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Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioquímica Prática: TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS Alunos: Agatha Oliveira, Gabriella Barreto E Serena Gomes Turma: BIO-231 Professores: Marcio Loureiro e Ana Tessis Data da realização da prática: 10/03/2023 Data da entrega do relatório: 17/03/2023 Avaliação: Critério: Nota: Apresentação Introdução Objetivos Métodos Resultados Discussão Bibliografia Total: INTRODUÇÃO Os aminoácidos são biomoléculas monoméricas precursoras das proteínas, macromoléculas essenciais para a estruturação e funcionamento dos nossos componentes celulares e organismos. Existe uma grande diversidade na natureza dos aminoácidos, porém, são 20 os principais e fundamentais para nossas vias metabólicas. Sua presença nos organismos vivos está diretamente associada ao funcionamento e crescimento adequado envolvendo a formação de proteínas, enzimas, sinalizações celulares e produção de anticorpos, entre outras funções. Eles compartilham uma forma estrutural que apresenta quatro ligantes associados ao carbono central considerado um carbono quiral (α) completando suas ligações por elementos distintos, com um grupamento amino (-NH2) e carboxila (-COOH), além de uma cadeia carbônica lateral e um átomo de hidrogênio. Exceção do aminoácido glicina que possui um átomo de hidrogênio a mais ao invés da cadeia lateral. Figura1: Estrutura de aminoácidos; Fonte: eDisciplinas Os aminoácidos compõem as proteínas a partir de ligações peptídicas que os unem formando uma cadeia linear polipeptídica. Os encaixes são feitos entre a carboxila terminal da cadeia e a entrada do grupamento amino inicial, liberando uma molécula de água nessa reação. Esses grupamentos funcionais conferem características ácidas e básicas aos aminoácidos, devido a isso são considerados anfóteros podendo doar ou receber prótons em solução aquosa. Dentre eles podem ser classificados de acordo com o caráter hidrofílico/ hidrofóbico das suas cadeias laterais: chamados alifáticos por suas cadeias laterais não possuírem grupamentos funcionais e serem lineares ou pouco ramificadas; apolares aromáticos que, apesar de não apresentarem grupos funcionais, possuem a cadeia lateral com anéis aromáticos. Já os aminoácidos polares são subdivididos em: ácidos nos quais a cadeia lateral é carregada negativamente pela presença de um segundo grupamento carboxila adicional; básicos que possuem em sua cadeia lateral o segundo grupamento amino, trazendo a presença de uma carga adicional positiva; e neutros que têm as cadeias laterais com ambos grupamentos funcionais que se equilibram não deixando carga adicional disponível para o meio. Baseando-se na nossa capacidade de produção e necessidade nutricional dessas moléculas orgânicas, os aminoácidos essenciais são aqueles que não temos vias metabólicas capazes de produzi-los então torna-se necessário o suplemento alimentar para a formação das proteínas (EX: leucina); não-essenciais são aqueles aminoácidos que são produzidos na faixa necessária para o desenvolvimento corpóreo, logo não é necessário a suplementação ingestiva (EX: asparagina); e os aminoácidos condicionais temos o aparato fundamental para produzir mas não na quantidade suficiente, contando com a dieta alimentar além da produção interna (EX: glicina). Utilizando a técnica de titulação, no estudo da passagem de prótons de um aminoácido por meio de sua variação de pH com o pHmetro através da adição de uma base forte para reduzir a presença de íons H +. A passagem dos prótons geram um potencial de membrana em que o mesmo é captado pelo eletrodo do equipamento de medição, que por meio de um gráfico nos ajuda a analisar os níveis de ionização do AA. Sendo assim, a montagem de gráficos por meio de dados obtidos em experimento acerca dessas propriedades físico-químicas é chamada curva de titulação, permitindo assimilar melhor o comportamento do sistema e identificar o tipo de biomolécula estudada. Além disso, são denominadas zonas de tamponamento as áreas de maior resistência à variação de pH da solução, ajudando na compreensão das constantes de acidez que ditam o nível de acidez e basicidade das moléculas. Essas regiões determinam o AA como um ácido (pKa) ou básico (pKb) a partir dos patamares visualizados no gráfico elaborado, nos quais há maior resistência aos saltos de pH. Em situações específicas, o aminoácido analisado pode apresentar 3 estágios de dissociação em que a cadeia lateral é ionizável além do grupamento amino e carboxila. Outra faixa importante analisada é o ponto isoelétrico em que as cargas positivas e negativas dos aminoácidos se