Apostila de Exercícios

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1 
Departamento de Bioquímica 
Instituto de Química - USP 
 
 
 
 
EXERCÍCIOS 
 
 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
QBQ 0316-Diurno 
2013 
 
 
 
 
 
 
Professores 
 
Ohara Augusto 
Sayuri Miyamoto 
 
 
 
Monitores 
 
Veronica Paviani 
Paulo Newton Tonolli 
 
 2 
1. Para obter um emprego de bioquímico, solicita-se que você assista a um vídeo que 
mostra um colega purificando a citrato sintase a partir de coração de boi. Em 
determinados passos do protocolo (descrito abaixo) o entrevistador para o vídeo e lhe 
coloca questões. Responda as questões formuladas (em itálico). 
a) Vinte quilos de coração bovino são retirados de um matadouro e transportados ao 
laboratório em gelo. O bioquímico começa a processar os corações e realiza todas as 
etapas numa câmara fria (~5 oC) ou sob gelo. O tecido cardíaco é picado, suspenso em 
uma solução de sacarose 0,2 M tamponada a pH 7,2 e homogeneizado com um 
homogeneizador de alta velocidade. Porque foi utilizado tecido cardíaco e em grande 
quantidade para purificar a citrato sintase? Qual o propósito de manter o tecido frio e 
suspendê-lo em sacarose 0,2 M a pH 7,2? O que ocorre com o tecido quando é 
homogenizado? 
 
b) O homogenato do tecido, que é denso e opaco, é submetido a uma série de etapas de 
centrifugação diferencial. O que se consegue com esse procedimento? 
 
c) A purificação continua com a fração que contém principalmente mitocôndrias 
intactas. Essas são então lisadas osmóticamente. O lisado que é menos denso que o 
homogenado, mais ainda opaco, consiste principalmente de membranas mitocôndriais e 
conteúdo mitocôndrial interno. Ao lisado, adiciona-se sulfato de amônio até uma 
concentração específica. A solução é centrifugada, o precipitado descartado e o 
sobrenadante recolhido. A este, que é mais claro que o lisado, adiciona-se mais sulfato 
de amônio. Nova centrifugação é realizada, mas desta vez, o precipitado é recolhido 
porque contém a proteína de interesse. Qual a razão para se adicionar o sal em duas 
etapas? 
 
d) O precipitado de sulfato de amônio é solubilizado e dialisado contra grandes volumes 
de uma solução tamponada a pH 7,2. Por que o sulfato de amônio não é incluído no 
tampão de diálise? Por que se utiliza uma solução tamponada em vez de água? 
 
e) A solução dialisada é aplicada em uma coluna de cromatografia por exclusão. A 
eluição das proteínas da coluna é acompanhada por medidas de absorção de luz das 
frações a 280 nm. A primeira fração protêica que sai da coluna é recolhida e todas as 
outras frações são descartadas. O que a coleta da primeira fração nos diz sobre a 
 3 
proteína de interesse? Por que a absorção de luz a 280 nm é uma boa maneira de se 
monitorar a presença de proteínas nas frações eluídas? 
 
f) A fração coletada em e) é então aplicada numa coluna cromatográfica de troca 
catiônica. Após desprezar a solução inicial que deixa a coluna, o bioquímico adiciona 
uma solução de pH mais alto à coluna e colhe a fração protéica que é imediatamente 
eluída. Qual a razão para o bioquímico fazer isso? 
 
2. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares 
redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no 
carbono 1 das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto 
que absorve luz a 540 nm. Alunos de um curso de bioquímica experimental, usando 
uma solução 5 mM de glicose, montaram a seguinte curva padrão e obtiveram os 
seguintes resultados após ferver as amostras por 10 min. 
Glicose 
µL 
Água 
µL 
reagente DNS 
µL 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 
540 nm 
0 500 500 0,005 
50 450 500 0,120 
100 400 500 0,240 
150 350 500 0,360 
200 300 500 0,480 
250 250 500 0,600 
300 200 500 0,720 
350 150 500 0,840 
400 100 500 0,960 
450 50 500 1,080 
500 0 500 1,200 
 
O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a 
quantidade de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, 
reduz um grupo NAD+ para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um 
grupo como a o-dianisidina, a qual ao ser oxidada passa a absorver luz a 420nm. Foi 
montada uma curva padrão com uma solução de glicose 0,5 mM e, após incubar a 
amostra por 1 hora a 37°C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados 
 4 
Glicose 
µL 
Água 
µL 
reagente TGO 
µL 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 
420 nm 
0 500 500 0,020 
50 450 500 0,100 
100 400 500 0,200 
150 350 500 0,300 
200 300 500 0,400 
250 250 500 0,500 
300 200 500 0,600 
350 150 500 0,700 
400 100 500 0,800 
450 50 500 0,900 
500 0 500 1,000 
 
