Inativação de macromoléculas nos diferentes níveis de organização biologica

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Radiobiologia e Fotobiologia – Prof. Alvaro Leitão (IBCCF-UFRJ) 
 
CAPÍTULO V 
 
A INATIVAÇÃO NOS DIFERENTES NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO 
BIOLÓGICA 
 
A INATIVAÇÃO DE MACROMOLÉCULAS 
 
 As radio e fotolesões produzidas em macromoléculas podem acarretar a perda da atividade 
biológica destas, ou seja, sua inativação. Em experimentos visando à avaliação deste fenômeno é usual 
expor preparações de determinada macromolécula a diferentes doses de radiação, determinando, após 
cada dose, a atividade remanescente da preparação. Esta é a curva de inativação da macromolécula 
em estudo que, quase sempre, é construída em papel semilogarítmico, assinalando-se as doses no eixo 
das abcissas (escala linear) e a percentagem de moléculas ainda ativas no das ordenadas (escala 
logarítmica). Este tipo de representação justifica-se por ser bastante frequente a obtenção experimental 
de curvas exponenciais, que se transformam em retas quando adotado um gráfico semilogarítmico. 
 A determinação da perda radioinduzida da atividade de uma enzima é expressa pelo 
desaparecimento progressivo, em função da dose, de sua capacidade de catalisar a modificação do 
respectivo substrato. Na Figura V.1 pode ser vista a curva de inativação de uma preparação de 
ribonucleases (RNase). 
 
 
Figura V.1 - Representação esquemática da curva de inativação de uma preparação de RNase exposta às 
radiações , em presença ou em ausência de oxigênio. 
 
 A perda da atividade biológica de moléculas de DNA, em consequência da irradiação, pode ser 
avaliada por diversos esquemas experimentais, fundamentados no desaparecimento da capacidade desta 
macromolécula de codificar para determinadas funções biológicas. Um dos procedimentos utilizados 
para este fim emprega o fenômeno da transformação bacteriana, que consiste na possibilidade de uma 
bactéria, desde que esteja em um determinado estado fisiológico, conhecido como estado de 
competência, capturar um fragmento de DNA do meio extracelular e incorporá-lo ao seu patrimônio 
genético, modificando suas características fenotípicas (tornando-se, por exemplo, resistente a certo 
antibiótico). Preparações de DNA transformante expostas às radiações perdem sua capacidade de 
modificar o conteúdo informacional de uma bactéria, como pode ser visto na Figura V.2. 
 Outros procedimentos experimentais para medir a inativação de preparações de DNA consiste 
em irradiar estas preparações e medir a perda da capacidade de transfecção de algum marcador contido 
no DNA de um vírus, ou do DNA de plasmídeos e medir a perda da capacidade de plasmidização, ou 
de plasmídeos sexuais e medir a perda da capacidade de sexodução. 
 
 
 
 
V-2 
 
Figura V.2 - Transformação bacteriana e inativação radioinduzida do DNA transformante. 
A - Representação esquemática da transformação bacteriana; B - curva de inativação, pela radiação, do 
DNA transformante. 
 
A INATIVAÇÃO DE VÍRUS 
 
 Um vírus pode ser considerado como um "pacote" de ácido nucleico (DNA ou RNA, mas 
somente um deles), dotado de capacidade infecciosa e transportando informações genéticas, envolvido 
por uma capa proteica. Não possuindo metabolismo próprio, ele é inteiramente dependente das reações 
bioquímicas que ocorrem no interior da célula que infecte, designada como célula hospedeira. 
 Nos vírus contendo DNA este apresenta-se, quase sempre, em dupla hélice, mas pode também 
existir em cadeia única, como acontece com o do fago X174. No interior da capa podem existir 
algumas moléculas proteicas, as proteínas internas, que desempenham papel fundamental nos 
processos iniciais da replicação viral. 
 A multiplicação de um fago contendo DNA (como o fago T2, por exemplo), em uma bactéria, 
abrange as etapas esquematicamente mostradas na Figura V.3, e que são: 
 a) adsorsão, na qual o fago, por meio das fibras de sua cauda, se liga a receptores específicos da 
parede bacteriana; 
 b) injeção, consistindo na penetração do ácido nucleico viral; 
 c) síntese de RNA mensageiro específico do fago e sua tradução, nos polissomos da célula, em 
proteínas (precoces), uma das quais responsável pela destruição do cromossomo bacteriano; 
 d) replicação do ácido nucleico viral e síntese de capas proteicas; 
 e) "empacotamento" do DNA viral no interior das capas protéicas; 
 f) lise da célula bacteriana, (mediada pela lisozima neossintetizada obedecendo às informações 
contidas no DNA viral), resultando na liberação de centenas de fagos no meio de cultura. 
 Alguns tipos de fagos, como o T2, T4, e T6, que infectam a bactéria E. coli, só são capazes de 
produzir a resposta lítica, que acaba de ser analisada; outros, entretanto, conhecidos como fagos 
temperados, podem, em certas circunstâncias, em vez de lisar a célula hospedeira, produzir o 
fenômeno da lisogenização, que consiste na incorporação do DNA viral ao cromossomo bacteriano, no 
qual se mantém em uma espécie de estado latente, replicando-se sempre que o cromossomo se divide, 
como mostrado na Figura V.4. As bactérias que possuem um DNA viral incorporado ao seu 
cromossomo (isto é, que possuem um profago), são denominadas bactérias lisogênicas; o equilíbrio 
assim surgido pode ser rompido, espontaneamente ou pelo tratamento das células com agentes físicos 
(como radiações) ou químicos (como substâncias mutagênicas ou cancerígenas), processo este 
denominado de indução lisogênica. 
 
