Buscar

aula_purificacao-proteinas-nativas_mpap2017

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você viu 3, do total de 43 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você viu 6, do total de 43 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Você viu 9, do total de 43 páginas

Faça como milhares de estudantes: teste grátis o Passei Direto

Esse e outros conteúdos desbloqueados

16 milhões de materiais de várias disciplinas

Impressão de materiais

Agora você pode testar o

Passei Direto grátis

Prévia do material em texto

Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas 
 
Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira 
 
Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro. 
Métodos de 
Purificação de 
Proteínas Nativas 
Métodos de Purificação de Proteínas 
 
1. Trabalhando com proteínas; 
 
2. Purificação Proteica; 
 
3. Métodos Cromatográficos; 
 
4. Análise de Proteínas. 
 
 
 
Trabalhando com Proteínas 
 
• Compreensão sobre estrutura e função de 
proteínas  proteínas individuais; 
 
• Separadas de outras de forma pura, para a 
determinação de suas propriedades; 
 
• Proteína pura  essencial para que suas 
propriedades e atividades sejam determinadas. 
 
 
 
Trabalhando com Proteínas 
 
• SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa 
temperaturas (0 a 4ºC)!!! 
 
• Usar tampão correto (pH, cofatores, 
estabilizadores, etc.) 
 
 
 
 
 
 
Trabalhando com Proteínas 
 Como purificar uma proteína 
Métodos clássicos 
 
Diferença de 
propriedades das 
proteínas: carga, 
tamanho, ligantes. 
Métodos modernos 
 
Clonagem de DNA, 
sequenciamento 
genômico, chips de 
proteínas, etc. 
Trabalhando com Proteínas 
• Proteína nova  precedentes estabelecidos e bom senso. 
 
• Mais de um método de purificação utilizado. 
 
• Levar em consideração métodos descritos para proteínas 
semelhantes. 
 
• Iniciar com métodos de baixo custo. 
 
Estratégia Geral para Obtenção da Proteína 
Purificada 
• Extração 
Isolamento 
1. Material de Partida -----
- Extrato Bruto 
2. Desintegração celular 
 
Fracionamento 
•Solubilidade 
•Tamanho 
•Carga 
•Afinidade Ligação 
Separação 
Diálise 
Ultra filtração 
Coluna 
Cromatografica 
Purificação Proteica: Fonte Proteica 
Purificação Proteica: Isolamento 
Extrato Bruto 
Agitação com pequenas 
partículas (beads) 
 
 
 
Material Duro 
French Press 
 
Choque osmótico 
• Transferência rápida de uma solução isotônica 
para uma solução hipotônica. 
• Devido a osmose as células ficam túrgidas 
provocando a lise da membrana. 
 
Ruptura por tratamento químico 
• Usa-se solvente orgânico ou detergente para 
romper diferentes tipos de tecidos, células e 
organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e 
ácidos. 
Material Mole 
Vamos começar a purificação! 
• Centrifugação diferencial é usada para 
separar organelas, pedaços de 
membranas e citosol (fração solúvel do 
citoplasma) do extrato celular. 
 
Centrifugação diferencial 
Purificação Proteica: Fracionamento 
• Fracionamento  Separação das proteínas do 
extrato em diferentes frações com base no 
tamanho, carga. 
 
 
 
 
Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros 
fatores. 
 
 
Diferenças na solubilidade proteica 
Purificação Proteica: Fracionamento 
• Salting out 
• Precipitação proteica com elevada concentração 
salina. 
• ((NH4)2SO4) sulfato de amônio 
• A adição de um sal na quantidade correta pode 
precipitar algumas proteínas e manter outras em 
solução 
 
 
Purificação Proteica: Preparação 
• Solução proteica passa por modificações para uma 
purificação eficiente. 
 
• Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se 
aproveitando do maior tamanho das proteínas. 
 
• Ex: Remoção de sulfato de 
amônio da amostra. 
 
Métodos Cromatográficos 
 
 
 
• Poderoso método de fracionamento. 
 
• Diferença de tamanho, carga, afinidade de 
ligação e outros. 
 
• Velocidade da migração depende da 
propriedade da proteína. 
 
Cromatografia em Coluna 
Lehninger, 5ª ed. 2010 
Métodos Cromatográficos 
 Tipos de Cromatografia em Coluna: 
 
o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica); 
 
o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho; 
 
o Afinidade; 
 
o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). 
 
 
 
Cromatografia de troca iônica 
• Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga 
elétrica líquida de proteínas em um dado pH. 
 
• Resina: 
o Trocadora de cátions (grupos aniônicos); 
o Trocadora de ânions (grupos catiônicos). 
 
 
Cromatografia de troca iônica 
• Afinidade afetada: 
o pH (determina o estado de ionização da molécula); 
o concentração dos íons dos sais livres que competem 
na solução circundante. 
 
