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CENTRO UNIVERSITÁRIO FAVENI BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR GUARULHOS – SP 2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 5 2 ESTRUTURA E FUNÇÃO DA CÉLULA .................................................................. 6 2.1 A célula e sua membrana plasmática ................................................................. 9 2.2 Organelas celulares e suas funções ................................................................. 12 2.2.1 Endossomos ..................................................................................................... 14 2.2.2 Aparelho de Golgi ............................................................................................. 14 2.2.3 Lisossomos.... ................................................................................................... 15 2.2.4 Peroxissomos ................................................................................................... 16 2.3 O núcleo e seus componentes.......................................................................... 16 3 ESTRUTURA DA MEMBRANA PLASMÁTICA ..................................................... 19 3.1 Estrutura das membranas plasmáticas ............................................................. 20 3.1.1 Lipídios.............................................................................................................. 21 3.1.2 Proteínas......... .................................................................................................. 22 3.2 Organização da membrana plasmática ............................................................ 26 4 MITOCÔNDRIA: CONVERSÃO ENERGÉTICA E RESPIRAÇÃO CELULAR ...... 27 4.1 Morfologia e funções da mitocôndria ................................................................ 27 4.2 Duas membranas, dois compartimentos mitocondriais ..................................... 28 4.3 DNA mitocondrial .............................................................................................. 29 4.4 Biogênese mitocondrial ..................................................................................... 30 4.5 Funções da mitocôndria .................................................................................... 31 4.6 Respiração celular ............................................................................................ 32 4.7 Glicólise ............................................................................................................ 33 4.8 Energia celular .................................................................................................. 35 5 DIVISÃO CELULAR: MITOSE E MEIOSE ............................................................ 37 5.1 O ciclo e a divisão celular ................................................................................. 37 5.2 Mitose, meiose e citocinese .............................................................................. 38 5.2.1 Mitose........... .................................................................................................... 38 5.2.2 Meiose.............. ................................................................................................ 39 5.2.3 Citocinese.......... ............................................................................................... 40 5.3 Etapas da mitose e da meiose .......................................................................... 41 5.3.1 Mitose........... .................................................................................................... 41 3 5.3.2 Meiose.......... ................................................................................................... 42 6 BIOLOGIA MOLECULAR: SEQUENCIAMENTO DE DNA ................................... 43 6.1 Métodos de sequenciamento de DNA .............................................................. 43 6.1.1 Método enzimático de Sanger .......................................................................... 44 6.1.2 Métodos de nova geração ................................................................................ 45 6.2 Estratégias para sequenciamento de genomas ................................................ 46 6.3 Genômica: análise de genomas ........................................................................ 49 6.3.1 Montagem de genomas .................................................................................... 49 6.4 Anotação de genomas ...................................................................................... 50 6.5 Bancos de dados de sequências de DNA ......................................................... 50 7 ORIGEM DA BIOTECNOLOGIA ........................................................................... 52 7.1 Biotecnologia e origens ..................................................................................... 52 7.2 O marco biotecnológico .................................................................................... 53 7.3 Fatos históricos e a biotecnologia ..................................................................... 53 7.4 Aplicabilidades da biotecnologia ....................................................................... 55 7.5 Benefícios da biotecnologia na saúde .............................................................. 56 8 ENGENHARIA GENÉTICA ................................................................................... 57 8.1 Tecnologia do DNA recombinante .................................................................... 58 8.2 Organismos geneticamente modificados (OGMs) ............................................ 61 8.3 Terapia gênica: princípios e aplicações ............................................................ 62 9 CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA E DIFERENCIAÇÃO CELULAR ........... 64 9.1 Sítios de controle da transcrição gênica ........................................................... 64 9.2 Expressão gênica em procariotos e eucariotos ................................................ 65 9.2.1 Procariotos..... ................................................................................................... 65 9.2.2 Eucariotos....... .................................................................................................. 66 9.2.3 Transcrição..... .................................................................................................. 66 9.3 Diferenciação Celular ........................................................................................ 67 10 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DOENÇAS GENÉTICAS E INFECCIOSAS ... 68 10.1 Principais técnicas de biologia molecular utilizadas para diagnósticos ............. 69 10.2 Técnicas diagnósticas associadas às patologias .............................................. 70 10.3 Contribuições da biologia molecular no diagnóstico de doenças ...................... 73 11 BIOLOGIA E EDUCAÇÃO .................................................................................... 77 11.1 A profissão de biólogo na área de ensino ......................................................... 80 4 11.2 O professor biólogo e a educação ambiental .................................................... 80 11.3 Projetos de conscientização ambiental nas escolas ......................................... 81 11.4 A docência no ensino básico ............................................................................ 82 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 86 5 1 INTRODUÇÃO Prezado aluno! O Grupo Educacional FAVENI, esclarece que o material virtual é semelhante ao da sala de aula presencial. Emuma sala de aula, é raro – quase improvável - um aluno se levantar, interromper a exposição, dirigir-se ao professor e fazer uma pergunta, para que seja esclarecida uma dúvida sobre o tema tratado. O comum é que esse aluno faça a pergunta em voz alta para todos ouvirem e todos ouvirão a resposta. No espaço virtual, é a mesma coisa. Não hesite em perguntar, as perguntas poderão ser direcionadas ao protocolo de atendimento que serão respondidas em tempo hábil. Os cursos à distância exigem do aluno tempo e organização. No caso da nossa disciplina é preciso ter um horário destinado à leitura do texto base e à execução das avaliações propostas. A vantagem é que poderá reservar o dia da semana e a hora que lhe convier para isso. A organização é o quesito indispensável, porque há uma sequência a ser seguida e prazos definidos para as atividades. Bons estudos! 6 2 ESTRUTURA E FUNÇÃO DA CÉLULA Todos os seres vivos são constituídos por células (menos os vírus). As células são nossas menores unidades constituintes, no entanto, possuem funções capazes de determinar nossas vidas. Assim, lançar o olhar sobre essas unidades é de extrema importância para o reconhecimento de suas estruturas e funções que regulam todo nosso organismo, incluindo processos que se iniciam desde a concepção da vida (na fecundação do óvulo e espermatozoide) e determinam nossa saúde e características físicas e fisiológicas. (HERNANDEZ, 2018). Refletindo as células enquanto unidades constituintes de todos os seres vivos, ainda, como menor unidade anatomofisiológica do corpo humano e tendo em vista a importância das células segundo suas funções, vamos lançar um olhar microscópico sobre as células e aprofundar nosso conhecimento sobre suas estruturas. Inicialmente, vamos observar as células animal, vegetal e bacteriana do ponto de vista de suas estruturas. As células possuem componentes principais como membrana plasmática (que envolve toda a célula, isolando-a do meio externo), citoplasma (espaço entre a membrana plasmática e o núcleo, com exceção das células bacterianas) e organelas (estruturas com funções específicas para o metabolismo celular). Observando as Figuras abaixo, é possível identificar estruturas semelhantes entre as três células (membrana externa, citoplasma — exceção bactérias — e organelas), no entanto, as células vegetal e animal possuem mais estruturas em comum quando comparadas com a célula bacteriana, além disso, ambas são consideradas eucariontes (possuem núcleo definido) enquanto a célula bacteriana é procarionte (material genético disperso). Outra forma de analisar as células é por meio de seu ciclo de vida, seja para regeneração ou cicatrização. Assim, as células podem ser classificadas como lábeis, estáveis ou permanentes. As lábeis são aquelas que possuem um ciclo de vida curto, por exemplo, as hemácias (células do sangue), que são renovadas/destruídas a cada 120 dias. Já as células estáveis geralmente não se dividem, e sim se proliferam quando estimuladas, por exemplo, células das glândulas do fígado, pâncreas, salivares etc. Por fim, as células permanentes não se dividem e nem se proliferam, como as células do sistema nervoso central e músculos. (AMABIS; MARTHO, 2006; LOPES; ROSSO, 2013). 