Introducao_a_genetica_-_Marcadores_moleculares_Extracao_de_DNA_PCR_sequenciamento_de_DNA_Microssatelite _(_modulo_1_)

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Introdução a genética - Marcadores moleculares, Extração de DNA, PCR, sequenciamento de DNA, Microssatélite. (
Módulo 1 ) 1
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Introdução a genética - 
Marcadores moleculares, 
Extração de DNA, PCR, 
sequenciamento de DNA, 
Microssatélite. ( Módulo 1 )
Marcadores moleculares
• Até meados da década de 1960. Marcadoresmorfológicos para estudos de 
melhoramento genético.
• Isoenzimas. informação genética baseado em enzimas(proteínas)
• Enzimas de restrição (RFLP). acesso direto ao DNA
Extração de DNA 
• DNA: nuclear, mitocondrial e do cloroplasto:geralmente faz-se uma extração total
• Primeiro passo para utilização em técnicas marcadoresmoleculares baseadas em 
DNA• Importante que o DNA esteja íntegro!• Quantidade de DNA? Depende do 
marcador• Protocolos diferem quanto ao organismo, tecido e estado deconservação do 
tecido.
• Importante que o DNA esteja íntegro!
• Quantidade de DNA? Depende do marcador
• Protocolos diferem quanto ao organismo, tecido e estado deconservação do tecido.
Etapa básicas da extração
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• Destruição das células (maceração,detergentes)
• Destruição de proteínas (proteinase K)
• Retirada de proteínas, açúcares (filtragemde afinidade)
• Retirada de DNA da coluna - Precipitaçãode DNA
Visualização do DNA em gel de eletroforese.
 Quantificação via espectrofotômetro (e análise 
comparativa em gel).
PCR
PCR envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias deum segmento 
específico de DNA
• Realizada através da enzima DNA polimerase
• A técnica se baseia no anelamento e extensão enzimática de um parde 
oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples)PRIMERS!
• Primers são sintetizados artificialmente, com o objetivo de quepossam ser 
complementares ao DNA, possibilitando o anelamento.
🔬 Termociclador 
Etapas do ciclo de PCR
• Desnaturação elevação da temperatura 92 a 95 C
• Anelamento temp. rapidamente reduzida 35 a 60 C
• Extensão elevação da temperatura 72 CA repetição dos ciclos gera milhões de cópias
Cerca de 20 bases de comprimento.
“Desenhados” especificamente para uma região
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Uso para sequenciamento de DNA, microssatélites, etc.
Microssatélites
• Microssatélites são pequenas sequências (motifs) de 1 a 4 bases repetidas em série.
• São mais frequentes, distribuídas ao acaso eformam locos genéticos muito 
polimórficos
• O polimorfismo é relativamente grande. Cadamicrossatélite é um loco genético muito 
variável
Sequenciamento de DNA 
• Duas etapas básicas.
– Reação de sequenciamento (termociclador?) 
– *Migração de fragmentos em gel (sequenciamento?) 
• Cycle sequencing reaction(muito parecida com PCR comum)
- DNA (produto de PCR) purificado equantificado
- primer da direção que deseja sequenciar
- Enzima DNA polimerase
• Fragmentosmigram no gel
• Fluorescem sobfeixe de laser
Banco de Germoplasma
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