 
 
 
 
V-3 
 
Figura V.3 - Bacteriófago T2 e seu ciclo de replicação. 
A - representação esquemática do bacterófago; B - ciclo de replicação do fago, conduzindo à lise da célula 
hospedeira e à liberação de partículas virais no meio. 
 
Figura V.4 - Lisogenização de uma bactéria por um fago temperado. 
 
 Bacteriófagos que contenham DNA em hélice simples ou que possuam RNA como material 
genético replicam-se utilizando vias bioquímicas ligeiramente distintas da que foi vista acima, pois 
exigem atividades polimerásicas específicas para seus ácidos nucleicos; frequentemente as proteínas 
internas permitem, nestes casos, a formação de uma molécula adequada aos processos de transcrição e 
replicação semiconservativa, embora também haja necessidade de síntese de novas polimerases no 
interior da célula infectada. 
 A determinação do número de fagos ativos em uma preparação pode ser feita por meio de 
esquemas experimentais como o mostrado na Figura V.5. Para este fim, a preparação de fagos deve 
ser inicialmente diluída, por possuir, em geral, números extremamente elevados de partículas ativas 
(alguns bilhões de fagos por mililitro), após o que, uma alíquota é misturada com um excesso de 
bactérias sensíveis ao vírus (bactérias indicadoras). Após uma rápida incubação, para permitir a 
adsorsão, a mistura de fagos e bactérias é adicionada a um volume reduzido de meio de cultura, 
contendo ágar-ágar, mantido liquefeito a 46C, e todo o conjunto vertido na superfície de uma placa de 
Petri na qual existe meio de cultura solidificado com ágar-ágar. A placa é conservada em estufa a 37
C, por várias horas (15 no mínimo) e então é procedida a observação visual. Cada célula bacteriana não 
infectada (o que constitui a situação mais frequente) sofre uma série de divisões, dando origem a uma 
colônia; estas colônias ficam tão próximas umas das outras (dado o excesso de bactérias utilizado) que 
formam um verdadeiro "tapete" bacteriano; nas regiões onde existia uma bactéria infectada (centro 
infeccioso) ocorre a replicação viral e, ao fim de algum tempo (1 hora) a bactéria lisa, liberando 
centenas de fagos, que infectam as bactérias vizinhas, reproduzindo o ciclo. Logo, ao final da 
incubação na estufa, o tapete de bactériasapresenta uma série de zonas circulares claras, os centros de 
 
 
V-4 
lise ("plaques"), cujo número coincide com o de vírus ativos existentes na alíquota que foi plaqueada 
(Figura V.6). 
 Se a preparação de bacteriófagos tiver sido irradiada, a aplicação desta técnica permite 
determinar, após cada dose, a fração de fagos ainda ativos e, consequentemente, obter a curva de 
inativação, como mostrado na Figura V.5C. 
 
Figura V.5 - Esquema experimental para determinação do número de fagos ativos em uma preparação e 
curva de inativação pelas radiações UV. 
A - uma preparação de fagos, após conveniente diluição, teve uma alíquota misturada com um excesso de 
bactérias sensíveis ao vírus (bactérias indicadoras) e, depois da adsorsão, a mistura foi adicionada a 3 ml de 
meio de cultura contendo ágar-ágar liqüefeito a 46C, sendo o conjunto vertido em placa de Petri contendo 
meio de cultura gelosado; após 15 horas de incubação a 37C, o número de centros de lise foi contado; B - 
representação esquemática de uma placa, com o tapete de bactérias e os centros de lise; C - curva de 
inativação de uma preparação de fagos irradiada com UV. 
 