7 Célula animal; célula vegetal Fonte: https://www.queroadesivo.com.br/ Célula bacteriana Fonte: https://slideplayer.com.br/ Observados os tipos de células, vamos analisar suas principais estruturas e detalhar suas funções. As células são revestidas por uma camada externa, a membrana celular, denominada membrana celular na célula animal, parede celular na vegetal, e cápsula na bacteriana. (HERNANDEZ, 2018). 8 A função dessa membrana é realizar a troca de substâncias com o meio externo, isto é, essa membrana é semipermeável e por isso realiza a permeabilidade seletiva, pois permite a passagem de certas substâncias enquanto impede outras. Essa função é possível por causa de sua constituição lipoproteica (lipídeos e proteínas). Sua função específica é reconhecer substâncias no meio extracelular e sinalizar suas estruturas internas para possíveis ações internas da célula; além disso, é por meio da membrana que ocorre o transporte de substâncias de dentro e de fora da célula (ALBERTS et al., 2017b; AMABIS; MARTHO, 2006; COOPER; HAUSMAN, 2007; LOPES; ROSSO, 2013). Quanto ao transporte de substâncias por meio da membrana, podem ocorrer por transporte passivo, ativo ou por meio de vesículas. No transporte passivo, as moléculas e íons perpassam a membrana sem requerer energia da célula. Nesse tipo de transporte, a concentração da substância de dentro e de fora da célula é que determina a passagem. Assim, podem ocorrer por difusão simples (as moléculas de um soluto passam pela membrana permeável, do local mais concentrado para o menos concentrado, isto é, a favor do gradiente de concentração). Também podem ocorrer por osmose (mesmo mecanismo, mas agora contra o gradiente de concentração) ou por difusão facilitada (que ocorrem a favor do gradiente de concentração e por meio de proteínas de canal ou carregadoras). Já o transporte ativo ocorre quando a troca de moléculas e íons da célula para com o meio externo e vice-versa exigem energia celular. Esse transporte ocorre contra o gradiente de concentração e é promovido por proteínas transportadoras. Por fim, o transporte por meio de vesículas pode ocorrer por endocitose (processo para capturar partículas sólidas — fagocitose — ou líquidas — pinocitose) ou por exocitose (processo de eliminação de substâncias para fora da célula) (ALBERTS et al., 2017b; AMABIS; MARTHO, 2006; COOPER; HAUSMAN, 2007; LOPES; ROSSO, 2013). Diante disso, fica evidente a importância da membrana externa da célula, já que ela não somente protege a célula como é vital para a troca de substâncias promovendo algumas ações importantes para o bom funcionamento do organismo e consequentemente da vida. O núcleo não faz parte do citoplasma e abriga o material genético da célula, controlando a atividade celular; dentro do núcleo se inicia o processo de replicação do DNA, transcrição e processamento do RNA, porém o processo de tradução (parte final 9 da tradução gênica) ocorre no citoplasma. O núcleo é envolto pela carioteca, que possui constituição membranosa justapostas com um espaço interno. Nessa membrana, há poros circundados por estruturas proteicas que regulam a entrada e a saída de substâncias no núcleo, processo semelhante à membrana celular. As outras partes que formam o núcleo compreendem o nucléolo (uma região próxima da carioteca que é constituída por RNA ribossômicos e proteínas), o nucleoplasma (espaço onde se encontram mergulhados os filamentos de cromatina, proteínas ribossômicas, moléculas de ATP, nucleotídeos, íons etc.) e por fim o material genético (composto de longos filamentos de DNA condensados e associados a proteínas) (ALBERTS et al., 2017b; AMABIS; MARTHO, 2006; COOPER; HAUSMAN, 2007; LOPES; ROSSO, 2013). Assim, a membrana plasmática e o núcleo constituem estruturas muito importantes para a vida celular, pois a primeira, além de realizar a delimitação da célula, tem como principal função regular a entrada e a saída de substâncias dela, e a segunda possui o material genético da célula e, determinando, portanto, a vida celular. Agora vamos analisar as estruturas que se localizam dentro da membrana celular, mergulhadas no líquido gelatinoso (denominado hialoplasma) do citoplasma. 2.1 A célula e sua membrana plasmática As células são compostas por três estruturas básicas: membrana plasmática, citoplasma e núcleo. Existem dois grandes grupos de células: procariotos e eucariotos. As bactérias e algas pertencem ao grupo de procariotos, enquanto que os animais e os vegetais são formados por célulaseucariotas. Cada célula, procariota ou eucariota, contém pelo menos 10 mil diferentes tipos de moléculas, a maioria delas presente em múltiplas cópias. Essas moléculas se transformam em matéria e energia para interagir com o ambiente e se reproduzirem. É praticamente impossível conhecer todas essas moléculas, mas o conhecimento da biologia celular corresponde, em certo sentido, ao estudo da vida. Sabe-se que ela é contínua e que todas as células de um organismo vêm de uma única célula, um óvulo fertilizado, originado da fusão de duas células (espermatozoide e óvulo). 10 O tamanho pequeno de uma célula, é consequência da necessidade prática de se manter uma razão entre a área de superfície e o volume. Dessa forma, quando a célula ou objeto cresce, sua área de superfície também aumenta, porém não na mesma proporção. O volume da célula indica a quantidade de atividade possível de ser desempenhada por unidade de tempo. Já a área de superfície da célula determina a quantidade de moléculas que ela pode incorporar e/ou liberar para o ambiente externo. (HERNANDEZ, 2018). Com o aumento do volume celular, a atividade e necessidade de recursos aumenta de forma mais rápida do que a área de superfície. Além disso, as células precisam redistribuir substâncias com frequência para diferentes regiões em seu interior, logo, quanto menor a célula, maior facilidade na realização da tarefa. Este é o grande motivo do porquê de grandes organismos serem compostos por diversas células pequenas, o volume pequeno mantém uma razão eficiente entre área de superfície e volume e, também, possuir um volume interno ideal. As células são delimitadas pela membrana plasmática, que a separa do ambiente externo, criando um compartimento ao seu redor, um compartimento separado, mas não isolado. A membrana plasmática é formada por uma bicamada fosfolipídica, com as “cabeças” hidrofílicas dos lipídios direcionadas para o interior aquoso da célula, em uma das faces da membrana, e para o ambiente extracelular, no lado oposto, com as proteínas e outras moléculas inseridas entre os lipídios. Além de funções importantes, a membrana plasmática tem significância biológica por sua atuação como uma barreira seletiva, permitindo a entrada de nutrientes, retenção de produtos de síntese e excreção de resíduos. Para entender melhor, observe a Figura: Fonte: Lodish et al. (2013, p. 446). 11 Ambos os tipos celulares, procariotos e eucariotos apresentam a membrana plasmática provida de muitas proteínas que desempenham uma diversidade de funções semelhantes, entre elas: permite que a célula mantenha um ambiente interno relativamente autorregulável (homeostase), que é uma característica-chave da vida; atua como barreira permeável, mas seletiva, evitando que algumas substâncias a atravessem, e permitindo o trânsito de outras, tanto para dentro quanto para fora da célula; tem importância na comunicação com as células adjacentes e para a recepção de sinais provenientes do ambiente, por intermédio das especializações de membrana; apresenta proteínas que se projetam de seus limites e são responsáveis pela ligação e aderência a células adjacentes. Porém, as células eucarióticas, que normalmente são bem maiores do que as procarióticas, apresentam organelas internas ligadas por membranas. A membrana dessas organelas tem uma configuração própria de proteínas que promove o desempenho de funções celulares características, como a geração de ATP (nas mitocôndrias) e a síntese de DNA (no núcleo). Muitas proteínas da membrana plasmática também unem componentes do citoesqueleto, uma forte rede de filamentos proteicos que atravessa o citosol para propiciar suporte mecânico às membranas celulares e assumir a forma da célula. Apesar de muito resistentes, as membranas são estruturas maleáveis que podem curvar-se, dobrar-se em três dimensões e, ainda, conservar sua integridade, devido, principalmente, a abundantes interações não covalentes que mantêm unidos os lipídios e as proteínas. Assim, a grande mobilidade de lipídios e proteínas individuais é chamada de modelo do mosaico fluido de biomembranas, que foi proposto por cientistas na década de 70. A bicamada lipídica se comporta, em alguns aspectos, como um fluido bidimensional, com moléculas individuais capazes de se mover uma após a outra e girar no seu local. Essa fluidez e essa flexibilidade da membrana permitem às organelas, além de assumir suas formas típicas, propriedade dinâmica de brotamento e fusão de membranas, como ocorre quando são liberados os vírus de uma célula infectada, por exemplo. (ROSA, 2018). 