Cromatografia de troca catiônica 
 
• Matriz carregada negativamente. 
 
• Proteínas com carga líquida 
positiva migram mais lentamente. 
 
• Expansão da solução proteica na 
fase móvel: 
o separação de proteínas com diferentes 
propriedades 
o espalhamento difusional. 
 
Lehninger, 5ª ed. 2010 
Cromatografia de troca catiônica 
• Tamanho da coluna aumenta, a resolução de 
dois tipos de proteínas com cargas líquidas 
também aumenta. 
 
• A velocidade da solução proteica diminui com o 
tamanho da coluna. 
 
• Quanto mais devagar a solução proteica gasta na 
coluna, a resolução diminui (espalhamento 
difusional). 
 
Cromatografia de exclusão por tamanho 
• Ou gel-filtração. 
 
• Separação por tamanho. 
 
• Fase sólida: grânulos de polímero com 
ligações cruzadas, com poros de tamanho 
específico. 
 
• Proteínas grandes saem da coluna antes que 
as pequenas. 
 
Cromatografia de exclusão por tamanho 
• Proteínas grandes não 
entram nas cavidades e 
são eluídas mais 
rapidamente. 
 
• Enquanto proteínas 
menores percorrem um 
caminho maior dentro dos 
poros. 
Lehninger, 5ª ed. 2010 
Cromatografia de afinidade 
• Baseado na afinidade de 
ligação. 
 
• Resina: ligante (grupo químico 
covalentemente ligado). 
 
• Proteínas com afinidade se 
ligam ao ligante. 
 
Lehninger, 5ª ed. 2010 
Cromatografia de 
Afinidade 
 Pequenas proteínas são 
ligadas aos suportes e a 
mistura complexa de 
proteínas é aplicada 
 
 Proteínas ligadas podem 
ser eluídas com 
moléculas pequenas ou 
reagentes 
• Formado um complexo entre proteína e 
ligante. 
 
• As proteínas que não se ligam são 
lavadas da coluna. 
 
• Proteína de interesse é eluída com uma 
elevada concentração de sal e do ligante 
livre. 
 
• O sal interfere nas ligações iônicas que 
ligam a proteína ao ligante. 
 
• O ligante livre se liga a coluna de 
afinidade. 
 
 
Lehninger, 5ª ed. 2010 
Cromatografia líquida de alta eficiência 
(HPLC) 
 
 
• Bombas de alta pressão 
aceleram o movimento de 
moléculas de proteína 
através da coluna. 
 
• Reduzindo o tempo de 
trânsito na coluna, a difusão 
de bandas é diminuída e a 
resolução aumentada. 
 
 
Como analisar o resultado da purificação? 
(como visualizar proteínas e determinar a 
pureza da amostra?) 
• Absorbância 280nm 
 
 
• SDS-PAGE 
 
 
A280 
A280 
Eletroforese de Proteínas 
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida. 
 
• Migração afetada pela massa-carga e forma da 
proteína. 
 
• Contribui com grande carga negativa. 
• SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente 
as proteínas, assumindo forma semelhantes. 
 
Eletroforese de Proteínas 
Ação do SDS 
 
SDS-PAGE 
Eletroforese de Proteínas 
Vantagens 
 
• Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar 
proteínas. 
 
• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas 
presentes em uma amostra ou o grau de pureza. 
 
• Permite determinação do ponto 
isoelétrico e massa molecular 
aproximada. 
 
Eletroforese de Proteínas 
• Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular. 
 
• Polipeptídeosmenores migram mais rápido. 
 
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata. 
 
• Aproximação da massa 
molecular para proteínas 
desconhecidas. 
 
Eletroforese Bidimensional 
 
• Combinação sequencial da 
focalização isoelétrica e SDS-PAGE. 
 
• Separação de mistura complexa 
proteica. 
 
• Mais sensível que os métodos 
isolados. 
 
• Massa molecular e pI. 
 
 
Resumindo... 
• Proteínas são separadas e purificadas com base nas 
diferenças de suas propriedades. 
 
• Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por 
mudanças no pH ou temperatura e, particularmente, pela 
adição de certos sais. 
 
• Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de 
tamanho, afinidades de ligação, carga e outras 
propriedades 
 
• Todos os procedimentos de purificação exigem um 
método para quantificação ou análise da proteína de 
interesse na presença de outras proteínas. 
Proteina X 
• Citoplasmática 
• Peso molecular (616,487 g/mol) 
• Caráter ácido 
• Possui calda poli His 
 
Proteina X 
• Coletar o material 
• Romper a membrana celular para liberação do 
EXTRATO BRUTO 
• Centrifugar 
• Descartar as partes que não serão utilizadas e 
manter as partes utilizáveis 
• Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose) 
 
Próxima aula: Métodos de Purificação 
de Proteínas Recombinantes

Outros materiais