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UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS CURSO: FARMÁCIA DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Nome: Tiago de Souza Campos Soares RA: 2088930 Polo: Sumaré TÍTULO DO ROTEIRO: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS INTRODUÇÃO Em nosso dia a dia, e onde quer que estejamos, estamos sempre cercados por microrganismos, que podem nos trazer benefícios ou, então, serem bastante indesejados. Saber lidar com esses seres minúsculos deve ser o grande diferencial dos profissionais da área da saúde. A deterioração dos alimentos ocorre naturalmente por ação dos microrganismos que utilizam os nutrientes ali presentes como fonte de energia, sendo, portanto, elementos imprescindíveis para o crescimento celular. Ao se desenvolverem em um determinado alimento, os microrganismos desencadeiam modificações de cor, odor, sabor, textura e aspecto. Essas características representam o resultado não apenas da multiplicação indesejada do microrganismo em questão, mas também de transformações químicas influenciadas pelos seus produtos metabólicos. A deterioração microbiana é uma questão bastante preocupante para as indústrias do ramo, já que grandes perdas econômicas são relatadas anualmente. (ARANDA, SABO, 2021) Uma importante área da microbiologia de alimentos que veremos em aula é a contagem de bactérias heterotróficas da água, que são genericamente definidas como microrganismos que requerem carbono orgânico como fonte de nutrientes, fornece informações sobre a qualidade bacteriológica da água de uma forma ampla. O teste inclui a detecção, inespecífica, de bactérias ou esporos de bactérias, sejam de origem fecal, componentes da flora natural da água ou resultantes da formação de biofilmes no sistema de distribuição. Servindo, portanto, de indicador auxiliar da qualidade da água, ao fornecer informações adicionais sobre eventuais falhas na desinfecção, colonização e formação de biofilmes no sistema de distribuição. (DOMINGUES, et al, 2007) A presença de microrganismos nos alimentos está quase sempre associada a doenças, no entanto, é preciso sempre lembrar que existem muitas espécies de microrganismos que são utilizadas para se produzir alimentos, com especial destaque à espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae, para a produção de cervejas e de pão. As bactérias lácteas também merecem o devido destaque, visto que sem elas não teríamos o queijo e nem o iogurte que consumimos diariamente. (ARANDA, SABO, 2021). Aula: 1 Roteiro: 1 Título da Aula: Determinação de alguns fatores intrínseco em alimentos OBJETIVO: analisar dois fatores intrínsecos muito determinantes para a caracterização de um alimento: a atividade de água e a presença de substâncias, naturalmente, antimicrobianas. Prática de análise da atividade de água (Aa): Preparados 3 dessecadores e, adicionado a cada um deles, as seguintes soluções saturadas de sal, preparadas pelas auxiliares de laboratório: ● Ácido sulfúrico (Aa extremamente baixa = 0,00) ● Carbonato de potássio – K2CO3 (Aa moderada = 0,43) ● Sulfato de sódio – Na2SO4.10 H2O (Aa extremamente alta = 0,93) Adicionado a cada um destes béqueres, 5 g de amostras de bolacha de água e sal triturada, junto com o ácido sulfúrico e o sulfato de sódio e molho de tomate junto com o carbonato de potássio. Conclusão: Aa é a disponibilidade da água suscetível a ocorrer uma reação química, a bactéria também consome nutrientes de alimentos e isso gera uma reação química, quanto mais a Aa, mais o risco de contaminação microbiana. Quando um ambiente fica úmido, ele influencia na Aa do alimento, pois o alimento absorve a umidade, e com isso há aumento da Aa. Após 7 dias, verificamos a aparência dos alimentos, e a bolacha do dessecador com ácido sulfúrico apresentou estado de putrefação extrema, o material deteriorou e mudou completamente de cor, com pouca saturação. Já os dessecadores com carbonato de potássio e sulfato de sódio apresentaram maior saturação e presença visível de fungos. Prática de análise da presença de substâncias antimicrobianas naturais: Em uma placa de Petri, contendo o meio de cultura BHI, semeamos, com o auxílio de uma alça estéril, uma solução contendo a bactéria conhecida: Staphylococcus aureus previamente crescido em meio de cultura líquido BHI, fizemos movimentos em zigue-zague de forma que toda a superfície da placa foi coberta com a solução da bactéria em questão. Maceramos, em gral e pistilo o alho. Utilizamos também tomilho (desidratado), orégano (desidratado) e molho de tomate industrializado. Colocamos uma pequena porção das amostras de alimento sob a superfície do meio de cultura sólido cultivado com Staphylococcus aureus. Foi incubado em estufa bacteriológica a 35 °C por 24 – 48 horas, e verificamos o resultado na aula seguinte. Conclusão: Alguns alimentos utilizados nesta