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Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro. Métodos de Purificação de Proteínas Nativas Métodos de Purificação de Proteínas 1. Trabalhando com proteínas; 2. Purificação Proteica; 3. Métodos Cromatográficos; 4. Análise de Proteínas. Trabalhando com Proteínas • Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais; • Separadas de outras de forma pura, para a determinação de suas propriedades; • Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas. Trabalhando com Proteínas • SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa temperaturas (0 a 4ºC)!!! • Usar tampão correto (pH, cofatores, estabilizadores, etc.) Trabalhando com Proteínas Como purificar uma proteína Métodos clássicos Diferença de propriedades das proteínas: carga, tamanho, ligantes. Métodos modernos Clonagem de DNA, sequenciamento genômico, chips de proteínas, etc. Trabalhando com Proteínas • Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso. • Mais de um método de purificação utilizado. • Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes. • Iniciar com métodos de baixo custo. Estratégia Geral para Obtenção da Proteína Purificada • Extração Isolamento 1. Material de Partida ----- - Extrato Bruto 2. Desintegração celular Fracionamento •Solubilidade •Tamanho •Carga •Afinidade Ligação Separação Diálise Ultra filtração Coluna Cromatografica Purificação Proteica: Fonte Proteica Purificação Proteica: Isolamento Extrato Bruto Agitação com pequenas partículas (beads) Material Duro French Press Choque osmótico • Transferência rápida de uma solução isotônica para uma solução hipotônica. • Devido a osmose as células ficam túrgidas provocando a lise da membrana. Ruptura por tratamento químico • Usa-se solvente orgânico ou detergente para romper diferentes tipos de tecidos, células e organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e ácidos. Material Mole Vamos começar a purificação! • Centrifugação diferencial é usada para separar organelas, pedaços de membranas e citosol (fração solúvel do citoplasma) do extrato celular. Centrifugação diferencial Purificação Proteica: Fracionamento • Fracionamento Separação das proteínas do extrato em diferentes frações com base no tamanho, carga. Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros fatores. Diferenças na solubilidade proteica Purificação Proteica: Fracionamento • Salting out • Precipitação proteica com elevada concentração salina. • ((NH4)2SO4) sulfato de amônio • A adição de um sal na quantidade correta pode precipitar algumas proteínas e manter outras em solução Purificação Proteica: Preparação • Solução proteica passa por modificações para uma purificação eficiente. • Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas. • Ex: Remoção de sulfato de amônio da amostra. Métodos Cromatográficos • Poderoso método de fracionamento. • Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros. • Velocidade da migração depende da propriedade da proteína. Cromatografia em Coluna Lehninger, 5ª ed. 2010 Métodos Cromatográficos Tipos de Cromatografia em Coluna: o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica); o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho; o Afinidade; o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Cromatografia de troca iônica • Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH. • Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos); o Trocadora de ânions (grupos catiônicos). Cromatografia de troca iônica • Afinidade afetada: o pH (determina o estado de ionização da molécula); o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante. Cromatografia de troca catiônica • Matriz carregada negativamente. • Proteínas com carga líquida positiva migram mais lentamente. • Expansão da solução proteica na fase móvel: o separação de proteínas com diferentes propriedades o espalhamento difusional. Lehninger, 5ª ed. 2010 Cromatografia de troca catiônica • Tamanho da coluna aumenta, a resolução de dois tipos de proteínas com cargas líquidas também aumenta. • A velocidade da solução proteica diminui com o tamanho da coluna. • Quanto mais devagar a solução proteica gasta na coluna, a resolução diminui (espalhamento difusional). Cromatografia de exclusão por tamanho • Ou gel-filtração. • Separação por tamanho. • Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico. • Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas. Cromatografia de exclusão por tamanho • Proteínas grandes não entram nas cavidades e são eluídas mais rapidamente. • Enquanto proteínas menores percorrem um caminho maior dentro dos poros. Lehninger, 5ª ed. 2010 Cromatografia de afinidade • Baseado na afinidade de ligação. • Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado). • Proteínas com afinidade se ligam ao ligante. Lehninger, 5ª ed. 2010 Cromatografia de Afinidade Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada Proteínas ligadas podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes • Formado um complexo entre proteína e ligante. • As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna. • Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre. • O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante. • O ligante livre se liga a coluna de afinidade. Lehninger, 5ª ed. 2010 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) • Bombas de alta pressão aceleram o movimento de moléculas de proteína através da coluna. • Reduzindo o tempo de trânsito na coluna, a difusão de bandas é diminuída e a resolução aumentada. Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a pureza da amostra?) • Absorbância 280nm • SDS-PAGE A280 A280 Eletroforese de Proteínas • Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida. • Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína. • Contribui com grande carga negativa. • SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes. Eletroforese de Proteínas Ação do SDS SDS-PAGE Eletroforese de Proteínas Vantagens • Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas. • Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza. • Permite determinação do ponto isoelétrico e massa molecular aproximada. Eletroforese de Proteínas • Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular. • Polipeptídeosmenores migram mais rápido. • Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata. • Aproximação da massa molecular para proteínas desconhecidas. Eletroforese Bidimensional • Combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE. • Separação de mistura complexa proteica. • Mais sensível que os métodos isolados. • Massa molecular e pI. Resumindo... • Proteínas são separadas e purificadas com base nas diferenças de suas propriedades. • Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por mudanças no pH ou temperatura e, particularmente, pela adição de certos sais. • Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de tamanho, afinidades de ligação, carga e outras propriedades • Todos os procedimentos de purificação exigem um método para quantificação ou análise da proteína de interesse na presença de outras proteínas. Proteina X • Citoplasmática • Peso molecular (616,487 g/mol) • Caráter ácido • Possui calda poli His Proteina X • Coletar o material • Romper a membrana celular para liberação do EXTRATO BRUTO • Centrifugar • Descartar as partes que não serão utilizadas e manter as partes utilizáveis • Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose) Próxima aula: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes
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