O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açucares 
presentes em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol 
com os grupos hidroxila é gerado um produto que absorve a 490 nm. Foi montada a 
curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mM e após a reação foram obtidos 
os dados abaixo 
Glicose 
µL 
Água 
µL 
reagente FS 
µL 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 
490 nm 
0 400 400 0,001 
10 390 400 0,056 
20 380 400 0,087 
50 350 400 0,207 
100 300 400 0,380 
150 250 400 0,577 
200 200 400 0,765 
250 150 400 0,979 
300 100 400 1,180 
400 0 400 1,514 
 
 
 5 
Uma série de homogeneizados do caule de diferentes linhagens de cana de açúcar foi 
testada para saber qual das linhagens possui a maior quantidade de açucares solúveis, o 
que é de grande interesse para a indústria açucareira. Uma certa massa de tecido foi 
homogenizada em água e este material foi centrifugado por 10 min a 10.000 xg a 4°C. 
O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do 
ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os 
resultados estão expostos na tabela abaixo. 
Linhagem Massa 
de 
tecido 
(g) 
Volume final 
do 
sobrenadante 
(mL) 
Diluição 
(x) 
Amostra 
(µL) 
Abs 
540nm 
(DNS) 
Abs 
420 nm 
(TGO) 
Abs 
490 nm 
(FS) 
1 10 10 100 100 0,001 0,003 0,812 
2 5 10 20 100 0,005 0,001 1,525 
3 7 10 30 100 0,003 0,002 1,210 
4 2 10 5 100 -0,002 -0,009 0,994 
5 25 10 200 100 -0,010 0,001 0,853 
6 12 10 100 100 0,000 0,007 1,112 
7 8 10 100 100 0,001 -0,008 1,215 
8 10 10 100 100 0,003 -0,001 1,336 
9 4 10 15 100 0,002 0,001 1,201 
10 1 10 2 100 -0,008 0,002 1,487 
 
Qual das técnicas é a melhor para esse teste? Como você explicaria esses resultados? 
Calcule a concentração de açucares solúveis nos diferentes homogeneizados e a 
quantidade de açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas 
é a melhor para a produção de sacarose? 
 
 
3. Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de 
levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal 
obteve várias linhagens de levedura e necessita medir a atividade de alfa-glicosidase 
presente nas células. Quais das técnicas – DNS, TGO ou FS – você usaria para medir a 
atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato 
 
 6 
4. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em 
todas as amostras usou 1g de células e obtiveram 10 mL de lisado. Esses lisados foram 
utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pNPαglc) 
como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir 
 
linhagem diluição 
µl 
lisado 
diluído 
µL 
água 
µL 
pNPαglc 
Abs 420 
15 min 
Abs 420 
30 min 
Abs 420 
45 min 
Abs 420 
60 min 
A 100x 100 100 200 0,050 0,100 0,150 0,200 
B 50x 20 180 200 0,080 0,160 0,240 0,320 
C 8x 50 150 200 0,250 0,500 0,750 1,000 
D 70x 200 0 200 0,100 0,200 0,300 0,400 
E 500x 200 0 200 0,010 0,020 0,030 0,040 
F 200x 200 0 200 0,075 0,150 0,225 0,300 
 
 
As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de 
Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dadosa seguir. Confeccionou-se também 
uma curva padrão usando albumina de ovo. 
 
 
Dados para amostras experimentais 
 
linhagem diluição 
µl 
lisado 
diluído 
µL 
água 
Reagente 
Bradford 
(mL) 
Abs 595 
15 min 
A 20x 100 0 1 0,265 
B 50x 20 80 1 0,320 
C 10x 50 50 1 0,550 
D 20x 80 20 1 0,105 
E 5x 10 90 1 0,750 
F 80x 100 0 1 0,415 
 
 
 
 7 
Dados da curva padrão 
 
Albumina 
0,2 g/L 
µL 
água 
Reagente 
de 
Bradford 
(mL) 
Massa 
de 
proteína 
Abs 
595nm 
0 100 1 0,010 
10 90 1 0,080 
20 80 1 0,160 
30 70 1 0,240 
40 60 1 0,320 
50 50 1 0,400 
60 40 1 0,480 
70 30 1 0,560 
80 20 1 0,640 
90 10 1 0,720 
100 0 1 0,800 
 
Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de 
levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a 
concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um 
dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, 
qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for 
necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as 
respostas. 
 