12 As duas superfícies de uma membrana celular são chamadas de face citosólica e face exoplasmática. A face exoplasmática da membrana fica voltada para fora do citosol, para o espaço extracelular ou ambiente externo e define o limite externo da célula. Já a face citosólica da membrana plasmática volta-se para o citosol. Em todas as organelas e vesículas circundadas por uma membrana simples, a face citosólica está voltada para o citosol. Organelas essenciais para a sobrevivência a célula (núcleo, mitocôndria e cloroplasto) são circundadas por duas membranas. (ROSA, 2018). 2.2 Organelas celulares e suas funções A membrana plasmática delimita a célula e é uma estrutura vital, já que é a interface que a célula tem com seu ambiente, separando o meio externo do citoplasma interno. Embora as propriedades físicas da membrana plasmática sejam, em grande parte, determinadas por seu conteúdo lipídico, o complemento proteico de uma membrana é o principal responsável pelas propriedades funcionais da membrana. Moléculas maiores que íons e outros metabólitos podem ser captadas através da endocitose, a formação de uma invaginação da membrana plasmática. Durante a endocitose, são formados poços revestidos, em que os receptores coletam e trazem para a célula, moléculas ou partículas específicas, mediadas por receptor. Após a internalização, os materiais são classificados e podem retornar à membrana plasmática ou ser entregues a lisossomos para degradação. Os lisossomos contêm diversas enzimas digestivas que degradam qualquer molécula biológica em componentes menores. O lúmen dos lisossomos possui pH ácido e isso ajuda a desnaturar proteínas. Até agora não foram descritos lisossomos em células vegetais, mas o vacúolo central de uma célula vegetal pode apresentar uma capacidade de atuação semelhante, pois também apresentam diversas enzimas digestivas. A maior organela é chamada de retículo endoplasmático (RE), é uma extensa rede de vesículas e túbulos achatados ligados à membrana. O RE pode ser dividido em retículo endoplasmático liso (REL), pois sua membrana de superfície é lisa e retículo endoplasmático rugoso (RER), que é revestido por ribossomos. O REL é o local de síntese de ácidos graxos e fosfolipídios. Já o RER, com seus ribossomos 13 acoplados, é o sítio de síntese de proteínas da membrana e de proteínas que serão secretadas pela célula responsável. Após a síntese no RE, as proteínas são destinadas para a membrana plasmática ou para secreção, são transportadas para o complexo de Golgi, um conjunto de membranas achatadas chamadas de cisternas, onde as proteínas são modificadas antes de serem transportadas ao seu destino na membrana plasmática. As proteínas destinadas para secreção são sintetizadas no RE, transportadas pelo complexo de Golgi e liberadas pela célula, este processo todo é chamado de via secretora. Nos procariotos, os ribossomos flutuam livremente no citoplasma. Já nos eucariotos, podem ser encontrados no citoplasma, livres ou ligados à superfície do RE, no interior de mitocôndrias e cloroplastos. Em ambos locais, os ribossomos representam os sítios em que ocorre a síntese de proteínas direcionada pelos ácidos nucleicos. Os ribossomosdos procariotos e eucariotos assemelham-se em constituição e diversidade de tamanhos. Porém, os ribossomos eucarióticos são, relativamente, maiores, mas a estrutura dos ribossomos procarióticos é mais conhecida. Sabe-se que contêm um tipo especial de RNA denominado RNA ribossomal (rRNA), o qual mais de cinquenta tipos diferentes de moléculas de proteínas ligam-se não covalentemente. No peroxissomo, classe de organelas semiesféricas que contém oxidases de enzimas que utilizam oxigênio molecular para oxidar toxinas, transformá-las em produtos inofensivos e para a oxidação de ácidos graxos na produção de grupos acetila. Até aqui, todas as organelas comentadas são circundadas por uma única membrana formada por uma bicamada lipídica. Os vegetais e algas verdes apresentam cloroplastos que são organelas que usam o processo de fotossíntese para capturar a energia luminosa com pigmentos coloridos, incluindo o pigmento verde clorofila e, para assim, estocar a energia capturada em forma de ATP. As mitocôndrias de outros organismos, podem ocupar até 30% do volume do citoplasma. A membrana mitocondrial interna é bastante retorcida com dobras chamadas de cristas, que formam saliências no espaço central, chamadas de matriz. Uma das principais funções das mitocôndrias é completar os estágios finais da degradação da glicose, por meio da oxidação para gerar a maior parte do suprimento de ATP da célula. Desta forma, as mitocôndrias podem ser consideradas as “usinas” da célula. (ROSA, 2018). 14 Algumas teorias sugerem que as mitocôndrias e os cloroplastos tenham evoluído a partir de um acontecimento antigo, quando uma célula eucariótica fagocitou um tipo de bactéria, isso originou as mitocôndrias e um tipo diferente que deu origem aos cloroplastos, pois as membranas destas organelas servem como evidências para sustentar essa hipótese. A membrana interna teria, provavelmente, se originado a partir da membrana da bactéria original, enquanto a membrana externa seria um vestígio da membrana plasmática da fagositose. Outra evidência desta teoria é o fato de tanto as mitocôndrias quanto os cloroplastos terem o seu próprio DNA genômico e, que a síntese de proteínas nas organelas tem maior semelhança à síntese proteica em bactérias do que à síntese proteica em eucariotos. (ROSA, 2018). 2.2.1 Endossomos Os endossomos formam um compartimento que recebe as moléculas introduzidas no citoplasma das células pelas vesículas de pinocitose, que se originam da membrana plasmática. O compartimento endossomal é constituído de elementos separados; é um sistema extenso, que se vai desde a periferia do citoplasma até as proximidades do núcleo celular. (CARNEIRO; JUNQUEIRA, 2012) É formado por vesículas e túbulos, cujo interior apresenta pH ácido. Esse compartimento é responsável pela separação e pelo endereçamento do material que penetra no citoplasma pelas vesículas de pinocitose. Grande parte desse material é encaminhada para os lisossomos, porém, muitas moléculas passam dos endossomos para o citosol, e outras são desenvolvidas para a superfície celular. Os endossomos podem ser considerados como uma parte da via lisossomal, porque muitas moléculas que se dirigem para os lisossomos passam antes pelos endossomos. 2.2.2 Aparelho de Golgi Essa organela é também conhecida como zona ou complexo de Golgi, estando constituída por um número variável de vesículas circulares achatadas e por vesículas esféricas de diversos tamanhos, que parecem brotar das primeiras. Em muitas células, o aparelho de Golgi localiza-se em posição constante, quase sempre ao lado do núcleo; em outras células, ele se encontra disperso pelo citoplasma. (CARNEIRO; JUNQUEIRA, 2012). 15 Essa organela apresenta múltiplas funções; mas dentre elas, cabe destacar que é muito importante na separação e no endereçamento das moléculas sintetizadas nas células, encaminhando-as para as vesículas de secreção (o que serão expulsas da célula), os lisossomos, as vesículas que permanecem no citoplasma ou a membrana celular. Fonte: https://escolaeducacao.com.br/ 2.2.3 Lisossomos Os lisossomos são organelas de forma e tamanho muito variáveis (medem, frequentemente, 0,50 a 3,0 µ.m de diâmetro, cujo interior é ácido e contém diversas enzimas hidrolíticas (enzimas que rompem moléculas, adicionando os átomos das moléculas de água). As hidrolases dos lisossomos têm atividade máxima em Ph ácido. Essas enzimas são sintetizadas pelos Polirribossomos que se prendem ao retículo endoplasmático rugoso. Os lisossomos são depósitos de enzimas utilizadas pelas células para digerir moléculas introduzidas por pinocitose, por fagocitose, ou, então organelas da própria célula. A destruição de renovação de organelas é um processo fisiológico que permite à célula manter seus componentes em bom estado funcional e em quantidade adequada às suas necessidades do momento. As organelas desgastadas pelo uso são eliminadas e substituídas por organelas novas. As que não são mais necessárias são removidas. (CARNEIRO; JUNQUEIRA, 2012). 16 2.2.4 Peroxissomos Os peroxíssomos são organelas caracterizadas pela presença de enzimas oxidativas que transferem átomos de hidrogênio de diversos substratos para o oxigênio. Os peroxissomos contém a maior parte da catalase celular, enzima que converte peróxido de hidrogênio em agua e oxigênio. (CARNEIRO; JUNQUEIRA, 2012). 