prática, inibiram o crescimento da cepa indicadora utilizada, pois houve ação bactericida natural, que foi o caso do alho. Após 7 dias, observamos que a presença de substância antimicrobiana natural foi possível observar apenas no alho, pois contém alicina (substância rica em compostos sulfurados). O alho, além de ação antimicrobiana, é antioxidante e anti-inflamatória, capaz de tratar infecção por fungos ou pressão alta. (ZANIN, 2021). Quanto ao tomilho (desidratado), orégano (desidratado) e molho de tomate industrializado, houve crescimento visível de bactérias, observamos até a presença de duas culturas diferentes de bactérias. Aula: 1 Roteiro: 2 Título da Aula: Produção de iogurte OBJETIVO: observar o processo de fermentação (nomenclatura usada em indústria de fermentação: mosto, inóculo, vinho, uso ou não de oxigênio). Discutir a fermentação lática. Para o primeiro processo de fermentação, adicionamos 2% de açúcar refinado a um frasco de iogurte (comprado em um supermercado) e colocado na estufa a 37 °C, por 1 hora, para a ativação dos microrganismos presentes no frasco (procedimento realizado pelas auxiliares de laboratório). Em um béquer, colocado 750 mL de leite para aquecer a 80 °C, durante 15 minutos, e resfriado, rapidamente, em banho de água fria (o aquecimento e resfriamento rápido é para um procedimento de pasteurização em pequena escala). Separamos 100 mL de leite pasteurizado em béquer (ainda quente) para dissolver 5g de gelatina completamente. Para o segundo passo do processo de fermentação, foi colocado no leite sacarose a 10% e adicionado 40 g de iogurte ativado (inóculo) quando a temperatura chegou a cerca de 40 ºC. Coberto o recipiente com papel alumínio, foi incubado em estufa a 37 °C, durante 1 hora, para auxiliar a fermentação. Conclusão: Fizemos o experimento com diferentes quantidades e concentrações de gelatina e de iogurte e uma primeira observação após 1 hora de estufa: Gelatina Iogurte Propriedades 1g 20g Pouco concentrado e pouca evidência de fermentação 3g 16g Levemente concentrado e pouca evidência de fermentação 5g 40g extremamente concentrado e com forte evidência de fermentação 7g 30g muito concentrado e com forte evidência de fermentação Alimentos como o iogurte ou o leite fermentado, por exemplo, são produtos metabólicos produzidos em uma fermentação láctica, onde, há o processo de pasteurização, que consiste em aquecer o produto em uma determinada temperatura, por um certo tempo e logo após, resfriá-lo. Este processo reduz o número de microorganismos que são nocivos para o organismo humano. Os produtos lácteos sofrem pasteurização e não podem ser esterilizados em autoclave (vapor úmido sob pressão), pois ocorre a desnaturação da proteína. Observação após 2 dias de estufa: Propriedades Controle de qualidade Cor esbranquiçada Sabor não avaliado Odorcheiro fraco de leite coalhado Textura alguns granulomas, dependeu da quantidade de gelatina As diferentes quantidades de gelatina influenciaram no resultado final, sendo que a amostra que apresentou melhor textura, fermentação, cor, e ótimo aspecto em geral foi a que colocamos 1g de gelatina e 20g de iogurte, as demais ficaram duras e com muitos granulomas, coalhou e até o soro ficou gelatinoso. Aula: 2 Roteiro: 1 Título da Aula: Destilação de garapa fermentada OBJETIVO: entender o processo de fermentação alcoólica. Comparar as várias fermentações alcoólicas: álcool combustível, pinga, cachaça, vinho e cerveja. A preparação da garapa com a levedura (fermento do tipo Fleischmann), foi feita pelas auxiliares de laboratório. Esse procedimento foi feito para a fermentação alcoólica. Removemos uma pequena quantidade do material retido na garrafa que acomodou a garapa e checamos a presença de leveduras, colocamos uma amostra em uma lâmina + azul de metileno + lamínula, realizando a análise em microscópio óptico. Presença de leveduras; Com o líquido filtrado, realizamos a destilação; Conclusão: O destilador faz com que a água, com o aquecimento, sofra ebulição, passando para o estado de vapor. Esse vapor é condensado, formando a água destilada. A solução, sendo destilada, precisa parar a destilação quando a temperatura atinge 100ºC, pois, quando se atinge essa temperatura a destilação para. É possível determinar a graduação alcoólica do produto obtido na destilação da garapa fermentada com um alcoometro (ou densímetro), onde se utiliza um termômetro com chumbo e mede-se sempre com um padrão de temperatura a 20°C. O objetivo da aula foi alcançado pois deixou claro o processo de fermentação alcoólica, que é necessário para haver a destilação e discutimos sobre as diversas bebidas alcoólicas fermentadas e destiladas e as não destiladas. Aula: 3 Roteiro: 1 Título da Aula: Análise Microbiológica da água: contagem padrão de bactérias heterotróficas por pour plate OBJETIVO: realizar o método de contagem microbiana, precisamente as