 
5 .– Um homogeneizado do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da 
enzima alfa-glicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obteve-
se uma atividade enzimática de 80 mU/ml e uma atividade específica de 80 mU/mg. A 
fim de purificar esta alfa-glicosidase, 1,5 ml deste homogeneizado foram submetidos a 
uma cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e obteve-se o 
seguinte perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a 
cromatografia: 
 8 
0
0,1
0,2
0,3
0 5 10 15 20
tubos
ab
s 
42
0n
m
(li
nh
a 
co
nt
ín
ua
)
0
0,5
1
 
[NaCl]
 (M)
(linha 
tracejada)
 
Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com 
volume de 1,0 ml foi denominado “material DEAE”. Em seguida, o material DEAE foi 
utilizado para determinação de atividade enzimática e concentração de proteína total. 
As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos estão descritos 
na tabela abaixo: 
Substrato 
(p-nitrofenil α-
glucosídeo 4 mM) 
 
Material DEAE 
Tempo de 
incubação a 30°C 
(min) 
 
Abs 420nm 
50 microlitros 50 microlitros 5 0,1 
50 microlitros 50 microlitros 10 0,19 
50 microlitros 50 microlitros 15 0,32 
50 microlitros 50 microlitros 20 0,4 
Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva padrão 
utilizada para cálculo da atividade enzimática tem a equação y = 0.0056x (y=Abs; 
x=nmols). 
 
As condições utilizadas para determinação da concentração de proteína total estão 
descritas na tabela abaixo: 
 
Material DEAE 
(ml) 
 
Água 
(ml) 
Reagente de 
Bradford 
(comassie blue G) 
 
Abs 595 nm 
0,01 ml 0,99 ml 1 ml 0,052 
0,04 ml 0,96 ml 1 ml 0,13 
0,05 ml 0,95 ml 1 ml 0,15 
 9 
0,1 ml 0,90 ml 1 ml 0,35 
A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume 
que a tabela acima está apresentada a seguir. 
y = 0,01x + 0,05
R2 = 1
0
0,1
0,2
0 2 4 6 8 10 12
microgramas de proteína
ab
s 
59
5n
m
 
Utilizando estas informações e resultados determine: 
1 – A atividade enzimática (mU/ml) do “material DEAE” 
2 – A concentração de proteína total (mg/ml) do “material DEAE” 
3 – A atividade específica do “material DEAE” 
4 – A recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
5 – O enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
 
Obs: 1 mU (miliunidade) de atividade enzimática corresponde a quantidade de enzima 
que catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de 
produto/minuto. 
 
6 . As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em 
uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das 
cromatografias foi realizada utilizando um tampão com pH diferente (9,0 – 8,0 – 6,0). 
Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pI (ponto 
isoelétrico) desta alfa-glicosidase. 
 10 
0
0.1
0.2
0.3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
ab
s 
42
0n
m
(li
nh
a 
co
nt
ín
ua
)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
 [NaCl]
 (M)
(linha 
tracejada)
tampão pH 9
 
0
0,1
0,2
0,3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
ab
s 
42
0n
m
(li
nh
a 
co
nt
ín
ua
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
 [NaCl]
 (M)
(linha 
tracejada)
tampão pH 8
0
0,1
0,2
0,3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
ab
s 
42
0n
m
(li
nh
a 
co
nt
ín
ua
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
 [NaCl]
 (M)
(linha 
tracejada)
tampão pH 6
 
 
7. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 
 
 1º passo: cromatografia de troca aniônica em pH 10. 
 2º passo: cromatografia de filtração em gel em pH 6,0. 
 
Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para 
este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a 
quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados. 
Passo Atividade de celulase 
aplicada (U) 
Atividade de celulase 
recuperada (U) 
Proteína total 
aplicada (mg) 
Proteína total 
recuperada (mg) 
Troca iônica 500 100 1.0 0.05 
Filtração em gel 100 80 0.05 0.02 
pH 9 
pH 8,0 
pH 6,0 
 11 
 
Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram 
reunidos e analisados por SDS-PAGE. 
 
Figura 1 – SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
M – meio de cultura; T – material recuperado após cromatografia de troca aniônica. F – 
material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P – padrões de peso 
molecular. 
Para a coluna de filtração em gel usada na marcha de purificação foi previamente 
preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. 
Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para 
cromatografia da celulase. 
 