2.3 O núcleo e seus componentes O sucesso evolutivo de um organismo depende da sua capacidade de armazenar, obter e traduzir as informações genéticas necessárias para manter o organismo vivo. Esta informação é hereditária, ou seja, é passada de uma célula às células-filhas durante a divisão celular, e é no núcleo celular de todas as células eucarióticas, que estas instruções são armazenadas. O núcleo é a organela em que se encontra o DNA da célula e o local da transcrição do DNA em RNA mensageiro. O núcleo tem uma membrana interna e também membrana externa contínua à membrana do RE, de forma que o espaço entre as membranas nucleares interna e externa é contínuo. O acesso à face interna e externa do núcleo se dá através de conexões tubulares entre as membranas interna e externa estabilizadas por poros nucleares. Estes poros definem o local de transporte na membrana nuclear e atuam como barreiras, permitindo apenas o transporte de macromoléculas específicas para dentro e fora do núcleo. Os poros são compostos por mais de 100 diferentes proteínas, que interagem hidrofobicamente. Cada poro é circundado por um complexo de oito grandes agregados proteicos, organizados sob a forma de um octógono, no ponto de contato entre as membranas interna e externa. O poro nuclear funciona com uma catraca na entrada de um evento esportivo. Da mesma forma que crianças passam por baixo da catraca, pequenas substâncias, como íons e moléculas de tamanho inferior a 10.000 daltons, difundem através do poro. Moléculas maiores de até 50.000 daltons, também podem difundir por meio do poro, porém, necessitam de mais tempo para este procedimento. Moléculas maiores, como proteínas do citoplasma e que são importadas para o núcleo, comportam-se como adultos na catraca: não podem entrar se não possuírem o seu “ingresso”. No caso das proteínas, o ingresso é uma sequência curta de aminoácidos que faz parte 17 da proteína. Assim, proteína possui uma estrutura tridimensional que permite a sua ligação não covalente com a conformação tridimensional do receptor, de forma que ocorre o estiramento do poro, permitindo a entrada de grandes proteínas. (ROSA, 2018). Observe a Figura a seguir: O núcleo está delimitado por uma membrana dupla chamada de envelope nuclear. Nucléolo, lâmina nuclear e poros nucleares são características comuns a todos os núcleos celulares. Os poros são os portões através dos quais as proteínasdo citoplasma penetram no núcleo e o material genético (mRNA) sai do núcleo em direção ao citoplasma. Fonte: Sadava et al. (2009, p. 78). Nas regiões específicas do núcleo, a membrana externa do envelope nuclear cria reentrâncias em direção ao citoplasma e em continuidade com a membrana do RE (descrito anteriormente). No interior do núcleo, o DNA se associa a proteínas para formar um complexo fibroso denominado cromatina. A cromatina consiste em filamentos extremamente longos e finos. Antes da divisão da célula, a cromatina se agrega para formar os cromossomos. Na borda do núcleo, a cromatina encontra-se conectada a uma rede de proteínas, chamada de lâmina nuclear, formada por meio da polimerização de proteínas, designadas de lâminas em filamentos. A lâmina nuclear mantém o formato do núcleo por intermédio de sua ligação simultânea à cromatina e ao envelope nuclear. 18 Durante grande parte do ciclo de vida da célula, o envelope nuclear permanece como estrutura estável. No entanto, quando a célula sofre a divisão, o envelope celular é quebrado em pedaços de membrana, contendo os complexos do poro a eles ligados. O envelope é reconstruído quando a distribuição do DNA replicado para as células- filha está completa. Na molécula de DNA, existem trechos contendo as sequências específicas de determinados nucleotídeos que podem corresponder à sequência de um gene. As histonas são responsáveis pelo primeiro e mais básico nível de organização cromossômica, o nucleossomo. Os nucleossomos são compactados ainda mais para gerarem os cromossomos. O ácido desoxirribonucleico (DNA) é uma molécula de informação que contém, na sequência de seus nucleotídeos, a informação necessária para a formação de todas as proteínas de um organismo e, portanto, das células e dos tecidos daquele organismo. O DNA é quimicamente muito estável na maioria das condições terrestres, como em ossos e tecidos com de milhares de anos, por exemplo, e cumpre suas importantes funções com tanta maestria que é a fonte da informação genética em todas as formas de vida conhecidas, exceto os vírus de RNA, os quais são limitados a genomas muito pequenos devido à instabilidade do RNA comparado ao DNA. O fato de que todas as formas de vida utilizem DNA para codificar sua informação genética e a existência de um código genético quase igual, esclarece que todas as formas de vida descendem de um ancestral comum baseado no armazenamento da informação em sequências de ácido nucleico. A informação contida no DNA está disposta em unidades hereditárias, chamadas de genes, que controlam as características identificáveis de um organismo. Durante a transcrição, a informação armazenada no DNA é copiada para a forma de ácido ribonucleico (RNA), que possui três papéis distintos na síntese proteica. As sequências de nucleotídeos do DNA são copiadas em moléculas de RNA mensageiro (mRNA), que promove a síntese de uma proteína específica. A sequência de nucleotídeos do mRNA contém informação que especifica a ordem correta dos aminoácidos durante a síntese de uma proteína. O agrupamento de aminoácidos em proteínas é extremamente preciso e em etapas, ocorre pela tradução do mRNA. Durante esta etapa, os nucleotídeos da molécula de mRNA são lidos por um segundo tipo de RNA, conhecido como RNA de 19 transferência (tRNA), com o auxílio de um terceiro tipo, o RNA ribossomal (rRNA) e suas proteínas associadas. Conforme vão sendo lidos pelos tRNAs, os aminoácidos corretos são unidos por ligações peptídicas para formarem as proteínas. Assim, a síntese de RNA é chamada de transcrição, porque a “linguagem” da sequência nucleotídica do DNA é precisamente copiada ou transcrita na sequência nucleotídica de uma molécula de RNA. A síntese proteica é denominada tradução, pois a “linguagem” da sequência nucleotídica do DNA e do RNA é traduzida para a “linguagem” de sequência dos aminoácidos das proteínas. 3 ESTRUTURA DA MEMBRANA PLASMÁTICA A célula é a unidade básica de todos os seres vivos, podendo existir isoladamente (em organismos unicelulares) ou em conjunto (organismos pluricelulares ou multicelulares), podendo constituir, inclusive, tecidos complexos, órgãos e sistemas. Além disso, cabe à célula produzir material extracelular, de constituição química variável, e que também dá as características ao tecido — a matriz extracelular. A membrana plasmática (ou celular) tem numerosas funções celulares. Ela atua na manutenção de microambientes, formando uma barreira que impede o conteúdo celular de escapar e se misturar com o meio circundante, definindo os meios intra e extracelulares e as interações célula-célula e célula-matriz extracelular (inclusive na formação dos tecidos). Nesse sentido, a membrana celular, além de envolver o ambiente interno da célula, controla a troca entre os meios, nos processos de endocitose (processo de internalização de partículas) e exocitose (processo de externalização de produtos celulares) (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Assim, a membrana plasmática é o primeiro contato entre o que “está dentro ou fora da célula”, participando dos fenômenos de reconhecimento celular e transmitindo informações para o interior da célula, permitindo, assim, que ela responda a esses “estímulos” externos e participe de uma variedade de processos vitais, incluindo apresentação e reconhecimento de moléculas, catálise, detecção de sinal, citocinese, formação celular e motilidade (PONTES et al., 2013). 20 Dessa forma, a função de uma célula relaciona-se diretamente com a constituição e a estrutura da sua membrana plasmática. Nesse momento, é importante ressaltar que as células eucariotas, exceto os eritrócitos, têm o citoplasma compartimentalizado em organelas membranares, cuja constituição e estrutura, apesar das peculiaridades pertinentes a cada organela, são similares à membrana plasmática (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Veja a seguir as funções da membrana plasmática das células eucarióticas. Define os limites e a forma da célula. Separa o meio intracelular e extracelular. Controla a entrada e a saída de moléculas/partículas da célula — permeabilidade seletiva. É responsável pela manutenção da constância do meio intracelular. É responsável pelo reconhecimento célula-moléculas (por meio de receptores específicos localizados na membrana), célula-célula e célula- -matriz extracelular. Pode iniciar a sinalização de reações citoplasmáticas, aumentando a eficiência do sistema. Promove a comunicação celular por meio da presença de estruturas intercelulares específicas (as junções comunicantes), formadas por proteínas específicas associadas à membrana. Promove a adesão celular (entre células) e a adesão célula-matriz, garantindo a formação e a integridade dos tecidos. 3.1 Estrutura das membranas plasmáticas As membranas plasmáticas e das diferentes organelas celulares têm de espessura, aproximadamente, 7 a 10 µm e podem ser vistas apenas no microscópio eletrônico. Trata-se de uma estrutura trilaminar composta de duas camadas eletrodensas (escuras) e uma camada eletrolúcida (clara) central (Figura). Essa estrutura é chamada unidade de membrana (ALBERTS et al., 2017; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; 2013). 21 Figura 1. Estrutura trilaminar de uma unidade de membrana celular. (a) Imagens de microscopia eletrônica de transmissão mostram, à esquerda, a membrana plasmática de duas células vizinhas, separadas pelo espaço extracelular. À direita, está a unidade de membrana de cada célula. Observe que a estrutura da bicamada lipídica fica evidenciada pela presença de duas linhas densas (região hidrofílica dos fosfolipídios), separadas por uma linha clara (região hidrofóbica, constituída pelas cadeias de ácidos graxos dos fosfolipídios). (b) Esquema 3D ilustrativo da unidade de membrana — regiões hidrofílicae hidrofóbica. Fonte: Adaptada de (a) de Bioninja ([201-?]); (b) luminance studio/Shutterstock.com Esse aspecto ao microscópio eletrônico é explicado pela organização molecular das membranas, que estão organizadas em uma bicamada fluida de fosfolipídios (fosfoglicerídeos e esfingolipídios). Os lipídios das membranas são moléculas longas, com uma extremidade hidrofílica (polar e solúvel em água) e uma cadeia hidrofóbica (apolar e insolúvel em água) — portanto, uma molécula anfipática (MEZA et al., 2010; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; 2013). As moléculas da dupla camada de lipídios estão dispostas com suas cadeias hidrofóbicas direcionadas ao interior da membrana. Já as cadeias hidrofílicas (polares) ficam direcionadas aos meios intracelular e extracelular, que são ambientes aquosos. 