2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FE(ll) POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO NO VISÍVEL - PARTE 2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
ALÍCIA LIMA PENIDO
MARIANA CORREA SANTANA
MARIA AUGUSTA C. ALVES
SAMARA BASTOS BUENO OLIVEIRA
ANÁLISE INSTRUMENTAL APLICADA A BIOPROCESSOS EXPERIMENTAL
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FE(ll) POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO NO VISÍVEL
Atividade apresentada ao curso de Engenharia de Bioprocessos pela Universidade de São João Del-Rei, na disciplina de Análise Instrumental Aplicada a Bioprocessos Experimental.
Orientada pelo professor: Vagner Fernandes 
	
OURO BRANCO
OUTUBRO de 2019
1. INTRODUÇÃO
A Espectrofotometria de absorção molecular na região espectral do UV-vis é uma das técnicas espectroscópicas mais utilizadas em química analítica, e faz parte da classe dos métodos analíticos que se baseiam na interação da matéria com a energia radiante. A região ultravioleta próximo do espectro é geralmente considerada de 200 a 400 nm, e a região do visível de 400 a 800 nm. A técnica se baseia na medição indireta da luz absorvida por espécies químicas moleculares com grupos cromóforos relevantes, em geral em solução. A absorção ocorre em moléculas que apresentam elétrons, que podem ser promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia de tal forma que a molécula passe de um estado de menos energia (em geral o estado fundamental) para um estado eletrônico excitada. No processo da transição eletrônica, a distribuição da população de moléculas em diferentes níveis vibracionais e rotacionais provoca o aparecimento de uma banda de absorção no espectro, que representa a transmitância da luz na amostra em função da energia (ou alguma grandeza relacionada com a energia) da radiação luminosa incidente
2. OBJETIVO
Determinar a concentração de Fe (II) em antianêmicos por espectrometria de absorção molecular na região visível do espectro.
3. MATERIAIS E REAGENTES
· Balões volumétricos de 500; 250 e 100 mL 
· Balões volumétricos de 50,00 mL 
· Béqueres de 250 mL 
· Pipeta volumétrica de 10,00 mL 
· Pipeta volumétrica de 1,0 mL 
· Ácido sulfúrico concentrado P.A 
· Ácido nítrico concentrado P.A. A
· Acetato de sódio P.A. 
· Sulfato ferroso amoniacal P.A. - ([Fe(NH4)2(SO4)2].6H2O) 
· Cloridrato de hidroxilamina P.A. (NH2OH.HCl) 
· 1,10-fenantrolina P.A. 
· Água destilada
· Espectrômetro de absorção no UV/VIS, marca Shimadzu, modelo UV 3600.
4. METODOLOGIA
Preparo dos reativos (Verifique quais soluções estão prontas) 
1. Solução padrão de Fe2+: Pesar exatamente 0,7 g de sulfato ferroso amoniacal padrãoprimário [Fe(NH4)2(SO4)2].6H2O e transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 500 mL. Acidificar com gotas de ácido sulfúrico concentrado, dissolver e completar o volume com água deionizada. Nesta solução, 1 mL = 0,21mg de Fe(II).
2. Solução padrão diluída de Fe2+: Pipetar 10 mL de solução padrão de Fe2+ em um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água deionizada. Nesta solução, 1 mL = 0,020 mg de Fe(II) ou 20,0 mg de Fe(II)
3. Solução de cloridrato de hidroxilamina 5% (m/v): Dissolver 5 g de NH2OH.HCl em 100 mL de água destilada.
4. Solução de acetato de sódio 2 mol L-1: Pesar cerca de 41 g de acetato de sódio anidro, transferir para balão de 250 mL e completar o volume com água deionizada.
5. Solução a 0,25% (m/v) de 1,10-fenantrolina: Pesar 0,25 g de 1,10-fenantrolina, transferir para um balão volumétrico de 100 mL. Adicionar cerca de 50 mL de água deionizada, 5 gotas de ácido nítrico concentrado, agitar e completar o volume com água deionizada.
Confecção da curva analítica
6. Numerar 6 balões volumétricos de 100 mL.
7. Adicionar nos balões de números 2, 3, 4, 5 e 6, os seguintes volumes de solução padrão de ferro contendo 21,0 g mL-1 de Fe (II) (solução 2),
8. Fazer as seguintes adições, em todos os balões, inclusive no branco, na ordem indicada: Sol 3 - 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5% (m/v); Sol 4 - 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1; Sol 5 - 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina a 0,25% (m/v).
9. Completar os volumes dos 6 balões com água destilada. Homogeneizar as soluções.
10. Deixar as soluções em repouso por 10 minutos antes de fazer as leituras.
11. Escolher o comprimento de onda com a solução do balão de nº 3, fazendo uso da solução do balão de nº 1 como branco. Fazer a varredura plotando o gráfico de Abs x comprimento de onda na faixa de 400 a 600 nm. O comprimento de onda máximo de absorção é em torno de 510 nm.
12. Zerar o equipamento usando a solução 1 (branco) e medir as absorbâncias de todas as soluções usando a solução do balão de nº 1 como branco.
13. Fazer a leitura da absorbância no espectrofotômetro, no comprimento de onda previamente selecionado e faça o tratamento estatístico/matemático para curva de padronização externa 
• Faça a regressão linear dos pontos ajustando como uma reta. Verifique se os resíduos estão adequados. 
• Calcule o erro da inclinação e do intercepto.
 • Calcule a Análise de Variância da Regressão. 
14. Calcular e registrar as concentrações das soluções na tabela 1 junto com as absorções medidas de cada solução.
Obs: Como não sabia qual era o tamanho do balão usado pelos grupos, logo, quanto de cada solução eles usaram, preenchi a tabela de acordo com o balão de 100ml do roteiro e completei com as concentrações e a absorção.
	Número Balão
	Sol 2 (ml)
20,0µg/mL)
	Sol 3 (mL)
	Sol 4 (mL)
	Sol 5 (mL)
	Conc
	Absorção
	Branco
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0
	0
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,022
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,036
	3
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,4
	0,037
	3
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,4
	0,046
	4
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,6
	0,049
	4
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,6
	0,050
	5
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,8
	0,073
	5
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,8
	0,080
	6
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,099
	6
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,099
15. Trate a curva analítica de padronização externa como feito na prática de padronização externa.
Carta de controle 
Em varias situações de rotina uma mesma metodologia analítica pode ser usada por vários dias seguidos. Nestes casos pode ser inviável o diminuir à produtividade se temos de fazer a curva analítica todos os dias. Uma alternativa e a construção de curvas analíticas é a construção de cartas de controle. Estas cartas de controle podem envolver o controle da curva analítica ou o controle do processo com amostras certificadas.
16. Neste experimento o objetivo é construir cartas de controle da curva analítica. Assim iremos construir cartas de controle para o ponto superior e para o ponto inferior.
17. Repita em sete replicatas os pontos 2 e 6 é registre as concentrações e absorbâncias na tabela 2
Tabela 2 - Dados de replicatas dos pontos 2 e 6
	Número do Balão
	Sol 2 (mL)
20,0µg/mL)
	Sol 3 (mL)
	Sol 4 (mL)
	Sol 5 (mL)
	Conc.
	Absorção
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,034
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,043
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,018
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,038
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,039
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,034
	2
	1,00
	4,00
	4,00
	8,00
	0,2
	0,039
	Média=
	0,2
	---------
	Desvio Padrão= 
	