equilibram onde atuam respectivamente como ácido e base, marcado pela variação brusca do pH entre as zonas de inflexão. Com isso, torna-se possível chegar à análise eficiente das etapas de dissociação dessas biomoléculas sob um olhar quantitativo e qualitativo e, assim, como os aminoácidos possam se comportar diante das variações submetidas. Outra região importante analisada é o ponto isoelétrico em que as cargas positivas e negativas dos aminoácidos se equilibram, marcado pela variação brusca do pH entre as zonas de inflexão. Com isso, torna-se possível chegar à análise eficiente das etapas de dissociação dessas biomoléculas sob um olhar quantitativo e qualitativo. OBJETIVOS O objetivo da prática consiste em titular as curvas de três aminoácidos do laboratório usando o método de titulação potenciômétrica e assim construir um gráfico com os resultados obtidos e através destas informações conseguir identificar quais são os aminoácidos, assim como, suas zonas de tamponamento, seus respectivos PKs e os pontos isoeletricos. Além disso, outro objetivo da prática foi instruir o uso correto da micropipeta (P1000 e P200) para realizar a prática de maneira mais precisa, pois a medição precisa é de extrema importância para obter os resultados, dessa maneira complementando o outro objetivo da prática. METODOLOGIA I.MATERIAIS 1 becker de 20-100 mL 1 becker de 50 mL 1 barra magnética de agitação 1 agitador magnético 1 potenciômetro (phmetro) 1 micropipeta P1000 1 micropipeta P200 2 caixas de ponteiras (azul e amarela) 50 mL da solução de aminoácido 1, 2 ou 3 (10 mM) diluído em HCl 20mM 20 mL da solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,25 M II. METODOLOGIA Com os equipamentos e materiais posicionados na bancada iniciamos em grupo as seguintes etapas: • Lavagem com água destilada do eletrodo pois dentro do phmetro ele é mantido em uma solução específica e da barra magnética de agitação (peixinho) • Adição de 50mL do aminoácido no béquer de 100mL, com o auxílio de uma proveta para medição e funil para passar para o béquer • Adição de 20mL de NaOH no béquer de 50mL. Entretanto repetimos esse processo de medição em mL dos aminoácidos e lavagem com água destilada dos equipamentos, para realizar novas medidas de pH corretamente para cada aminoácido restante. Assim, com os equipamentos ligados à tomada, colocamos o béquer contendo o primeiro aminoácido na placa de agitação do phmetro, adicionamos dentro do béquer a barra magnética de agitação e o eletrodo já lavados com água destilada. Nesta primeira etapa, medimos o ph do aminoácido sem adição do NaOH, para seguir de um ponto inicial. Após a primeira medição sem NaOH, foram adicionados por etapas 0,4 e 0,2 microlitros com o auxílio das pipetas P1000 e P200 e suas respectivas ponteiras seguindo as medidas em microlitros já tabelados pelo roteiro de prática. Foi colocado cada aferição de pH à medida em que fosse adicionado a base NaOH, sendo ao total 40 medições em cada um dos três aminoácidos, totalizando 120 medições de pH. RESULTADO A tabela abaixo representa os valores de Ph nas três soluções de aminoácidos estabelecidos pela adição de NaOH de acordo com a quantidade referida.Vol. NaOH Solução 1 Solução 2 Solução 3 pH 1 pH 2 pH 3 0 1,88 2,19 2,05 0,5 1,93 2,31 2,15 1 2,01 2,46 2,29 1,5 2,10 2,66 2,47 2 2,15 2,78 2,59 2,5 2,20 2,91 2,76 3 2,27 3,06 2,99 3,5 2,34 3,22 3,50 4 2,41 3,38 7,28 4,5 2,50 3,54 8,30 5 2,60 3,70 8,67 5,5 2,71 3,87 8,92 6 2,86 4,06 9,13 6,5 3,05 4,29 9,33 7 3,33 4,60 9,53 7,5 4,04 5,23 9,75 8 8,03 7,20 10,02 8,5 8,92 8,94 10,37 9 9,26 9,26 10,80 9,5 9,48 9,53 11,16 10 9,67 9,72 11,40 10,5 9,83 9,89 11,56 11 9,97 10,03 11,68 11,5 10,12 10,14 11,78 12 10,27 10,27 11,86 12,5 10,43 10,39 11,93 13 10,59 10,51 11,99 13,5 10,78 10,56 12,04 14 10,98 10,79 12,08 14,5 11,18 10,94 12,12 15 11,35 11,09 12,16 15,5 11,50 11,24 12,20 16 11,62 11,37 12,23 16,5 11,71 11,48 12,26 17 11,79 11,58 12,28 17,5 11,86 11,67 12,31 18 11,92 11,74 12,33 18,5 11,97 11,80 12,35 19 12,01 11,86 12,37 19,5 12,09 11,95 12,41 20 12,15 12,03 12,45 Tabela 1 – pH em função do NaOH adicionado as 3 soluções de aminoácidos Com a obtenção dos valores das variações de pH da Tabela 1, foi possível confeccionar os gráficos (1 a 4) das titulações de cada aminoácido. Mas para uma análise comparativa eficiente o gráfico elaborado podemos ver os dados dos aminoácidos sobrepostos permitindo a comparação entre eles. Tabela2 Valores de pK Soluções pKa1 pKr pKb PI 1 1,88 3,33 9,97 2,60 2 2,19 9,26 5,72 3 2,05 9,13 12,33 10,73 Equação 1 – Calculo de PI OBS: Sendo pK1 o valor antes da espécie neutra e pK2 o valor depois da espécie neutra, conhecida como sua forma