3.1.1 Lipídios Os lipídios mais frequentes nas membranas plasmáticas são os fosfolipídios (Figura 2a), o colesterol (Figura 2b) e, além deles, existem também os glicolipídios (lipídios associados a carboidratos, associados ou não a radicais fosfato) (Figura 2c). Fosfolipídios: são os lipídios mais comuns da membrana. Têm uma cauda de ácido graxo ligada, por meio de uma molécula de glicerol, a uma “cabeça” de 22 fosfato ligado a um álcool (hidrofílica). Dentre os fosfolipídios, destacam-se a fosfatidilserina, a fosfatidiletanolamina, a fosfatidilcolina, o fosfatidilinositol e o fosfatidilglicerol. A esfingomielina, muito comum nas células do tecido nervoso, é um fosfolipídio no qual o glicerol é substituído por uma esfingosina (neste caso, o álcool associado é a colina) (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; PRESTON; WILSON, 2014). Colesterol: o colesterol é o segundo lipídio mais comum na membrana, constituindo cerca de 25% da membrana plasmática. É hidrofóbico, mas contém um grupo hidroxila polar que o puxa para a superfície externa da bicamada, na qual se aloja entre os fosfolipídios adjacentes. Entre o grupo hidroxila e a cauda de hidrocarboneto está um núcleo de esteroide, que o tornam relativamente inflexível (Figura 2b). Assim, a adição de colesterol à membrana interfere na sua viscosidade, reduzindo a sua fluidez e a tornando mais forte e mais rígida (MEZA et al., 2010; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; PRESTON; WILSON, 2014). Está também relacionado à sinalização celular (MEZA et al., 2010). Glicolipídios: presentes na monocamada externa, é um tipo de lipídio pequeno, mas fisiologicamente importante. É composto por uma cauda de ácido graxo associada, por meio da esfingosina, a uma cabeça hidrofílica de carboidrato. Assim, os glicolipídios criam uma capa de carboidrato celular envolvida nas interações célula- célula, inclusive apresentando antigenicidade (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; PRESTON; WILSON, 2014). 3.1.2 Proteínas A atividade metabólica das membranas plasmáticas é dependente das proteínas que participam da sua formação. Elas podem ser classificadas em dois grandes grupos: as proteínas integrais (ou intrínsecas) e as proteínas periféricas (ou extrínsecas) (Figuras 2c e 3). As primeiras estão firmemente aderidas à membrana plasmática, compondo parte de ambas monocamadas lipídicas, e correspondem a cerca de 70% das proteínas de membrana. Aquelas proteínas integrais que atravessam toda a unidade de membrana, fazendo contato do meio extracelular com o citoplasma, são chamadas de proteínas transmembrana, que podem atravessar a membrana uma única vez (unipasso) ou várias vezes. Nesse último caso, são chamadas de proteínas transmembrana de passagem múltipla (ou multipasso). 23 As proteínas periféricas, ao contrário, se prendem às superfícies externas da membrana, compondo apenas uma das monocamadas lipídicas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). Figura 2. (a) Estrutura geral de um fosfolipídio. (b) Estrutura química de uma molécula de colesterol. (c) Bicamada lipídica da membrana plasmática, com suas proteínas e cadeias de carboidrato associadas a proteínas ou lipídios na monocamada externa da membrana. As faces hidrofílicas (círculos amarelos) interagem com o espaço extracelular e o citoplasma, ambos aquosos (caráter polar); as cadeias hidrofóbicas ficam voltadas para dentro da membrana. Fonte: Adaptada de (a) struna/Shutterstock.com; (b) Alila Medical Media/Shutterstock.com; (c) Jamilia Marini/Shutterstock.com. 24 Figura 3. Proteínas integral (unipasso e multipasso) e periférica de membrana. Observe que há a representação de uma proteína periférica que está ancorada em um lipídio da monocamada da membrana. Fonte: Adaptada de Designua/Shutterstock.com. A passagem de substâncias através da membrana celular não ocorre sempre da mesma forma e depende do tipo de substância (permeabilidade seletiva). Em alguns casos as substâncias podem atravessar a membrana sem a intervenção específica de moléculas transportadoras — transporte não mediado (osmose e difusão simples) —, enquanto em outros casos são as proteínas membranares que facilitam esse transporte — transporte mediado (transporte ativo e difusão facilitada). O termo geral proteínas de transporte engloba três categorias principais de proteínas: canais (agem como poros nas membranas e sua especificidade é determinada primeiramente pelas propriedades biofísicas no canal) (Figura 4a), carregadoras (ligam na molécula a ser transportada em um lado da membrana e depois a liberam do outro lado) (Figura 4b) e bombas (relacionadas ao transporte ativo primário, usam energia diretamente, usualmente da hidrólise do trifosfato de adenosina [ATP], para bombear os solutos contra o seu gradiente ou potencial eletroquímico) (Figura 4c). Essas proteínas exibem especificidade para solutos por elas transportados. Embora uma determinada proteína de transporte seja em geral altamente específica para os tipos de substâncias que transporta, sua especificidade comumente não é absoluta (COLODETE, 2013). 25 Figura 4. Três classes de proteínas transportadoras de membrana: (a) canais, (b) carreadoras e (c) bombas. Proteínas canais e carreadoras podem mediar o transporte passivo de soluto pela membrana (por difusão simples ou difusão facilitada) a favor do gradiente de soluto e potencial eletroquímico. Fonte: Colodete (2013, documento on-line) Existem três tipos de proteínas transportadoras (transporte secundário): simporte, antiporte e uniporte (Figura abaixo). Nas proteínas do tipo simporte, as duas substâncias se movem na mesma direção através da membrana. Nas do tipo antiporte, ocorre o movimento de um soluto a favor do gradiente de prótons, impulsionando o transporte ativo de outro soluto na direção oposta do gradiente (transporte acoplado). (COLODETE, 2013). Figura 5. Mecanismos para o transporte de moléculas mediado por proteínas através das membranas biológicas — simporte, uniporte e antiporte. Fonte: Adaptada de Gungner/Shutterstock.com. 26 Nas proteínas do tipo uniporte, apenas um soluto é transportado e ocorre a favor do gradiente eletroquímico. No transporte por meio de proteínas simporte e antiporte, o íon ou soluto transportado simultaneamente com os prótons move-se contra seu gradiente de potencial eletroquímico, de modo que se trata de transporte ativo. Nesses casos, a energia que governa esse transporte é proporcionada pela força-motriz de prótons, em vez de diretamente pela hidrólise de ATP. O transporte realizado por proteínas uniporte é mediado pelos canais e certos transportadores a favor do gradiente de potencial elétrico (SANDERS; BETHKE, 2000; RAMOS; MARTINS; FAÇANHA, 2005; COLODETE, 2013). 3.2 Organização da membrana plasmática Apesar de morfologicamente parecidas e com a mesma organização molecular básica, as unidades de membrana não são iguais, nem na morfologia nem nas funções. Assim, as membranas plasmáticas variam muito na composição química e nas propriedades biológicas. A proporçãoentre os tipos de lipídios varia de acordo com o tecido e o tipo celular, assim como a distribuição dos lipídios em cada camada é assimétrica (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; 2013). Isso significa dizer que as moléculas que compõem a bicamada têm natureza lipídica, mas que diferem entre si, na sua estrutura e propriedade química (mais polar ou menos polar, com cadeias cíclicas ou lineares, com cadeias de ácidos graxos maiores ou menores, por exemplo). Além disso, o tipo e a proporção de cada fosfolipídio/colesterol em cada monocamada lipídica da membrana são variáveis. (MEZA et al., 2010). Na organização da membrana, as proteínas periféricas estão concentradas na sua face citoplasmática, na qual podem ligar-se a componentes do citoesqueleto, definindo, inclusive, o formato da célula. Já as proteínas integrais estão presentes no lado externo da membrana e estão muito relacionadas aos fenômenos de sinalização celular. Parte dessas proteínas são glicoproteínas, cujos resíduos glicídicos são adicionados aos glicolipídios e a outras moléculas da face externa da membrana, constituindo o glicocálice (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). 