bactérias aeróbias mesófilas, em amostras de água utilizando-se de técnicas de semeadura em profundidade (pour plate), além de saber interpretar os resultados obtidos, levando-se em consideração os parâmetros nacionais para a potabilidade de água. Contagem padrão de bactérias heterotróficas. Fizemos todo o procedimento proposto no roteiro. Conclusão: Ao final do período de incubação, fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias. Aprendemos o método de contagem de colônias de bactérias e técnicas de semeadura por profundidade, interpretamos os resultados e discutimos sobre os parâmetros nacionais para a potabilidade de água, que diz em seu art. 27, capítulo V, do padrão de potabilidade, § 1º No controle da qualidade da água, quando forem detectadas amostras com resultado positivo para coliformes totais, mesmo em ensaios presuntivos, ações corretivas devem ser adotadas e novas amostras devem ser coletadas em dias imediatamente sucessivos até que revelem resultados satisfatórios. Aula: 3 Roteiro: 2 Título da Aula: Análise microbiológica da água: detecção de coliformes fecais OBJETIVO: mostrar ao aluno a técnica de detecção de amostras de coliformes fecais em água. Inoculado uma série de 3 tubos contendo 10mL (concentração dupla), 9 mL e 9,9 mL do meio Caldo Lauril Triptose com, respectivamente, 10 mL de água, 1 mL de água e 0,1 mL de caldo BHI de Staphylococcus aureus. Incubado a 37 °C, por 48 horas. Conclusão: Tivemos um teste positivo, pois ficou turvo e soltou gases, indicando a presença de bactérias intestinais. Discutimos sobre a possível presença de Staphylococcus aureus, que é uma bactéria do grupo dos cocos gram-positivos que faz parte da microbiota humana, mas que pode provocar doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e furúnculos, até as mais graves, como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico e septicemia, entre outras, por isso a importância da detecção e controle da presença desses microrganismos patogênicos na água. As condições de moradia, como: esgoto a céu aberto, gado, e saneamento básico influenciam diretamente na contaminação. Aula: 4 Roteiro: 1 Título da Aula: Análise microbiológica de leites OBJETIVO: realizar a determinação do número de bactérias mesófilas em leite pasteurizado utilizando a técnica de semeadura de superfície. Fizemos todo o procedimento proposto no roteiro. Conclusão: O objetivo da aula foi atingido, praticamos a técnica de semeadura de superfície, determinamos e identificamos as bactérias mesófilas, que crescem no leite, e aprendemos a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias. Tais bactérias, crescem em meios anaeróbios, ou seja, fora da presença de oxigênio. Quando a contagem de bactérias passam de 1.000.000 é padronizado com “número incontável”, caso de um valor mais baixo, fazemos o nº de colônia / volume da amostra transferida para a placa. Aula: 4 Roteiro: 2 Título da Aula: Coloração de Gram OBJETIVO: A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada, dada a sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas. Em uma lâmina, pingamos uma gota de solução salina estéril, recolhemos uma colônia pré-cultivada com uma alça bacteriológica e colocamos a colônia selecionada junto à lâmina. Fixamos o esfregaço no calor, cobrimos o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto. Lavamos o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante, cobrimos o esfregaço com lugol por 1 minuto; Descoramos com álcool acetona até remover o excesso de corante. Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos, Lavamos e aguardamos secar. Conclusão: A técnica de coloração de gram é a mais usada na microbiologia. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelha são chamadas de Gram-negativas. Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringências e mobilidade. A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor (que foi utilizado na aula), o formol e o éter. A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. REFERÊNCIAS ARANDA, Kátia R. S.; SABO, Sabrina S. Microbiologia de alimentos. 1ed. São Paulo: Editora Sol, 2021. DOMINGUES, Vanessa O.; et al; Saúde, Santa Maria, vol 33, n 1: p 15-19, 2007 Métodos Físicos de Controle de Microorganismos, Disponível em: https://www.infoescola.com/microbiologia/metodos-fisicos-de-controle-de-microorgani smos/#:~:text=Este%20m%C3%A9todo%20foi%20desenvolvido%20por,mas%20n% C3%A3o%20assegura%20sua%20esteriliza%C3%A7%C3%A3o. Acesso em: 24/05/2022 6 benefícios do alho para a saúde e como usar, Disponível em: https://www.tuasaude.com/alho/amp/ PORTARIA Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011, Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/gm/2011/prt2914_12_12_2011.html Técnica de Gram Disponível em: http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-gram.html
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