	---------
 
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,0200
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,186
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,195
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,197
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,187
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,192
	6
	5,00
	4,00
	4,00
	8,00
	1,0
	0,190
	Média=
	1,0
	---------
	Desvio Padrão= 
	
	---------
Onde obtemos da regressão linear a curva y = 0,087x + 0,006 .
Ponto 2
	Amostras
	0,20 Abs
WI 510
	Conc 
µg de Fe/mL
	Conc
µg de Fe/mL
	
	
	
	Média
	S
	1
	0,034
	0,2
	0,2
	0,085792
	2
	0,043
	0,2
	
	
	3
	0,018
	0,2
	
	
	4
	0,038
	0,2
	
	
	5
	0,039
	0,2
	
	
	6
	0,034
	0,2
	
	
	7
	0,039
	0,2
	
	
Ponto 6 
	Amostras
	0,60 Abs
WI 510
	Conc 
µg de Fe/mL
	Conc
µg de Fe/mL
	
	
	
	Média
	S
	1
	0,200
	1,0
	1,0
	0,419043
	2
	0,186
	1,0
	
	
	3
	0,195
	1,0
	
	
	4
	0,197
	1,0
	
	
	5
	0,187
	1,0
	
	
	6
	0,1921,0
	
	
	7
	0,190
	1,0
	
	
ANÁLISE DAS AMOSTRAS
Podemos calcular as concentrações de ferro dos pontos a partir da equação de reta encontrada na regressão linear: y = 0,09x + 0,004.
Branco testemunha:
-0,006 = 0,09x + 0,004
x = 0,111 µg/mL
Ponto 1: 
0,033 = 0,09x + 0,004
x = 0,322 µg/mL
Ponto 2:
0,034 = 0,09x + 0,004
x = 0,333 µg/mL
Ponto 6:
0,195 = 0,09x + 0,004
x = 2,1222 µg/mL
	Pontos
	Abs
	Conc de Fe calculada
	