27 4 MITOCÔNDRIA: CONVERSÃO ENERGÉTICA E RESPIRAÇÃO CELULAR Apesar de a mitocôndria estar relacionada a uma série de funções celulares, a principal delas é a de prover energia à célula. Estima-se que mais de 90% do trifosfato de adenosina (ATP) necessário aos diversos propósitos biológicos seja produzido por essa organela. Para realizar suas atividades, as células utilizam a energia química armazenada nos nutrientes, transferindo-a para a molécula de ATP na mitocôndria, durante a fosforilação oxidativa. Para isso, a energia dos nutrientes é utilizada para gerar um fluxo de prótons H+ , que converte uma molécula de difosfato de adenosina (ADP) em ATP (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017; COOPER; HAUSMAN, 2018). Além disso, as mitocôndrias estão também envolvidas com a biossíntese de pirimidinas e do grupo heme da hemoglobina (por meio de enzimas específicas), bem como com o metabolismo de colesterol e neurotransmissores. Elas têm ainda funções na produção de radicais livres para propósitos específicos na célula (sinalização celular e processo inflamatório) e na detoxificação desses mesmos radicais em outras situações (NASSEH et al., 2001) 4.1 Morfologia e funções da mitocôndria As mitocôndrias têm uma forma cilíndrica rígida e alongada, com um diâmetro de 0,5 a 1 µm. Por meio de microfilmagens de células vivas, observa-se que elas são organelas móveis e plásticas que mudam de forma constantemente. (a) Imagem de microscopia confocal mostrando as mitocôndrias de células-tronco mesenquimais. Ilustra as mitocôndrias, os núcleos celulares e as proteínas citoplasmáticas. (b) Microscopia eletrônica de transmissão mostrando as mitocôndrias, lisossomos, grânulos de glicogênio, retículo endoplasmático rugoso e centríolo. Fonte: (a) Vshivkova/Shutterstock.com; (b) Jose Luis Calvo/Shutterstock.com 28 A maneira por meio da qual as mitocôndrias se movem no citosol demonstram que elas podem estar associadas a microtúbulos, os quais possivelmente determinam a orientação e a distribuição que elas têm nos diferentes tipos de células (Figura 1) (ALBERTS et al., 2017). 4.2 Duas membranas, dois compartimentos mitocondriais A mitocôndria é uma organela membranosa das células eucariotas que tem a peculiaridade de ter duas membranas, organizadas numa bicamada de fosfolipídios (sintetizados pelo retículo endoplasmático liso da célula) associada a proteínas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012): a) uma membrana externa lisa, rica em colesterol e muito permeável, graças às proteínas intercaladas na membrana, as porinas; b) a outra membrana, interna, tem constituição fosfolipídica (mas pobre em colesterol) e rica em cardiolipina — fundamental para a fosforilação do ADP e a geração de energia (contribui para manter a diferença de potencial elétrico entre as faces da membrana); tem invaginações, que formam prateleiras, denominadas cristas mitocondriais, que aumentam a superfície dessas membranas, responsável pela produção energética. Organização geral da mitocôndria. Fonte: Soleil Nordic/Shutterstock.com. As duas membranas delimitam um espaço denominado espaço intermembranar, no qual existem várias enzimas e proteínas relacionadas à morte celular por apoptose. Além disso, é o espaço para onde os prótons são conduzidos a 29 partir da matriz durante a produção de energia (SOUZA, 2005; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017). Neste sentido, a morfologia da estrutura mitocondrial varia de acordo com o tipo celular e o estado funcional da célula, mas, de maneira geral, a quantidade de cristas e a densidade eletrônica mitocondriais são proporcionais à atividade respiratória da célula (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017). A matriz mitocondrial contém filamentos de DNAmt, ribossomos mitocondriais (menores do que os citoplasmáticos e semelhantes aos de bactérias), os RNAs e várias enzimas necessárias para a expressão dos genes mitocondriais (ALBERTS et al., 2017). A matriz contém centenas de enzimas e nela ocorrem os principais eventos metabólicos da organela, tais como: ciclo do ácido cítrico, oxidação dos ácidos graxos, replicação, transcrição e tradução do DNAmt, além da síntese de ATP (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017). Componentes estruturais de uma mitocôndria, com destaque para as membranas e os compartimentos mitocondriais. Fonte: Daniela Barreto/Shutterstock.com 4.3 DNA mitocondrial A célula eucariótica apresenta dois genomas distintos, o nuclear (DNAn) e o mitocondrial (DNAmt), aquele se encontra no núcleo e este na organela citoplasmática, respectivamente. Cada mitocôndria pode conter de 5 a 10 genomas mitocondriais, e cada célula, dezenas a centenas de moléculas, dependendo do tecido 30 (NASSEH et al., 2001). Essa molécula é encontrada em grande número de cópias, podendo ser maior que 1.000 cópias por unidade celular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012). São necessários cerca de 3.000 genes para fazer uma mitocôndria. Destes, somente 37 são codificados pelo DNAmt; o restante (a maioria) é codificado pelo núcleo, sintetizado no citoplasma e posteriormente transportado para dentro da mitocôndria. O DNAn é responsável pela síntese de proteínas que terão funções diversas na mitocôndria, desde a participação na estrutura da mitocôndria até o controle da replicação e da transcrição do DNAmt. Assim, o funcionamento perfeito da mitocôndria depende da interação adequada dos dois genomas (NASSEH et al., 2001). O conhecimento das características do genoma mitocondrial e sua genética são importantes para a compreensão da apresentação clínica e das variações dessas doenças. O DNAmt é uma molécula circular de 16.569 pb, 37 genes, os quais correspondem a 13 polipeptídios (subunidades proteicas da cadeia respiratória), 2 moléculas de RNA ribossomal e 22 tipos de RNA transportador (ANDERSON et al., 1981). O DNAmt é responsável por somente 15% da síntese de proteínas da cadeia respiratória, o restante é feito pelo DNAn (NASSEH et al., 2001). A herança materna é altamente sugestiva de um defeito no DNAmt. A pobre atividade reparadora da polimerase do DNAmt, a ausência de histonas, a maior sensibilidade ao dano oxidativo em razão do ambiente com grande número de radicais livres e a ausência do mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos são fatores que levam esse genoma a apresentar uma taxa de mutação de 5 a 10 vezes maior que o DNAn (BINNI et al., 2003; ALVAREZ, 2007). 4.4 Biogênese mitocondrial As mitocôndrias se formam a partir da reprodução de uma mitocôndria preexistente. Elas se reproduzem para substituir as mitocôndrias envelhecidas e para duplicar seu número antes de cada divisãocelular. Essa duplicação de material, seguida de divisão, é possível graças à existência do DNAmt e de RNA mensageiro, RNA transportador e ribossomos próprios de cada mitocôndria. Importante ressaltar que, conforme mencionado no item anterior, embora a mitocôndria tenha condições 31 de realizar processos de duplicação, tradução e transcrição e tenha seu genoma próprio, ele é incompleto: a mitocôndria só codifica por si só 13 proteínas – vários componentes necessários à completa expressão do DNAmt são provenientes do citoplasma, como proteínas ribossomais e a maioria das proteínas do ciclo de Krebs. No processo de sua replicação, novas proteínas são recrutadas e, posteriormente, adicionadas a compartimentos preexistentes ou complexos de proteínas. Esse processo promove crescimento da organela em volume que sofre divisão subsequente por fissão (GOMEZ-CABRERA et al., 2015; PEREIRA, 2015). A Figura a seguir ilustra os dois processos mitocondriais: a fissão e a fusão. Fusão e fissão mitocondrial controlam o número e o tamanho mitocondrial. Fonte: Lavich (2015). 4.5 Funções da mitocôndria A mitocôndria é uma organela intracelular que desempenha um importante papel na produção de ATP celular e está também envolvida na homeostasia celular e tecidual, na sinalização intracelular, na apoptose e no metabolismo de aminoácidos, lipídios, colesterol, esteroides e nucleotídeos (FERREIRA; AGUIAR; VILARINHO, 2008; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017). O Quadro a seguir sumariza essas funções mitocondriais: 32 FUNÇÕES DA MITOCÔNDRIA 1 Metabolismo de carboidratos, lipídios e aminoácidos – obtenção de energia (ATP) por meio do processo de respiração aeróbica 2 Armazenamento de cálcio celular 3 Síntese de lipídios e esteroides 4 Regulação da apoptose celular 5 Sinalização intracelular 6 Produção de energia (liberada por meio de processos bioquímicos sob a forma de calor) Fonte: Adaptado de Junqueira e Carneiro (2012) e Alberts et al. (2017) Dentre estes, importante ressaltar a apoptose, que é de fundamental importância na embriogênese em processos neurodegenerativos em diversas funções fisiológicas. Inúmeras proteínas regulatórias da apoptose exercem sua ação pela indução de megaporos nas membranas externa e interna da mitocôndria (SUSIN; ZAMZAMI; KROEMER, 1998). Essas recentes descobertas têm colocado a mitocôndria como uma via crítica para o desencadeamento da morte celular programada (SILVA; FERRARI, 2011). O envelhecimento também é outro foco de pesquisa, porque tem se relacionado à mitocôndria, pois alterações bioquímicas e rearranjos do DNAmt também são encontrados em tecidos de idosos (TANAKA et al., 1996; SILVA; FERRARI, 2011). Isso porque as mitocôndrias também são as principais geradoras de radicais livres no homem e diversos estudos demonstram que há uma relação entre envelhecimento celular, integridade funcional das mitocôndrias, produção de radicais livres e espécies reativas. Alguns autores da teoria mitocondrial do envelhecimento sugerem que mutações ocorridas no genoma mitocondrial alteram o metabolismo mitocondrial, reduzindo a produção de ATP e predispondo a célula ao envelhecimento e a diversas doenças associadas a este (VIÑA et al., 2006; SILVA; FERRARI, 2011). Ao contrário, a longevidade estaria associada à manutenção da estrutura e à função adequadas das mitocôndrias (SILVA; FERRARI, 2011; PEREIRA, 2015). 