Cariotipagem Clássica e FISH

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Prof. Dr. Alexandre Dias
UNIDADE I
Estudos Disciplinares
Cariotipagem Clássica 
e FISH
 “Estudo dos cromossomos, sua estrutura, suas anormalidades e seu comportamento, 
baseados em uma suspeita clínica”.
O que é citogenética?
Relembrando… o DNA e sua estruturação
Cromossomo
Histona
DNAMedical Cell Biology
Fonte: Adaptado de: Goodman, S.R.
A T
A T
C C
A estrutura cromossômica
A determinação do número cromossômico da espécie humana
Fonte: Adaptado de: Tijo, J. H. & Levan, A. The chromosome
number of man. Hereditas 42, 1-6 (1956)
Fonte: Adaptado de: Gartler Nature Reviews Genetics 7, 655-660 (August 2006) | doc 10.1038/nrg1917
Figure 4 | Joe Hin Tijo. Reproduced with permission
from REF. 25 © (1979) Springer Verlag.
Figure 3 | Albert Levan. Reproduced with permission
from REF. 25 © (1979) Springer Verlag.
Figure 5 | A human metaphase plate, from the original Tijo
and Levan paper, showing 46 chromosomes. Reproduced 
with permission from REF. 14 © (1956) Blackwell Publishing.
 Cariótipo é o conjunto cromossômico de cada espécie. Representa o número total 
de uma célula somática (2n).
Espécie humana:
 Células somáticas = 2n (diploide) – 46 cromossomos.
O que é o cariótipo?
 Células somáticas = 2n (diploide) – 46 cromossomos.
 23 pares de cromossomos 
 22 autossomos
 1 par sexual 
 XX – Mulheres
 XY – Homens
Constituição cariotípica da espécie humana
Fonte: Montenegro e Dias, 2011.
Tipos de cromossomos na espécie humana
 Idade materna avançada.
 Genitores com translocação balanceada.
 Gestações anteriores com relatos de aneuploidias ou anomalias cromossômicas.
 Malformação fetal.
 Abortamentos de repetição – dois ou mais abortos.
 Ansiedade materna.
 Outras indicações.
Quando fazer o cariótipo?
Assinale a alternativa em que teste de cariotipagem deve ser realizado:
a) Casais com perdas reprodutivas recorrentes.
b) Recém-nascidos com malformações congênitas.
c) Feto visualizado pela ultrassonografia com anormalidades indicativas de aneuploidias.
d) Pacientes com câncer hematológico (leucemias).
e) Em todas as situações propostas acima.
Interatividade
Assinale a alternativa em que teste de cariotipagem deve ser realizado:
a) Casais com perdas reprodutivas recorrentes.
b) Recém-nascidos com malformações congênitas.
c) Feto visualizado pela ultrassonografia com anormalidades indicativas de aneuploidias.
d) Pacientes com câncer hematológico (leucemias).
e) Em todas as situações propostas acima.
Resposta
 Material biológico utilizado para a realização do cariótipo.
 Sangue (linfócitos). 
 Medula óssea (diagnóstico de câncer hematológico).
 Biópsia cutânea.
 Amniócitos, biópsia de vilosidade coriônica, sangue de cordão, material de aborto 
(pré-natal).
 Biópsia de tumores sólidos.
Cariotipagem – Coleta
 *Todos os materiais utilizados devem ser estéreis.
Cariotipagem – Semeadura
Seringa heparinizada
(Heparina sódica)
Tubo a vácuo 
(Heparina sódica)
Meio de cultura
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Meio de cultura
e sangue
identificados
Enriquecimento 
do meio de cultura
Suplemento para 
meio de cultura
Fluxo laminar
Cariotipagem – Semeadura
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
10 a 12 gotas de sangue 
ou camada de linfócitos
Homogeneizar 
cuidadosamente
Estufa de cultura 
por 72 horas
3 dias depois...
Cariotipagem – Cultura de células
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Condensação máxima dos cromossomos
Metáfase
Anáfase
Final da anáfase
Telófase
Prófase
Final da prófase
Mitose
Intérfase
Molecular Biology of the Cell.
Fonte: Adaptado de: Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Watson, J.
Cariotipagem – Colchicina
80 a 100 ul de colchicina
Estufa por 45 a 60 min.
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Inibição da formação das fibras do fuso
Fonte: Adaptado de: EPM, UNIFESP
Centríolos Cromossomos
Fuso mitótico
Cariotipagem – Hipotonização
Após 72hs de incubação
centrifugar
Após centrifugação
Retirar sobrenadante 
Adicionar 5ml hipotônica
Estufa por 20 min
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Fixação
Retirar sobrenadante 
Adicionar 5 ml fixador 3:1
Centrifugar
Repetir por mais 3 vezes
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Preparo das lâminas
Deixar 1 ml de suspensão
Pingar as lâminas no banho-maria 
e deixar secar
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Coloração das lâminas
Deixar agir por 10 a 15 min.
Lâminas coradas
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Análise
Fotomicroscópio
Análise
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Qual a finalidade da fitohemaglutinina?
a) Estimular a proliferação celular no processo do cultivo de linfócitos de sangue periférico.
b) Inibir a formação das fibras do fuso mitótico.
c) Melhorar o espalhamento cromossômico.
d) Interromper o ciclo celular em metáfase.
e) Evitar o crescimento e proliferação bacteriana no cultivo celular.
Interatividade
Qual a finalidade da fitohemaglutinina?
a) Estimular a proliferação celular no processo do cultivo de linfócitos de sangue periférico.
b) Inibir a formação das fibras do fuso mitótico.
c) Melhorar o espalhamento cromossômico.
d) Interromper o ciclo celular em metáfase.
e) Evitar o crescimento e proliferação bacteriana no cultivo celular.
