12 estrategia geral de purificação

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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
PTN  50% p.s. cél
ESTRUTURA INDIVIDUAL
PRESENTES EM MISTURAS COMPLEXAS	
MOLÉCULAS FRÁGEIS
DIFÍCIL PURIFICAÇÃO
X
FÁCIL PURIFICAÇÃO
MUITAS TÉCNICAS	
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
OBJETIVO
Separar a enzima de interesse de outras proteínas contaminantes. 
Considerações importantes
O grau de purificação depende da finalidade da enzima.
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS: CRITÉRIOS 
Operações baseadas em propriedades físicas diferentes
Operações de maior volume realizadas no início do processo
Operações mais caras e sofisticadas feitas no final do processo
Avaliação permanente da facilidade de escalonamento das operações desenvolvidas em laboratório
Etapas do processo com o mínimo de complexidade possível
Avaliação dos processos de recuperação e purificação quanto:
 FATOR DE PURIFICAÇÃO
 RENDIMENTO
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS: 
ESTRATÉGIA GERAL
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS: 
ESTRATÉGIA GERAL
SELEÇÃO DA FONTE PROTÉICA: 
Considera básicamente a facilidade de obtenção e a quantidade obtida.
 
Ex: microrganismo  clonagem
 maiores quantidades que tecidos animais ou vegetais (até 40% ptn)
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
Para protéína citossólica
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
Para proteína de membrana ou mitrocondrial
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
MÉTODOS UTILIZADOS
 FÍSICOS: fragmentação do envoltório celular
PRESSÃO - escala de laboratório
HOMOGENEIZAÇÃO - para organismos unicelulares. 
MOENDA - suspensão de células e uma substância abrasiva. Geram calor e normalmente são enjaquetados
ULTRA SOM - escala de laboratório
CONGELAMENTO E DESCONGELA-MENTO (- 20ºC) = formação e desapare-cimento de cristais de gelo rompendo a célula
CHOQUE OSMÓTICO - geralmente para bactérias. Sacarose (20%) penetra na célula e a rompe 
SOLUBILIZAÇÃO:
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
MÉTODOS UTILIZADOS
 FÍSICOS: fragmentação do envoltório celular
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
MÉTODOS UTILIZADOS
 QUÍMICOS:digestão do envoltório celular
TRATAMENTO ALCALINO - NaOH pH 11-12,5/20 min
DETERGENTES
SOLVENTES ORGÂNICOS - etanol, metanol, isopropanol,...
Não são muito utilizados pois as condições são muito drásticas. 
Só para enzimas muito resistentes
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
MÉTODOS UTILIZADOS
 ENZIMÁTICOS:digestão do envoltório celular. Custo elevado
ENDÓGENO (AUTÓLISE) - induzida por diminuição da atividade da água
 EXÓGENO - pela adição de enzimas externas
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
ESTRATÉGIA GERAL
SOLUBILIZAÇÃO:
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TÉCNICA EXEMPLO		RESULTADO
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lise	 	 eritrócitos		 ruptura da membrana celular
osmótica 				 por choque osmótico
-----------------	digestão		bactérias 		 lise da parede celular, 
enzimática 	tratamento 	 possibilitando a ruptura osmótica 
 	com lisozima da membrana celular
lubilização 	solubilização 	levedura		 solubilização parcial de parede e 
química/		 extração	 membrana celular, liberação de enzimas
autólise com tolueno líticas que completam o processo
homogenei-	fígado		 células forçadas através de espaços
zador manual estreitos levando à ruptura da mem-
de tecido brana celular
Homogenei- 	músculo, tecidos	 ruptura celular por corte e 
zador de 		animais ou 	 cisalhamento
lâminas		 vegetais
moagem com 	células/tecidos	 ruptura da parede celular abrasivos		 vegetais, bacté- 	 pelo atrito
			rias e leveduras
Prensa 		células/tecidos	 rompimento das células forçadas	
de French		vegetais,		 por pequeno orifício sob alta
e leveduras 	 bactérias		 pressão de cisalhamento
Ultrasom suspensões	 ruptura por cisalhamento 
de células		 cavitação
----------------	Agitação com 	suspensões de	 ruptura de parede celular devido
Pérola de		células		 à rápida vibração e choque com
vidro						 pérola de vidro
desintegra- 	suspensões de 	 semelhante à prensa de células dor (Manton-	células			 French, em grande escala
Gaulin)	
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
 ESTRATÉGIA GERAL
ESTABILIZAÇÃO: Controle feito em cada etapa do processo para manter a função/atividade da molécula: pH, T, proteases, etc
Cuidados para evitar a perda de atividade durante a purificação de enzimas
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origem da perda		chance de 		fonte de obtenção		cuidados
de atividade			ocorrência		da enzima			preventivos
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exposição a calor		comum			animal, vegetal		baixa
							ou microbiana			temperatura
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presença de			comum			animal, vegetal 		inibidores
próteses						ou microbiana			temperaturas
											baixas, rapidez
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agentes oxidantes		comum			animal, vegetal ou		agentes									microbiana			redutores
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Perda de estabilizantes	comum			animal, vegetal ou		reposição do								microbiana			estabilizante 
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Diluição			comum			animal, vegetal ou		concentração	
							Microbiana			rápida
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presença de inibidores		pouco			plantas, bactérias		separação do
específicos			comum							inibidor
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 metais pesados		pouco 			animal, vegetal ou		uso de 
					comum			microbiana			quelantes
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS:
 ESTRATÉGIA GERAL
ENSAIO: 
Controle feito em cada etapa do processo para verificar a presença da molécula de interessse
	Deve ser: 
- Específico
- quantitativo
PARA ENZIMAS: testes onde há formação de produto que pode ser quantificado ( por absorção, fluorescência, titulação, ....). Normalmente são necessárias reações acopladas.
PARA PROTEÍNAS QUE NÃO SÃO ENZIMAS: 
Resposta Biológica: 
 Ex: hormônios  sinal  efeito (detecção demorada)
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PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS: 
ESTRATÉGIA GERAL
Uso De Anticorpos: 
PRECIPITAÇÃO DIRETA por anticorpos específicos
RADIO IMUNO ENSAIO por competição entre a preparação protéica e um padrão com marcação radioativa, pela ligação com o anticorpo
TESTE ELISA = ENZYME-LINKED IMMUNO SORBANT ASSAY
1. Imobilização do primeiro anticorpo em suporte sólido  anticorpo contra a proteína de interesse.
2. Incubação com a amostra contendo a proteína, em condições que o anticorpo se liga a proteína.
3. Adição de um segundo anticorpo ligado covalentemente a uma enzima que pode ser ensaiada  o complexo (2) é mais reativo com o segundo anticorpo.
4. Lavagem e ensaio da enzima  cuja [ ] será proporcional à [ ] de anticorpo.
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TESTE ELISA
 ENZYME-LINKED IMMUNO SORBANT ASSAY
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Diagnóstico da infecção pelo HIV