 
 
Tabela 2 – Volumes de eluição na cromatografia de filtração em gel em uma coluna 
cujo, volume total é 25ml. 
 
Material Volume de eluição (mL) 
Proteína padrão de 2.000.000 daltons 7.53 
Proteína padrão de 66.000 daltons 9.38 
Proteína padrão de 45.000 daltons 10.46 
Proteína padrão de 12.400 daltons 13.70 
Proteína padrão de 6.500 daltons 16.22 
ATIVIDADE CELULÁSICA 9.58 
 
a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da 
purificação da celulase. 
 
b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de 
purificação. 
 
c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? 
 
14
23
31
45
M F P kDaT
Início 
Fim 
 12 
d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em 
gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 
 
 
8. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em uma 
cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto 
isoelétrico (pI) desta enzima é 7,0 e que esta cromatografia foi feita em tampão pH 8, 
construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias realizadas em pH 9,0 e pH 
4,0. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em relação 
ao gradiente de NaCl. 
 
0
0,1
0,2
0,3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
tubos
ab
s 
42
0n
m
(li
nh
a 
co
nt
ín
ua
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
 [NaCl]
 (M)
(linha 
tracejada)
tampão pH 8
 
 
 
9. Duas proteínas A e B apresentam uma solubilidade em função do pH dada pelo 
gráfico abaixo. Quando uma mistura dessas proteínas em tampão de pH 6,0 é aplicada 
em uma coluna de troca aniônica, uma delas é eluída normamente, enquanto a outra só é 
eluída após adição de tampão com quantidades crescentes de NaCl. 
 
 
 
Baseado nos dados acima, diga qual proteínaé eluída após adição de NaCl. Justifique 
sua resposta. 
 
10. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas 
que precisavam ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico 
utilizou uma coluna de gel filtração recomendada para proteínas de alto peso molecular 
(>60 kDa) e obteve o seguinte perfil de eluição: 
 13 
 
Figura - Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-200. As proteínas 
separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4, conforme indicado na figura. Os 
volumes aproximados de eluição para cada tubo foram: 
Tubo 1 = 10 ml 
Tubo 2 = 11 ml 
Tubo 3 = 13 ml 
Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml 
 
Volumes aproximados (+/- 0,5 ml) 
 
Usando essa mesma coluna de gel filtração, nas mesmas condições da corrida anterior, o 
bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes resultados: 
 
Padrão Vol. Eluição (ml) 
Proteína padrão de 2.000 kDa 7.53 
Proteína padrão de 250 kDa 9.38 
Proteína padrão de 170 kDa 10.46 
Proteína padrão de 65 kDa 13.70 
Proteína padrão de 24 kDa 16.22 
Volume total da coluna = 25 ml 
 
Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições 
redutoras e não redutoras, sendo obtido o seguinte perfil: 
 
Figura - Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/β-mercaptoetanol) e 
não redutoras das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço, encontram-se 
os padrões de pesos moleculares. 
 
 14 
Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a uma 
cromatografia de troca de ânions (-) em pH 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE das 
frações obtidas. Os resultados da cromatografia e da eletroforese estão na figura abaixo: 
 
Figura - Cromatografia de troca de ânions das proteínas no tubo 4 e eletroforese das 
proteínas presentes nos tubos 4A e 4B. 
 
 
O bioquímico deu-se então por satisfeito e escreveu o seu relatório final. 
 
a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra? 
b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma sub-
unidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica? 
c) Qual o pI aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)? 
 
11. Um nonapeptideo foi submetido a uma série de experimentos a fim de determinar 
sua estrutura primária. Inicialmente o peptídeo foi incubado com dinitrofluorobenzeno 
(DNF) e a seguir submetido a uma hidrólise ácida (HCl 6N – 110ºC – 3h). Os produtos 
deste procedimento foram analisados em cromatografia de camada delgada revelando o 
resultado abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Peptídeo Phe Ala Asp 
 15 
Posteriormente o nonapeptídeo foi hidrolisado na presença de quimotripsina. Os 
produtos desta reação foram separados e submetidos à degradação de Edman, 
obtendo-se o resultado abaixo: 
 
 Produto 1: Ala – Arg – Pro – Glu 
 Produto 2: Ala – Gly – Phe 
 Produto 3: Ala – Phe 
 
Por fim, o oligopeptideo foi hidrolisado na presença de tripsina, os produtos 
foram separados e submetidos à degradação de Edman. O resultado obtido foi: 
 
 Produto 1: Ala – Phe – Ala – Gly – Phe – Ala – Arg 
 Produto 2: Pro – Glu 
 
 Qual a estrutura primária deste oligopeptideo? 
 