Figura V.6 – Fotografia de uma Placa de Petri contendo centros infecciosos. 
 
Técnicas semelhantes às utilizadas com bacteriófagos permitem a obtenção de curvas de 
inativação de vírus capazes de infectar células animais ou vegetais. Entre estes últimos, o do mosaico 
do tabaco foi bastante estudado, tendo sido verificado que o espectro de ação para sua inativação 
apresenta dois picos, em 260 e 280 nm, este último sugerindo a participação de lesões da capa proteica 
na perda da capacidade infecciosa. 
 A possibilidade do cultivo de células animais propiciou condições para o estudo foto e 
radiobiológico de inúmeros vírus que as infectam, vários dos quais responsáveis por doenças de grande 
importância médico-social (como é o caso do vírus herpes), enquanto outros parecem participar dos 
processos de transformação neoplásica em diversas espécies animais. 
 
A INATIVAÇÃO DE CÉLULAS 
 
 Na maior parte dos trabalhos realizados sobre efeitos de radiações em células são empregadas 
culturas bacterianas, especialmente de E. coli, visto estas serem quase destituídas de riscos patogênicos, 
de fácil cultivo em laboratório e relativamente conhecidas sob o ponto de vista genético. Uma célula de 
 
 
V-5 
E. coli é cerca de 500 vezes menor que uma célula animal ou vegetal, possuindo massa próxima de 
2x10
-12g. 
 A massa molecular do DNA de E. coli é próxima de 3x10
9 daltons, suficiente para conter 
informações que codificam cerca de 4.000 espécies de proteínas, 1/3 das quais já identificadas, o que 
faz deste organismo o melhor conhecido, atualmente, sob os aspectos bioquímicos ou genéticos. 
 Conforme a composição do meio de cultura no qual se encontre, uma célula de E. coli se divide 
a cada 20 ou 30 minutos (tempo de geração). A técnica de cultivo consiste na transferência de uma 
aliquota de uma cultura para um frasco ou tubo contendo meio adequado; durante algum tempo, não 
ocorre divisão celular, cada bactéria acumulando substâncias indispensáveis aos seus processos 
metabólicos, o que constitui a fase de adaptação, em seguida, as células começam a se dividir e o 
número de bactérias por mililitro aumenta rapidamente (fase exponencial); após algum tempo nestas 
condições, a velocidade de divisão começa a diminuir, até cessar inteiramente, o que caracteriza a fase 
estacionária. Se a cultura for mantida por mais algum tempo à temperatura de 37C, as células se 
inativam progressivamente. Na Figura V.7 pode ser vista a representação esquemática da curva de 
crescimento de uma cultura bacteriana. 
 
Figura V.7 - Representação esquemática da curva de crescimento de uma cultura bacteriana. 
A - fase de adaptação; B - fase exponencial; C - fase estacionária. 
 
 Em um meio solidificado pela adição de ágar-ágar, uma célula, após certo tempo dá origem a 
duas, estas a quatro e assim por diante, de tal forma que, depois de uma noite de incubação em estufa a 
37C, no local onde havia uma célula isolada passa a existir uma colônia, visível a olho nu e possuindo 
cerca de 10 milhões de células (Figura V.8). 
 
Figura V.8 – Fotografia de uma placa de Petri contendo colônias bacterianas. 
 
 A construção da curva de inativação de uma cultura de determinada cepa bacteriana é bastante 
simples: após cada dose, uma aliquota da cultura em meio liquido, convenientemente diluída, é 
plaqueada em meio gelosado (contendo ágar-ágar) e, após incubação das placas a 37C por várias 
horas, as colônias formadas são contadas e os resultados expressos pela relação entre o número N de 
células viáveis (isto é, capazes de formar colônias) após cada dose e o número inicial de células No. Na 
Figura V.9 pode ser vista uma representação esquemática da metodologia empregada para a 
construção de uma curva de sobrevivência, (curva de inativação) bem como a curva assim obtida. 
 
 
V-6 
 Técnicas análogas às utilizadas em experimentos com bactérias podem ser empregadas para a 
análise dos efeitos das radiações em células eucarióticas, inclusive de mamíferos. Protozoários e 
leveduras, por exemplo, constituem organismos de fácil cultivo, sendo bastante simples a obtenção de 
moléculas marcadas com precursores radioativos e a consequente análise dos foto e radioprodutos e 
dos mecanismos de reparação e mutagênese. 
 
