquisador quer copiar, ao se ligar
no primer a enzima passa a copiar a sequência de nucleotídeos específica. A Taq
polimerase é colocada junto com os primers, cofatores que auxiliam a enzima e o DNA
molde em um tubo de ensaio, esse tubo vai ser aquecido até 96º C, nesta temperatura o
DNA desnaturado e suas fitas se soltam, gerando duas fitas simples. Em seguida resfria-se
o tubo para 55º C para que os primers se liguem por
complementaridade nas bases do DNA (anelamento). Por
fim, eleva-se de novo a temperatura para 72º C que é a
temperatura que Taq polimerase fica mais ativa, então ela
começa a estender os primers e sintetizar novas fitas do
DNA. Esse processo se repete 25-35 vezes e pode formar
milhares de cópias.
- Transformação da bactéria: após a clivagem e ligação
do plasmídeo ao DNA de interesse é preciso introduzi-lo
na bactéria. A bactéria é misturada aos fragmentos de
DNA e aplica-se um choque térmico nele, este choque
forma poros na membrana da bactéria que permite a
passagem do DNA e ela acaba incorporando seu
plasmídeo transformado. Mas nem todas as bactérias
incorporam o plasmídeo, e nele tem um gene para
resistência a um antibiótico, por isso as bactérias são
colocadas numa placa junto ao antibiótico e só aquelas
que adquiriram o plasmídeo resistente sobrevivem e
formam colônias, as outras morrem e o
pesquisador pega a bactéria de interesse. Depois é
preciso fazer testes para observar se a bactéria
adquiriu o plasmídeo de forma correta, porque
algumas podem incorporá-lo ao contrário e para
expressar o gene em bactérias e produzir uma
proteína, o gene tem que apontar na direção
correta em relação ao promotor, se o gene estiver
ao contrário, a fita errada de DNA seria transcrita e
não seria produzida proteína.
- Cromatografia de purificação: as bactérias têm
muitas proteínas e macromoléculas. Por conta
disto, a proteína recém-formada precisa ser purificada (separada de outras proteínas e
macromoléculas) antes de poder ser utilizada. Existe uma variedade de diferentes técnicas
utilizadas para a purificação deproteínas. Em uma técnica chamada de cromatografia de
afinidade, uma mistura de moléculas extraídas das bactérias decompostas é vertida em
uma coluna, ou em um cilindro repleto de grânulos. Os grânulos são revestidos com um
anticorpo, uma proteína do sistema imunológico que se liga especificamente a uma
molécula alvo. O anticorpo na coluna é projetado para ligar-se à proteína de interesse, e
não a quaisquer outras moléculas da mistura. Desta forma, a proteína de interesse fica
presa na coluna, enquanto as outras moléculas são arrastadas. Na etapa final, a proteína
de interesse é liberada da coluna e coletada para o uso.
-Western blotting: é uma técnica utilizada para detectar proteínas específicas, no caso da
insulina o Western blotting permite identificar se as proteínas desejadas foram fabricadas
pela bactéria. Para realização da análise de Western blotting, são necessários os anticorpos
específicos para a proteína em análise.
As fontes destes anticorpos podem ser
amostras de soro (por exemplo, de
pacientes com infecções conhecidas),
preparações de anticorpo policlonal
purificado, ou os anticorpos
monoclonais. A mistura contendo a
proteína sob investigação tem seus
componentes revelados por
eletroforese em gel e as proteínas são
transferidas para o papel de
nitrocelulose. O anticorpo primário se
liga à proteína-alvo e é imobilizado no
papel. O complexo antígeno-anticorpo
pode assim, ser identificado com os
anticorpos que serão marcados por iodo radioativo e, assim, podem ser visualizados pelo
procedimento de autorradiografia.
● Outros exemplos de produtos para uso em humanos obtidos pelo DNA
recombinante:
Um exemplo da potencial aplicação da expressão de proteínas recombinadas em
intervenção terapêutica é a produção de anticorpos em plantas, visando seu uso em
imunoterapia. As plantas são capazes de sintetizar e montar qualquer tipo de molécula de
anticorpo, desde fragmentos até cadeias completas, produzindo uma grande quantidade de
anticorpos. Outro exemplo é a terapia gênica por transferência de células retiradas do
próprio paciente com retrovírus, ou outros tipos de vírus, com o intuito de repor um gene
mutante ou para o tratamento de doenças multifatoriais como câncer e doenças cardíacas.
A primeira terapia gênica realizada para substituir um gene mutante único, foi a terapia para
a deficiência da adenosina desaminase (ADA), a qual consiste em implantar linfócitos T
transfetados com retrovírus expressando a proteína ausente nos portadores desta doença.