Dados: Quimotripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Phe. 
Tripsina catalisa a hidrólise de ligações peptídicas após Arg. 
 
12. Uma mistura dos seguintes peptídeos: lisil-lisina e leucil-leucil-leucina foi 
submetida a uma corrida cromatográfica em papel no sistema de solvente composto por: 
butanol: ácido acético; água (4:1:1). Qual o peptídeo que apresenta maior Rf e por que? 
 
13. Um estudante executou o seguinte protocolo: 
1. Pesar 10 mg de um dipeptídeo, 1mg de fenilalanina, 1 mg de ácido aspártico e 1 mg 
de glicina 
2. Colocá-los em tubos separados com tampa de rosca e seguir os passos abaixo para 
cada um destes tubos. 
3. Adicionar ao tubo 0,75 mL de bicarbonato de sódio. 
4. Adicionar ao tubo 0,5 mL de DNF (dinitrofluorobenzeno) preparado em etanol. 
5. Fechar o tubo. 
6. Transferir o tubo para um banho a 30oC. 
7. Incubar o tubo por 3h. 
8. Retirar o tubo após esse período. 
9. Resfriar o tubo. 
10. Acidificar o meio com duas gotas de ácido clorídrico 6M. 
11. Transferir o tubo para um concentrador a vácuo 
12. Incubar o tubo por 15 min para secar o etanol. 
13. Retirar o tubo após esse período. 
14. Adicionar ao tubo 1 mL de ácido clorídrico 6M. 
15. Transferir o tubo para um bloco térmico (115° C). 
16. Incubar o tubo por 3h. 
17. Retirar o tubo após esse período. 
18. Resfriar o tubo em temperatura ambiente. 
19. Retirar 20 μL e transferir para um tubo de ensaio. 
20. Transferir o tubo de ensaio para um concentrador a vácuo. 
21. Aguardar a amostra secar completamente. 
22. Retirar o tubo após esse período. 
23. Resfriar o tubo. 
24. Adicionar 20 μL de etanol ao tubo. 
 16 
 
Em seguida 2 μl do material correspondente ao passo 24 para cada uma das amostras 
iniciais (dipeptídeo, fenilalanina, glicina e ácido aspártico) foram submetidos à 
separação em cromatografia de camada delgada utilizando a fase móvel Clorofórmio- 
Metanol-Ácido acético 95-4-1. Foi obtido o resultado abaixo. 
 
 
Responda: 
a) O protocolo acima foi realizado com o objetivo de obter qual informação a respeito 
do dipeptídeo? 
 
Considerando que estudante deixou de anotar a identificação das amostras 2, 3 e 4 e 
sabe apenas que a amostra 1 corresponde ao dipeptídeo. 
b) identifique o material (tipo de aminoácido) presente nas amostras 2, 3 e 4. Justifique 
sua resposta. 
c) identifique as “manchas” indicadas com as setas no material 1. Justifique sua 
resposta. 
d) Caso os passos 14 a 22 fossem omitidos do protocolo acima, qual das bandas 
(manchas) do material 1 teria uma migração diferente? Justifique a resposta. 
 
e) Caso os aminoácidos fenilanalina, ácido aspártico e glicina fossem dissolvidos em 
etanol e diretamente submetidos à separação em cromatografia de camada delgada em 
placa de sílica sem passarem pelas etapas do protocolo acima, qual das fases móveis 
sugeridas abaixo seria a mais indicada. Justifique sua resposta. Clorofórmio-Metanol-
Ácido acético (95-4-1) Clorofórmio-Metanol-Acido acético (60-30-10) Clorofórmio-
Metanol (97-3) 
 
 
14. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de 
diferentes concentrações de substrato (NpaGlc) na presença de diferentes concentrações 
de um inibidor. Estes dados estão apresentados na tabela abaixo. Baseando-se nesta 
tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise do substrato e o Ki para este inibidor. 
 