4.6 Respiração celular A energia utilizada pelas células eucariontes para realizar suas atividades provém da ruptura gradual de ligações covalentes de moléculas de compostos 33 orgânicos ricos em energia. As células, porém, não usam diretamente a energia liberada por hidratos de carbono e gorduras, mas utilizam de um composto intermediário, o ATP, produzido graças à energia contida nas moléculas de glicose e de ácidos graxos. O ATP se forma a partir do ADP e do fosfato inorgânico (Pi) existentes no citosol (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; ALBERTS et al., 2017). É no interior da célula que substâncias orgânicas, como oxigênio e glicose, são processadas e convertidas em energia na forma de ATP, no processo de respiração celular, por meio de dois mecanismos: a glicólise anaeróbia, que tem lugar no citosol, e a fosforilação oxidativa, que se realiza nas mitocôndrias (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; ALBERTS et al., 2017). Esquema geral da respiração aeróbica mostrando que a glicólise ocorre no citosol, enquanto a produção de acetilcoenzima A (acetil-CoA) e a fosforilação oxidação se processam nas mitocôndrias. Nesses eventos, ocorre o consumo de oxigênio e a formação de água e CO2 (respiração aeróbia) contrastando com a glicólise (respiração anaeróbia), que não consome oxigênio e produz pouco ATP. Fonte: Junqueira e Carneiro (2012, p. 70). 4.7 Glicólise A glicólise anaeróbia é uma etapa que ocorre no citoplasma e consiste na quebra parcial da glicose numa sequência de aproximadamente 11 reações, promovendo transformações graduais em uma molécula de glicose, sem consumo de 34 oxigênio, produzindo duas moléculas de piruvato e liberando energia que é armazenada em duas moléculas de ATP (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014). É uma etapa chamada de glicólise anaeróbia ou fermentação. No fungo levedo de cerveja, em condições anaeróbias, a glicólise prossegue, transformando o piruvato em etanol após uma série de reações enzimáticas. A fermentação alcoólica fornece ao levedo de cerveja a energia necessária para sua manutenção e reprodução, sendo chamada fermentação alcoólica, porque o produto final é o álcool etílico. Nas células eucariotas, a quebra da glicose em condições de anaerobiose promove a conversão do piruvato em ácido lático (lactato), que é tóxico à célula. Esse fenômeno é denominado fermentação lática (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014). A glicólise é um processo pouco eficiente, pois, das 690 kcal/mol presentes na glicose, apenas 20 kcal são aproveitadas e as células desenvolveram, ao longo da evolução, mecanismos mais eficazes para extração da energia dos nutrientes. Além dessa energia, são produzidas quatro moléculas de ATP e desidrogenação dessa glicose, formando NADH+H+ (um aceptor de elétrons). Considerando que duas moléculas foram gastas na ativação e no início da quebra da molécula de glicose, o saldo energético dessa etapa são duas moléculas de ATP (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014). A fosforilação oxidativa é via metabólica de maior rendimento energético do que a glicólise: de cada molécula-grama (mol) de glicose, além dos 2 mols de ATP obtidos pela via anaeróbia, a fosforilação oxidativa produz mais 36 mols de ATP. As etapas seguintes culminam na fosforilação oxidativa, o piruvato é oxidado até se formarem água e gás carbônico, com alto rendimento energético. Costuma-se distinguir, na oxidação fosforilativa, três mecanismos distintos, mas que se entrelaçam intimamente: a produção de acetil-CoA, o ciclo de Krebs (ácido cítrico) e o sistema transportador de elétrons. Enquanto a glicólise é anaeróbia e tem lugar no citosol, a fosforilação oxidativa é aeróbia e se processa nas mitocôndrias (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; ALBERTS et al., 2017). 35 4.8 Energia celular Para manter um metabolismo equilibrado, o organismo deve obter continuamente os nutrientes, provenientes dos alimentos, os quais precisam ser consumidos em quantidade e variedade adequadas. Uma vez digeridos os alimentos, os seus nutrientes são absorvidos e distribuídos para todos os tecidos. Alguns nutrientes são usados para a construção e a reparação dos tecidos vivos, enquanto outros promoverão a liberação da energia indispensável às atividades vitais (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; PEREIRA, 2015). Conforme dito ao longo deste capítulo, a energia utilizada pelas células pararealizar suas atividades provém da ruptura gradual de ligações covalentes de moléculas de compostos orgânicos ricos em energia (PEREIRA, 2015). Na fotossíntese, graças ao pigmento clorofila, principalmente, é processada a acumulação da imergia solar sob a forma de ligações químicas nos hidratos de carbono, principalmente hexoses, que se polimerizam para formar amido. As hexoses originadas na fotossíntese são fonte de energia e também de carbono em condições de ser utilizado para a síntese de diversas macromoléculas (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; PEREIRA, 2015; ALBERTS et al., 2017). Como já visto, as células animais não usam diretamente a energia liberada por hidratos de carbono e gorduras, elas utilizam o ATP, um composto intermediário comumente produzido graças à energia contida nas moléculas de glicose e de ácidos graxos. O ATP tem duas ligações ricas em energia, sendo que, quando uma delas se rompe, libera aproximadamente 10 kcal por mol. Geralmente, apenas uma ligação é rompida, segundo a equação ATP → ADP + Pi + energia. As substâncias orgânicas, de acordo com suas funções no organismo, são classificadas em plásticas, energéticas e reguladoras (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012) e, independentemente dessa classificação/função, todas as macromoléculas provenientes dos alimentos podem cumprir todas essas funções celulares mencionadas. A célula obtém energia de carboidratos, lipídios e proteínas, nessa ordem, e a partir de seus produtos, monossacarídeos, ácidos graxos e aminoácidos, respectivamente. Nos animais, os ácidos graxos são, do ponto de vista quantitativo, uma fonte energética muito mais importante do que carboidratos. Enquanto 1 mol de glicose gera 36 38 mols de ATP, uma de ácido palmítico gera 126 mols de ATP. Um homem adulto tem energia depositada em glicogênio suficiente apenas para um dia, mas gordura (ácidos graxos) suficiente para fornecer energia durante um mês. Quando o organismo está em repouso, as células usam mais glicose, proveniente do glicogênio, porém, durante o exercício físico, há mobilização dos ácidos graxos depositados nas gorduras (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; PEREIRA, 2015). O citoplasma contém energia acumulada nos depósitos de triacilglicerídios, de moléculas de glicogênio e, também, sob a forma de compostos intermediários ricos em energia (dos quais o mais importante é o ATP), principais combustíveis das células. Isso porque os triacilglicerídios e o glicogênio representam acúmulo de energia sob forma estável e concentrada, mas dificilmente acessível, ao passo que o ATP é um composto instável, que não contém energia tão concentrada, mas facilmente utilizável porque a enzima que rompe a molécula de ATP (ATPase) é muito abundante na célula (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2012; BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014; PEREIRA, 2015). A decomposição da glicose em água e gás carbônico, que ocorre durante a respiração celular, rende 690 kcal/mol, enquanto a hidrólise das duas ligações ricas em energia do ATP rende somente 20 kcal/mol. A queima da glicose libera uma quantidade certa de energia e consome oxigênio. O resultado dessa operação, que pode ser realizada em um aparelho chamado calorímetro, produz calor (690 kcal/mol), água e gás carbônico, segundo a equação (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014): C6 H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2 O + calor (energia) Essa combustão da glicose é, porém, um processo abrupto, que leva o calorímetro rapidamente a altas temperaturas. Se isso ocorresse dentro de uma célula, ela se queimaria instantaneamente. Contudo, as células desenvolveram um sistema que oxida lentamente os nutrientes, liberando energia gradualmente e produzindo água e CO2. Esse processo, que consome O2 e produz CO2, chama-se respiração celular (BERG; STRYER; TYMOCZKO, 2014). 37 5 DIVISÃO CELULAR: MITOSE E MEIOSE A única maneira de se obter novas células é pela divisão daquelas que já existem. Isso ocorre por intermédio da sequência de eventos, conhecida como ciclo celular, um mecanismo essencial para a reprodução dos seres vivos. (HERNANDEZ, 2018). Neste capítulo, você verá de que forma a célula produz dois novos organismos, a partir de um organismo unicelular, e os dois tipos de divisão celular e nuclear das células eucarióticas: mitose e meiose, além da sua relação com a reprodução nos organismos eucarióticos. 5.1 O ciclo e a divisão celular É por meio do ciclo celular que ocorre a duplicação do DNA nos cromossomos, para separar este material para as células-filha geneticamente idênticas, de forma que cada célula receba uma cópia íntegra de todo o genoma. Além de DNA, a célula também duplica suas organelas e o seu tamanho antes de dividir. Desta forma, durante toda a interfase – G1, S e G2, uma célula, em geral, continua a transcrever genes, sintetizar proteínas e aumentar a massa, fornecendo o tempo necessário para a célula crescer e duplicar as suas organelas citoplasmáticas, mantendo o seu tamanho. Acompanhe na Figura abaixo a representação do ciclo da interfase. . O ciclo celular eucariótico costuma ocorrer em quatro fases. Fonte: Alberts et al. (2017, p. 605). 38 5.2 Mitose, meiose e citocinese 5.2.1 Mitose A fase M, que inclui a mitose mais a citocinese, ocorre rapidamente. A célula reorganiza todos os seus componentes e os distribui de forma igual entre as duas células-filha. Embora nesta fase ocorra uma sequência contínua de eventos, ela é dividida em uma série de seis estágios. Os primeiros cinco da fase M são: prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase. Estas fases constituem a mitose, que é definida como o período em que os cromossomos estão visíveis (forma condensada), como pode ser observado na Figura a seguir: Fonte: Chandar e Viselli (2015, p. 191). De acordo com a figura anterior, a mitose ou divisão do núcleo é um processo contínuo que pode ser dividido em cinco fases. As células em divisão permanecem cerca de 1 hora na mitose e depois de completada, ocorre a citocinese, que envolve a divisão citoplasmática. Como resultado se tem a formação de duas células-filha separadas a partir de uma célula progenitora. (ROSA, 2018). 