zwinteriônica . Tabela 3- Tabela com os valores de pK dos grupos funcionais de aminoácidos. DISCUSSÃO Ao terminar a titulação do aminoácido da solução 1, foi observado que se tratava de um aminoácido Hidrofílico carregado negativamente, ou seja, ácido, cujo na sua cadeia lateral possui um grupo carboxila, além do grupo carboxila já presente em seu arranjo estrutural. A desprotonação ocorre em três estágios, 1°desprotona grupo carboxila do arranjo estrutural, 2° desprotona grupo carboxila da cadeia lateral e em 3° desprotona o grupo amino. Por ter os três estágios de ionização, consequentemente apresenta 3 pK’s. O primeiro ponto de inflexão da curva, ou pKa teve o valor de 1,88 e o segundo ponto, neste caso pKr possuiu valor de 3,33 e o terceiro estágio corresponde o pKb de valor 9,97. O ponto isoelétrico (PI), que é o valor de pH onde o aminoácido apresenta carga igual a zero, sendo possível realizar o cálculo de pH neste ponto entre os valores de pKa e pKr, de acordo com a Equação 1, obteve o valor igual a 2,60. Após essa percepção, comparou-se a Tabela 2 com a Tabela 3 e analisou que o suposto aminoácido da solução 1 é um Ácido aspártico. Figura 2: Formas de ionização AA1; Fonte: Próprio autor De início o AA1 possuía uma carga +1, quando o primeiro grupo carboxila desprotona passou a ter carga neutra, com a desprotonação do segundo grupo carboxila passou a ter carga -1 e no final da desprotonação do grupo amino possuiu a carga -2. Após a realização da titulação do aminoácido da solução 2, observou-se que se refere a um aminoácido apolar ou hidrofóbico, ou seja, não solúvel em água, que possui a cadeia lateral normalmente linear e com poucas ramificações. A desprotonação ocorre em dois estágios, inicialmente assim como a de aminoácidos ácidos, o grupo carboxílico do arranjo estrutural desprotona e após ocorre a desprotonação do grupo amino. Consequentemente terá dois pK’s. Onde no caso avaliado o primeiro pka, ou pka1 obteve o valor de 2,19 e o pKb o valor de 9,26. Com esses dois valores foi possível encontrar o valor do ponto isoelétrico onde, PI foi igual a 5,72. No início possuía uma carga +1, quando o primeiro grupo carboxila desprotonou passou a ter carga neutra e com a desprotonação do grupo amino possuiu carga -1. Figura 3: Formas de ionização AA2; Fonte: Próprio autor Ao juntar todos os dados coletados iniciou-se a comparação dos valores obtidos com os valores da teoria da Tabela 3 e pode-se suspeitar que a solução 2 é um aminoácido Metionina. Com a conclusão da titulação do AA3, foi analisado que tratava de um aminoácido hidrofílico, que se dissolve em água, carregado positivamente, ou seja, alcalino ou básico, que possui em sua cadeia radical grupamento amino com carga positiva. Assim como um aminoácido ácido, o aminoácido base possui três valores de pK’s, ou seja, ocorre três desprotonações. A primeira é com o grupo carboxílico, a segunda é do o grupo amino do seu arranjo estrutural e a terceira é a do grupo amino da sua cadeia alifática. Obtivemos o valor de pKa igual a 2,05, pKr de 9,13 e pKb de 12,33. Realizando o cálculo do ponto isoelétrico com a formula da Equação 1 entre os valores de pKr e pKb, chegamos ao valor de PI que foi igual a 10,73. Analisando os valores dados de pKa, pKb, pkr e PI, foi possível realizar a comparação com a teoria e ver o que mais se assemelha, concluindo assim que supostamente essa solução poderia ser um aminoácido Arginina. Figura 4: Formas de ionização AA3; Fonte: próprio autor No início da desprotonação possuía uma carga +2, após ocorrer a primeira desprotonação com o grupo carboxila passou a ter carga neutra, com a segunda desprotonação do primeiro grupo amino passou a ter carga +1 e com a última desprotonação passou a ter carga -1. Dessa maneira, com os valores dos pHs adquiridos pelas três soluções de aminoácidos foi possível adquirir os objetivos de identificar a zonas de tamponamentos, identificar os pontos isoelétricos, achar os valores de pKs, identificar e titular os aminoácidos e suas cargas e avaliar como cada molécula se comporta ionicamente. BIBLIOGRAFIA NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6ª Edição. Porto Alegre: Artmed, 2014. 425p. Tabela aminoácidos, Passeidireto. Disponível em: https://www.passeidireto.com/arquivo/85382584/tabela-aminoacidos Acesso: 15 mar 2023. Conceitos básicos das proteínas, UFRGS/FAVET LACVET. Disponínel em: https://www.ufrgs.br/lacvet/ensino/aulas/conceitos-basicos-das-proteinas/ Acesso: 13 mar 2023. https://www.passeidireto.com/arquivo/85382584/tabela-aminoacidos https://www.ufrgs.br/lacvet/ensino/aulas/conceitos-basicos-das-proteinas/
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