Figura V.9 - Representação esquemática da metodologia para obtenção da curva de sobrevivência de uma 
cultura bacteriana e da curva assim obtida. 
 
 Particularmente importantes têm se mostrado os experimentos visando ao estudo do efeito das 
radiações em células de mamíferos. Os primeiros trabalhos foram realizados mediante o emprego de 
culturas de tecidos, que se multiplicavam em meios bastante complexos ou em extratos de embriões. A 
dissociação das massas tissulares por tratamentos com enzimas proteolíticas, como a tripsina, tornou 
possível a obtenção de células isoladas, capazes de se dividir em meios de cultura adequados, dando 
origem às chamadas culturas primárias; células provenientes destas culturas multiplicam-se aderidas a 
uma superfície, formando uma monocamada celular. 
 Na maior parte dos casos, as culturas primárias não podem ser mantidas indefinidamente; após 
certo número de mitoses (entre 20 e 100, conforme a natureza da célula), elas não mais se dividem, 
sendo interessante observar que este número máximo é equivalente ao que seria encontrado durante o 
período médio de vida do animal do qual elas foram obtidas. Mas existem algumas linhagens celulares 
que conseguem ultrapassar tal "duração crítica", adquirindo a capacidade de se multiplicarem 
indefinidamente, como ocorre com as incluídas na Tabela V.1, muitas das quais possuidoras de um 
número anormal de cromossomos (aneuplóides). Entre tais linhagens, conhecidas como linhagens 
estabelecidas algumas podem se multiplicar mesmo quando não aderidas a superfícies, isto é, podem se 
dividir em suspensão. 
TABELA V.1 
 
Características de algumas linhagens estabelecidas de células eucarióticas 
 
=============================================================================== 
Denominação Espécie Origem (tecido) Morfologia 
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 
3T3 camundongo endotelial fibroblasto 
L camundongoconjuntivo fibroblasto 
CHO hamster chinês ovário epitelial 
BSC macaco rim epitelial 
HeLa humana tumor de colo de útero epitelial 
KB humana tumor de nasofaringe epitelial 
=============================================================================== 
 
 
 
V-7 
 Células de tumores neoplásicos se dividem formando massas irregulares, como mostrado na 
Figura V.10, o que contrasta com as células normais, que formam películas organizadas em camada 
única; às primeiras parece faltar uma propriedade, a inibição de contato, responsável pelo bloqueio da 
divisão celular quando as células ficam muito próximas umas das outras. Aliás, a perda de afinidade 
entre células parece acompanhar a transformação neoplásica; assim, por exemplo, se dois fragmentos, 
um de fígado, outro de rim, forem tratados com tripsina e as células obtidas misturadas, em ausência da 
enzima, elas tenderão a se reagrupar como originalmente, isto é, formando fragmentos de tecido 
hepático e tecido renal, o que não ocorre com células tumorais. 
 
Figura V.10 - Representação esquemática da multiplicação de células normais e neoplásicas em uma 
superfície sólida. 
 
 O tempo necessário para a divisão de uma célula eucariótica (tempo de geração), sob condições 
ótimas de nutrição e a 37C, é de muitas horas (18 a 24). O ciclo de divisão celular costuma ser 
dividido em quatro fases: M (período de mitose), G1 (período que antecede à replicação do DNA), S 
(período de síntese do DNA) e G2 (período entre a síntese do DNA e a mitose), sendo a duração destas 
fases bastante variável, conforme a linhagem considerada. 
 Para estudos, no nível molecular, com células de mamíferos, inclusive para análise da 
sensibilidade ao longo do ciclo mitótico, é frequentemente necessário trabalhar com populações 
sincronizadas, de forma que todas as células encontrem-se em uma mesma etapa do ciclo. Diversos 
métodos têm sido utilizados com este objetivo, entre os quais merece especial menção o baseado na 
variação do grau de adesão a superfícies sólidas, conforme o período no qual se encontre a célula; 
células na fase M são muito menos ligadas à superfície que as que se encontrem em outras fases, o que 
permite, mediante agitação da preparação, isolá-las com facilidade. 
 Substâncias que inibam a síntese de DNA têm sido bastante utilizadas para a obtenção de 
populações celulares sincronizadas; entre elas a timidina em concentrações elevadas, a hidroxiuréia e a 
afidicolina, as duas primeiras agindo sobre a síntese de precursores do DNA e a última inibindo a ação 
da DNA-polimerase  das células de mamíferos. 
 Na Figura V.11 pode ser vista a ação da hidroxiuréia em uma cultura de células eucarióticas, 
substância que produz dois efeitos distintos, quais sejam a inativação das células que estejam 
sintetizando DNA e um bloqueio ao final da fase G1; assim, após a adição deste composto, todas as 
células que estejam nos períodos G2, M e G1, continuarão o ciclo mitótico até o final de G1, sendo 
inativadas as que estejam na fase S; se a droga for então removida, todas as células iniciarão, 
sincronizadamente, o período S. 
 Para a obtenção de uma curva de sobrevivência de células de mamíferos, é necessário distribuí-
las, bastante diluídas, de forma que elas fiquem isoladas; após algumas horas, com as células já aderidas 
à superfície, o meio é removido e após adição de uma solução tamponada as células são irradiadas. 
Depois o meio é recolocado e as placas conservadas em estufa a 37C, por vários dias, com 
substituições regulares do meio. Após este tempo, as células são coradas e então contadas as colônias 
visíveis a olho nu, cada uma contendo em geral mais de 50 células. Na Figura V.12, podem ser vistas 
curvas de sobrevivência para algumas linhagens de células eucarióticas, irradiadas com UV ou com 
raios X. 
 