 17 
 
[S] (mM) V (nmol/min) 
[I] (mM) 0 2 4 6 8 
0.1 0.91 0.48 0.32 0.24 0.20 
0.2 1.67 0.91 0.63 0.48 0.38 
0.3 2.31 1.30 0.91 0.70 0.57 
0.4 2.86 1.67 1.18 0.91 0.74 
0.5 3.33 2.00 1.43 1.11 0.91 
0.75 4.29 2.73 2.00 1.58 1.30 
1 5.00 3.33 2.50 2.00 1.67 
1.5 6.00 4.29 3.33 2.73 2.31 
2 6.67 5.00 4.00 3.33 2.86 
2.5 7.14 5.56 4.55 3.85 3.33 
4 8.00 6.67 5.71 5.00 4.44 
6 8.57 7.50 6.67 6.00 5.45 
8 8.89 8.00 7.27 6.67 6.15 
10 9.09 8.33 7.69 7.14 6.67 
 
15. Tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação S P. 
Tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S P. Alguns dados 
cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que 
conclusões você pode tirar com relação a identidade das duas enzimas? 
 
 
 
[S] 
Velocidade Inicial Observada 
(µ-moles x mg de proteína-1 x min-1) 
 
[M] 
Extrato de Fígado 
Adulto (E1) 
Extrato de Fígado 
Embrionário (E2) 
1,67 x 10-5 1,05 5,00 
2,5 x 10-5 1,54 6,66 
3,33 x 10-5 1,98 8,00 
5,0 x 10-5 2,86 10,00 
7,0 x 10-5 3,78 11,67 
1,0 x 10-4 5,00 13,33 
1,5 x 10-4 6,67 15,0 
1,67 x 10-4 7,15 15,4 
2,0 x 10-4 8,00 16,0 
3,0 x 10-4 10,00 17,1 
 
 
 
16. Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E1 do Probl. 1) é liberada na 
corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa 
a mesma reação, é liberado na corrente sanguínea. E1 E3podem ser diferenciadas 
facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2 
x 10-5 M.) Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os 
resultados dados na tabela abaixo. O paciente sofre de uma doença do fígado, ou 
simplesmente tem se exercitado violentamente? (O paciente chegou inconsciente no 
hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta). 
 
 18 
 
 
[S] (M) v (moles x ml de soro-1 x min-1) 
5 x 10-5 43 
7 x 10-5 57 
1 x 10-4 75 
1,5 x 10-4 100 
2 x 10-4 120 
3 x 10-4 150 
6 x 10-4 200 
 
 
 
17. Os dados cinéticos abaixo foram obtidos para diferentes inibidores de uma enzima. 
Determine a natureza de cada inibidor e calcule o Ki. 
Velocidade Inicial (nmoles/min) 
[S] (mM) (Controle) +I a 6µM +X a 30µM +Y a 4mM +Z a 0,2mM 
0,200 16,67 6,25 5,56 10,00 8,89 
0,250 20,00 7,69 6,67 11,11 10,81 
0,333 24,98 10,00 8,33 12,50 13,78 
0,500 33,33 14,29 11,11 14,29 19,05 
1,00 50,00 25,00 16,67 16,67 30,77 
2,00 66,67 40,00 22,22 18,18 44,44 
2,50 71,40 45,45 23,81 18,52 48,78 
3,33 76,92 52,63 25,64 18,87 54,04 
4,00 80,00 57,14 26,67 19,00 57,14 
5,00 83,33 62,50 27,77 19,23 60,60 
 
 
 19 
Exercícios para o laboratório de informática 
 
1. Familiarizar-se com o programa de simulação da purificação de proteínas. 
 
2. Purificar as duas proteínas indicadas para o grupo e apresentar os resultados 
obtidos. 
 
3. Três proteínas, P1, P2 e P3, foram submetidas independentemente a hidrólise 
com tripsina e analisadas por MALDI-TOF. Conhecendo-se o m/z dos peptideos 
obtidos a partir de cada proteína (abaixo), identifique cada uma delas. 
 
P1: 
1086.555 
1271.656 
1378.833 
1502.662 
1606.651 
1853.952 
1885.009 
1937.005 
1982.042 
2110.130 
2191.131 
P2: 
979.473 
1018.485 
1180.651 
1424.768 
1581.810 
1709.902 
2112.902 
2198.207 
2253.143 
2443.250 
2584.143 
2852.445 
 
P3: 
768.398 
948.578 
1140.641 
1253.619 
1381.717 
1762.906 
1940.027 
2038.923 
2068.119 
2456.205 
 
 
	Departamento de Bioquímica
	Bioquímica EXPERIMENTAL
	7. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir.
	Figura 1 – SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação.
	Produto 1: Ala – Arg – Pro – Glu
	Produto 1: Ala – Phe – Ala – Gly – Phe – Ala – Arg
	Qual a estrutura primária deste oligopeptideo?