Resposta
 Coloração convencional – coloração única.
 Bandamento G – padrões claros (CG – “genes ativos”) e escuros (AT).
 Bandamento C – heterocromatina constitutiva.
 Bandamento NOR – RON – constrições secundárias dos cromossomos com satélites.
 Bandamento Q – quinacrina mostarda (fluorescente) – bandas 
brilhantes (AT) e opacas (CG) – Y.
 Bandamento R – salina e calor (inverso da G).
Técnicas de coloração das lâminas
Coloração convencional
Identificação dos 
cromossomos por 
grupos.
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração – Bandamento G
Identificação dos 
cromossomos por 
pares.
46,XX
46,XY
Fonte: Montenegro e Dias, 2011
Coloração – Bandamento C
Identificação de 
regiões de 
heterocromatina e 
centrômero.
Fonte: Labgen, 2009
Coloração – Bandamento NOR
Identificação 
de regiões 
organizadoras de 
nucléolos.
Cromossomos 
acrocêntricos 
satelitados.
Fonte: Labgen, 2009
Cariotipagem – Bandamento R
Fonte: Software Ikaros
Cariotipagem – Bandamento Q
Fonte: Software Ikaros
Cariotipagem
1. Cultivo de células.
2. Baixo custo.
3. Análise: profissionais qualificados.
4. Tempo para liberação de laudos diferenciados.
Atenção!
Pontos de atenção para o teste de Cariotipagem
Processo de cultura de células – depende de diversos fatores para o sucesso:
 Crescimento celular;
 Contaminações;
 Células em metáfase para análise do cariótipo;
 Bandamento cromossômico;
 Limitação técnica – resolução 5 Mb.
Concluindo
Qual a técnica de coloração utilizada na cariotipagem que permite identificar as regiões 
de heterocromatina constitutiva e centromérica dos cromossomos?
a) Bandamento NOR.
b) Bandamento R.
c) Bandamento Q.
d) Bandamento C.
e) Bandamento G.
Interatividade
Qual a técnica de coloração utilizada na cariotipagem que permite identificar as regiões 
de heterocromatina constitutiva e centromérica dos cromossomos?
a) Bandamento NOR.
b) Bandamento R.
c) Bandamento Q.
d) Bandamento C.
e) Bandamento G.
Resposta
Localização do centrômero:
 Metacêntrico, submetacêntrico e acrocêntrico.
Tamanho do cromossomo:
 Maiores, grandes, intermediários e pequenos.
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Classificação cromossômica:
 Coloração convencional:
 Grupo A
 Grupo B
 Grupo C
 Grupo D
 Grupo E
 Grupo F
 Grupo G
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo A
Pares cromossômicos:
 1
 Maiores cromossomos metacêntricos
 2
 Maiores cromossomos submetacêntricos
 3
 Grandes cromossomos metacêntricos
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo B
Pares cromossômicos:
 4 e 5
 Grandes cromossomos submetacêntricos
 p<<<q
Coloração convencional– Classificação cromossômica
Grupo C
Pares cromossômicos:
 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e X
 Cromossomos submetacêntricos intermediários.
 Homens: 15 cromossomos
 Mulheres: 16 cromossomos
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo D
Pares cromossômicos:
 13, 14 e 15
 Grandes cromossomos acrocêntricos. 
 Possuem satélites.
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo E
Pares cromossômicos:
 16, 17 e 18
 Pequenos cromossomos submetacêntricos. 
 16 – “ligeiramente metacêntrico”.
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo F
Pares cromossômicos:
 19 e 20
 Pequenos cromossomos metacêntricos. 
 “gravatinhas”
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo G
Pares cromossômicos:
 21, 22 e Y
 Pequenos cromossomos acrocêntricos. 
 21 e 22 – possuem satélites
 Y – NÃO possui satélites
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Ordem de análise
Coloração convencional – Análise
1º – Grupo A
2º – Grupo B
3º – Grupo D
4º – Grupo G
5º – Grupo E
6º – Grupo F
7º – Grupo C
Primeiro passo:
 Dividir a figura em 4 quadrantes
 Contar o número de cromossomos
Coloração convencional – Análise
16
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo A
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo B
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo D
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo G
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo E
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo F
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo C
Fonte: Arquivo pessoal
 ISCN – An International System for Human Cytogenetics Nomenclature. Mitelmam F.(ed): S. 
Karger, Basel, 2016.
 Função: Universalização das interpretações do resultado citogenético.
Exemplo:
46,XX ou 46,XY – normal
47,XY,+21
45,X
46,XY, del (5) (p14®pter)
Nomenclatura
Nº de cr Cr Sx, Tipo Alt. (Banda )(Cr. ),
Qual a finalidade diagnóstica da identificação/classificação cromossômica 
por coloração convencional?
a) Identificar cada par cromossômico com exatidão.
b) Detectar microdeleções e microduplicações cromossômicas.
c) Identificar alterações numéricas e grandes anormalidades estruturais.
d) Identificar as regiões de heterocromatina dos cromossomos acrocêntricos.
e) Investigar alterações cromossômicas submicroscópicas (menores que 5 Mb).
Interatividade
Qual a finalidade diagnóstica da identificação/classificação cromossômica 
por coloração convencional?
a) Identificar cada par cromossômico com exatidão.
b) Detectar microdeleções e microduplicações cromossômicas.
c) Identificar alterações numéricas e grandes anormalidades estruturais.
d) Identificar as regiões de heterocromatina dos cromossomos acrocêntricos.
e) Investigar alterações cromossômicas submicroscópicas (menores que 5 Mb).
Resposta
ATÉ A PRÓXIMA!