	Wl 510
	µg/mL
	Branco testemunha
	-0,006
	0,111
	1
	0,033
	0,322
	2
	0,034
	0,333
	6
	0,195
	2,122
– Dados das amostras
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO
· Validação da Curva Análitica
18. Para validar a curva analítica temos de calcular os limites baseados nas medidas das replicatas das concentrações da tabela 2.
19. Devemos também preparar uma solução do ponto 2 e uma solução do ponto 6 e o branco e fazer a leitura no espectrômetro de UV/Vis.
Tabela 3 – Validação da Curva Análitica – (Para balões vol. de 50ml)
	Equação da Reg Lin. curva analítica obtida da tabela 1 = ( y = 0,087x + 0,006)
	Numero do balão
	Solução 2 (ml)
	Solução 3 (ml)
	Solução 4 (ml)
	Solução 5 (ml)
	Concentração
	Absorção
	1 
	0
	2
	2
	4
	0
	0
	2
	0,5
	2
	2
	4
	0,4767586
	0,042
	Limite superior da variabilidade permitida Média + 3 x S = 0,590376
	Limite inferior da variabilidade permitida Média - 3 x S = 0,075624
	6
	2,5
	2
	2
	4
	2,30434483
	0,201
	Limite superior da variabilidade permitida Média + 3 x S = 3,3792129
	Limite inferior da variabilidade permitida Média - 3 x S = 0,864871
5. METODOLOGIA PARTE 2
· Determinação de Ferro em Medicamentos: 
21. medicamentos anti-anemia apresentam três concentrações de sulfato ferroso:
 Se medicamento com 25 mg/mL de Fe(II);
 Se medicamento com 50 mg/mL de Fe(II));
 Se medicamento com 125 mg/mL de Fe(II));
 Se comprimido de 250 mg de de Fe(II), triture e dilua para 1 L em água e siga do item 16.
22. Olhe o rotulo do medicamento e execute a diluição apropriada que deve ser feito para que o medicamento apresente a leitura dentro da faixa da curva analítica.
I. Se 25 mg mL-1 de FeSO4 dilua 100x. (1,0 ml 100 mL).
II. Se 50 mg mL-1de FeSO4 dilua 200x. (1,0 ml p/200 mL).
III. Se 125 mg mL-1de FeSO4 dilua 500x. (1,0 mL p/500 mL).
IV. Se comprimido use a solução preparada no item 14. 
Com esta diluição os três concentrações diferentes vão para a mesma concentração em torno de 0,250 mg/mL de Fe(II).
23. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes:
 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%;
 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
24. Completar o volume com água destilada.
25. Deixar em repouso por 10 minutos.
· Branco Testemunha:
Em alguns medicamentos podemos ter cores devido a adição de corantes e outras substâncias componentes da formulação ou mesmo substâncias que mudam o índice de refração e outros que poderam interferir no resultado do ensaio. O chamado Branco Testemunha tem por objetivo corrigir estas interferências que são características individuais de cada amostra.
26. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes:
 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%;
 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
 0 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
27. Completar o volume com água destilada.
28. Deixar em repouso por 10 minutos.
29. Para fazer os cálculos corrija a absorbância da amostra descontando o valor da absdorbância do Branco testemunha.
· Amostra dopada
Para demonstrar que os ensaios estão sendo feitos de forma correta uma das formas é fazer a recuperação de uma amostra dopada (Spike) de uma amostra. Neste caso se adiciona uma quantidade do padrão a uma das amostra e calculamos o valor da recuperação do material adicionado.
30. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes e 3 mL da solução item 2 (20 µg/mL) e: 
 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
31. Completar o volume com água destilada.