39 5.2.2 Meiose Diferente da mitose, em que uma única célula pode gerar um grande número de outras, a meiose resulta em apenas quatro células-filha, que podem não sofrer outras duplicações. Tanto a mitose quanto a meiose estão envolvidas na reprodução, mas possuem funções reprodutivas diferentes. A reprodução assexuada ou reprodução vegetativa, baseia-se na divisão mitótica do núcleo. Assim, uma célula que passa pela mitose pode ser um organismo inteiro unicelular se reproduzindo com cada ciclo celular ou pode ser uma célula em um organismo multicelular que quebra uma parte para produzir um novo organismo multicelular. (ROSA, 2018). Alguns multicelulares reproduzem-se através da liberação de células provenientes da mitose e da citocinese ou por terem perdido uma parte que se desenvolve por si mesma. Na reprodução assexuada, os descendentes são clones do organismo original, ou seja, os descendentes constituem-se geneticamente idênticos aos pais, como alguns cactos com caules frágeis que se quebram facilmente, seus fragmentos caem no chão e formam raízes, que desenvolvem mitoticamente uma nova planta geneticamente idêntica à planta de que ela se originou, por exemplo. Se existe alguma variação entre os descendentes, provavelmente é resultado de mutações ou alterações no material genético, a reprodução assexuada é uma maneira rápida e efetiva de produzir novos indivíduos. Diferente da reprodução assexuada, a reprodução sexuada é resultado de um organismo não idêntico ao original. Ela requer gametas criados por meiose, ou seja, dois pais, cada um contribuindo com um gameta para cada descendente. A meiose produz gametas, diferentes geneticamentenão apenas de cada pai e mãe, mas também, uns dos outros. Devido a essa variação genética, alguns descendentes podem estar melhor adaptados do que outros para sobreviver e reproduzir em determinado meio. Desta forma, a meiose gera a diversidade genética, que é a matéria-prima da seleção natural e da evolução. (ROSA, 2018). Em grande parte dos seres multicelulares, as células somáticas, células do corpo não especializadas para reprodução, contêm dois conjuntos de cromossomos cada, encontrados em pares. Um cromossomo de cada par, de cada um dos pais do organismo. Os pares homólogos assemelham-se em tamanho e aparência, eles carregam informações genéticas similares, porém, geralmente, não idênticas. Os gametas, por outro lado, contêm apenas um único grupo de cromossomos, um 40 homólogo a partir de cada par. O número de cromossomos em um gameta denomina- se n, e a célula é dita haploide. Dois gametas haploides fusionam, formando um novo organismo, o zigoto, em um processo chamado de fertilização. Assim, o zigoto possui dois grupos de cromossomos, como as células somáticas fazem. Seu número de cromossomos denomina-se 2n e o zigoto é dito diploide. Com isto, a reprodução sexuada consiste na seleção aleatória da metade do conjunto de cromossomos diploides dos pais, para formar um gameta haploide, seguido da fusão de dois destes gametas haploides, a fim de produzir uma célula diploide que contenha a informação genética de ambos os gametas. Todas as etapas contribuem para uma mistura da informação genética na população, em que não há dois indivíduos exatamente com a mesma constituição genética. A meiose é formada por duas divisões nucleares que reduzem o número de cromossomos para o número haploide em preparação para a reprodução sexuada. Apesar de o núcleo se dividir duas vezes durante a meiose, o DNA é replicado apenas uma vez. Distinto dos produtos da mitose, os produtos da meiose diferem tanto entre eles quanto da célula que os originou. Para facilitar, é necessário lembrar as funções gerais da meiose, que é reduzir o número de cromossomos, de diploides para haploides, assegurar que cada um dos produtos haploides possua um conjunto completo de cromossomos e promover a diversidade genética entre os produtos. (ROSA, 2018). 5.2.3 Citocinese Para que ocorra a formação de duas células-filha distintas, a divisão citoplasmática segue a divisão nuclear. Um microfilamento de actina se forma para criar a maquinaria necessária e a contração desta estrutura, com base na actina, forma uma fenda de clivagem que inicia na anáfase. A fenda se aprofunda até que os cantos opostos se juntem. As membranas plasmáticas se fusionam em cada lado da fenda de clivagem profunda, o resultado é a formação de duas células-filha separadas, idênticas entre si e à célula parental original, marcando o termino do ciclo celular. (ROSA, 2018). 41 5.3 Etapas da mitose e da meiose 5.3.1 Mitose Durante a mitose, ocorrem as etapas que serão descritas a seguir. Prófase: nesta etapa, o envelope nuclear permanece intacto, enquanto a cromatina é duplicada durante a fase S, que condensa em estruturas cromossomais definidas, que são as cromátides. Os cromossomos são a forma como as duas cromátides-irmãs, conectadas por um centrômero, estão. Os cinetocoros são complexos proteicos especializados que se formam e se associam a cada cromátide. Os microtúbulos do fuso mitótico vão se ligando a cada cinetocoro, à medida que os cromossomos são separados mais adiante, na mitose. Os microtúbulos do citoplasma desmontam e, então, se organizam na superfície do núcleo para formar o fuso mitótico. Os pares de centríolos se afastam pelo crescimento dos feixes de microtúbulos que formam o fuso mitótico, o nucléolo e a organela dentro do núcleo, onde os ribossomos são produzidos, se desmontando na prófase. (ROSA, 2018). Prometáfase: o início da prometáfase é marcado pela desmontagem do envelope nuclear. Os microtúbulos do fuso se ligam aos cinetocoros e os cromossomos são puxados pelos microtúbulos do fuso. Metáfase: na metáfase, há o alinhamento das cromátides na “linha equatorial” do fuso, entre os dois polos. As cromátides alinhadas formam a placa metafásica. Durante esta etapa, as células podem ser pausadas, quando os inibidores de microtúbulos são usados. Testes de cariótipos, utilizados para determinar o número e a estrutura cromossômica, normalmente, requerem células em metáfase, devido à facilidade de visualização. Anáfase: aqui, os polos mitóticos são separados mais ainda, como resultado do alongamento dos microtúbulos polares. Cada centrômero divide-se em dois e os cinetocoros pareados se separam. As cromátides-irmãs migram na direção dos polos opostos do fuso. Telófase: para finalizar a divisão nuclear, durante a telófase ocorre o desmonte dos microtúbulos do cinetocoro e a dissociação do fuso mitótico. Os envelopes nucleares se formam em torno de cada núcleo, contendo as cromátides. 42 As cromátides se descondensam em cromatina dispersada ou heterocromatina e os nucléolos se formam novamente no núcleo das células-filha. 5.3.2 Meiose A primeira divisão meiótica reduz o número de cromossomos, ou seja, durante a meiose I, os cromossomos homólogos estão reunidos para parear por toda sua extensão. Nenhum pareamento desses ocorre na mitose e, depois, da metáfase I, os cromossomos homólogos se separam. Os cromossomos individuais, em duas cromátides-irmãs, permanecem intactos até o final da metáfase II, na segunda divisão meiótica. (ROSA, 2018). Assim, como a mitose, a meiose I é precedida por uma interfase com uma fase S, em que cada cromossomo se replica. O resultado disto é que cada cromossomo representa duas cromátides-irmãs unidas por proteínas coesinas. A meiose I inicia com uma longa prófase I, durante a qual os cromossomos mudam. Os cromossomos homólogos se pareiam ao longo da sua extensão, no processo chamado de sinapse. Este processo de pareamento ocorre a partir da prófase I e irá até o final da metáfase I. No momento em que os cromossomos podem ser claramente visualizados sob o microscópio óptico, os dois homólogos já se encontram unidos fortemente. Quem faz essa união são os telômeros, por meio do reconhecimento de sequências homólogas de DNA nos cromossomos homólogos. Além disso, um grupo especial de proteínas pode formar uma armação chamada de complexo sinaptonemal, que ocorre longitudinalmente nos cromossomos homólogos e para mantê-los unidos. No momento em que os cromossomos podem ser claramente visualizados sob o microscópio óptico, os dois homólogos já se encontram unidos fortemente. Quem faz essa união são os telômeros, por meio do reconhecimento de sequências homólogas de DNA nos cromossomos homólogos. Além disso, um grupo especial de proteínas pode formar uma armação chamada de complexo sinaptonemal, que ocorre longitudinalmente nos cromossomos homólogos e para mantê-los unidos. 43 6 BIOLOGIA MOLECULAR: SEQUENCIAMENTO DE DNA A partir da década de 1970, com o desenvolvimento das primeiras técnicas de sequenciamento de DNA, uma série de paradigmas na Biologia Molecular foi quebrada e um volume enorme de novas informações e novas tecnologias pôde ser desenvolvido a partir da informação da sequência de pares de bases presente no DNA. O sequenciamento de genomas representa um desafio aos métodos de sequenciamento de DNA: genomas completos, mesmo os bacterianos, são extremamente longos. Assim, a determinação da sequência de bases de genomas completos exige estratégias experimentais específicas para contornar essa questão, e a análise desse enorme volume de sequências também exige ferramentas computacionais adequadas. Neste capítulo, você receberá as ferramentas necessárias para descrever os princípios dos principais métodos
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