 
 
V-8 
 
Figura V.11 - Sincronização de células eucarióticas em cultura pela hidroxiuréia. 
A - Cultura não sincronizada, cada círculo cheio simboliza uma célula; B - a adição de hidroxiuréia produz 
a inativação das células que estavam na fase S (círculos vazios) e produz um bloqueio entre G1 e S; C - a 
remoção da hidroxiuréia faz com que todas as células entrem, sincronizadamente, na fase S. 
 
Figura V.12 - Curvas de sobrevivência de algumas linhagens de células eucarióticas. 
A - irradiadas com UV; B - irradiadas com raios X. 
 
A validade destas curvas foi bastante controvertida no passado, pois diversos autores 
acreditavam que elas não fossem superponíveis às que seriam obtidas se as células fossem irradiadas in 
situ, isto é, inseridas no próprio tecido do organismo. Estas dúvidas só foram dissipadas quando do 
advento de técnicas capazes de permitir a irradiação e a determinação da sobrevivência in situ, sendo os 
resultados, coincidentes com os observados em culturas de células. 
 Um dos métodos empregados com este objetivo é o chamado ensaio por diluição, que se 
fundamenta na determinação do número médio de células que devem ser injetadas em um animal para 
produzir uma determinada resposta. (o aparecimento de um tumor, por exemplo). Para sua melhor 
compreensão é interessante considerar uma situação concreta, como a mostrada na Figura V.13. 
 
 
 
 
V-9 
 
 
Figura V.13 - Representação esquemática do ensaio por diluição para obtenção de curvas de sobrevivência 
de mamíferos in situ. 
A - diferentes quantidades de células tumorais obtidas de um animal foram injetadas em diversos lotes de 
animais, sendo determinado o número de células capazes de produzir tumores em 50% dos casos; B - 
mesmo procedimento, sendo injetadas células obtidas de animais irradiados. 
 
Camundongos de uma determinada cepa podem desenvolver, espontaneamente, certo tipo de 
tumor; quando células tumorais são injetadas na cavidade peritoneal de outros animais, surgem tumores 
análogos. Se experimentos forem realizados com números variáveis de células injetadas torna-se 
possível saber quantas células são necessárias para produzir tumores em 50% dos animais (3, no 
exemplo mostrado na figura). Posteriormente os animais são irradiados com determinada dose e o 
procedimento experimental é repetido, verificando-se ser necessária a injeção de um número bem maior 
de células tumorais para produzir resposta positiva em 50% dos animais (32 no caso). Logo, o mesmo 
efeito é obtido com 3 células não irradiadas ou com 32 irradiadas, o que significa dizer que a dose 
empregada deixa uma fração de sobrevivência igual a 3/32, ou 0,094 ou 9,4x10
-2
. 
 
 
V-10 
 Diferentes formatos de curvas de sobrevivência podem ser obtidos com diferentes tipos 
celulares. Normalmente quando as curvas apresentam um "ombro ou patamar", isto é são sigmóides, 
significa que as células em questão têm sistemas de reparação funcionantes e o pequeno número de 
lesões produzidas em baixas doses é reparado eficientemente, não acarretando inativação perceptível. 
Quando as curvas não apresentam ombro, isto é são exponenciais, um ou mais sistemas de reparação 
não está atuando ou não existe nestas células e a inativação pode ser detectada mesmo para baixas 
doses.