32. Deixar em repouso por 10 minutos.
33. Para fazer os cálculos corrija a absorbância da amostra descontando o valor da absdorbância do Branco testemunha.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO PARTE 2
Tabela 4 – Análise das amostras – Vol para balão de 50 mL.
	Número do balão
	Solução
 2 (mL)
	Solução 
3 (mL)
	Solução 
4 (mL)
	Solução 
5 (mL)
	Concentração
(µg/mL)
	Absorção
	Branco testemunha
	0,1 amostra + 0 mL sol 2
	2,00
	2,00
	0,00
	0,085954
	0,008
	Amostra
	0,1 amostra + 0 mL sol 2
	2,00
	2,00
	4,00
	1,476758
	0,129
	Abs AMOSTRA – Abs Branco Testemunha
	0,121
	Amostra
Dopada
	0,1 amostra +1,5 mL sol item 2
	2,00
	2,00
	4,00
	5,304344
	0,462
	Abs AMOSTRA DOPADA – Abs Branco Testemunha
	0,454
	Absorção Recuperação (Experado ao ponto 4) =
	0,042
34. Trate a curva analítica de padronização externa como feito na prática de padronização externa.
35. Antes de calcular as concentrações da amostra e da recuperação desconte o valor do Branco testemunha dos valores de absorção da amostra e da recuperação.
36. Calcule a concentração da amostra diluída e o erro da medida considerando a incerteza da curva analítica.
Através de regra de três simples, obtém-se os seguintes resultados: 
Massa molar de FeSO4 é 151,908 g/mol -------- comprimido de 40 mg
com massa molar 55,845 g/mol -------------------- x
massa de ferro encontrada foi = 14,704 mg.
250 mg de Fe -------- seria necessário para a diluição em 1L de água destilada
14,704 mg ------------ x 
O resultado encontrado foi = 58,8 ml de água. 
Para a concentração, que deverá ser encontrada no experimento: 
C= 14,704/58,8=0,245 mg/mL
Utilizando a equação da reta podemos achar a concentração substituindo o valor da absorbância da amostra em Y, como por exemplo: 
y = 0,087x + 0,006, com Y= 0,129; obtendo então concentração 1, 476758 µg/mL. 
37. Calcule a concentração da amostra e dopada com Fe(II) diluída e o erro da medida considerando a incerteza da curva analítica. 
38. Calcule a concentração da recuperação diluída e o erro da medida considerando a incerteza da curva analítica.
 Desconte o valor de concentração encontrado para amostra do valor encontrado da amostra dopada
Conc (recuperação) = Conc Am Dopada – Conc Amostra
 Calcule a recuperação em %:
% recuperação = Conc (recuperação) x 100 / Valor dopado* 
*Valor dopado é a conc do ponto 3 da curva.
Conc RECUPERAÇÃO = Conc AM DOPADA – Conc AMOSTRA
Conc RECUPERAÇÃO = 5,304 – 1,476= 3.827586 µg/mL
% recuperação = Conc recuperação / Valor dopado x 100 
% recuperação = 3,828 / 0,4 x 100 = 956,9% de recuperação da amostra. 
39. Calcular o resultado em mg de ferro por mL de medicamento.
Concentração1 ∙ Volume1 = Concentraçãoamostra∙ Volumeamostra
1,476 mL-1 ∙ 100mL Concentraçãoamostra ∙ 0,2mL
Concentraçãoamostra = 738 µg mL-1= 0,738 mg.mL-1
40. Calcule o erro relativo considerando o valor obtido como verdadeiro.
. 100
= 201,22%
41. Discuta a recuperação e que garantias de qualidade ela representa.
7. REFERENCIAS 
HARRIS, D.C.; Análise Química Quantitativa. 8ª edição, Rio de Janeiro: LTC, 2012, 898p.
SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a Edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
Gráfico dos Dados e a Regressão Linear
0	0.2	0.2	0.4	0.4	0.60000000000000031	0.60000000000000031	0.8	0.8	1	1	0	2.2000000000000006E-2	3.6000000000000011E-2	3.7000000000000012E-2	4.6000000000000013E-2	4.900000000000003E-2	5.0000000000000017E-2	7.3000000000000023E-2	8.0000000000000043E-2	9.9000000000000074E-2	9.9000000000	000074E-2	Concentração µg/mL
Abs