AULA 4 HIIBRIDIZAÇÃO

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
Marli Matiko Anraku de Campos
*
Como identificar a expressão de um gene? 
	Hibridização DNA/RNA
*
Como identificar a expressão de um gene? 
	Hibridização DNA/RNA
*
Características das sondas de ácidos nucleicos
Transcrição em série
*
 
*
Proporção de bases em vários organismos
*
Possibilidades de pareamento das bases
*
Replicação acurada do DNA
Purina só se pareia com pirimidina
2 cadeias de polinucleotídeos são ligadas por pontes de Hidrogênio (2 ou 3)
Cadeias polinucleotídicas são antiparalelas
*
Fita simples
Fita Dupla
*
Temperatura de fusão (Tm)
Temperatura em que ½ das fitas estão no estado nativo e ½ denaturadas. Depende de:
*
Temperatura de fusão (Tm)
Temperatura em que ½ das fitas estão no estado nativo e ½ denaturadas. Depende de:
Conteúdo de GC
Comprimento da cadeia de DNA
Concentração de cátions
Imperfeições no pareamento
Efeito formamida e uréia (diminuição da Tm)
Efeito do pH
*
Efeito formamida e uréia
Formamida abaixa a Tm:
	Um aumento de 1% na concentração de formamida ocasiona um decréscimo de 0,63 ºC na Tm.
*
Conteúdo de CG
Há um aumento de 0,41 C na Tm por aumento de 1% de CG. 
A determinação da Tm leva ao conteúdo de CG de um DNA.
Tm = 69,5 + (0,41 X % CG)
*
Comprimento do DNA
Tamanho está relacionado com a estabilidade da molécula.
Uma seqüência de 100 nucleotídeos terá uma Tm 5 ºC menor que uma de 500 nucleotídeos
*
Concentração de cátions
Tm aumenta com o aumento na concentração salina.
Exemplo com Na+:
DNA com 40% de CG e 1000 pb:
NaCl 1,0 M Tm = 97.4 ºC
NaCl 0,18 M Tm = 85,0 ºC
NaCl 0,05 M Tm = 75,8 ºC
*
Efeito do pH
A Tm varia pouco entre pH 5,0 e 8,0.
Acima de pH 13 o DNA se denatura.
		Efeito útil para denaturar o DNA sem precisar aquecê-lo.
*
Denaturação e renaturação do DNA
Denaturação (ou “melting”): alta temperatura ou alto pH.
Renaturação: Formação de duplex em condições subdenaturante (Marmur e Doty, 1960)
*
• Sondas
– Oligonucleotídeos internos
– Produtos de PCR
– Anticorpos
• Tamanho / conteúdo da sonda
– TM
– Ligações inespecíficas
*
• Marcação da sonda
Sistema de detecção
	– Radioativa
		• 32P / 33P / 14C / 35S / 125I
	– Não-radioativa
• Digoxigenina
• Avidina / Biotina
• Quimioluminescência (ECL)
*
Como marcar a sonda com radioisótopos ?
Nick translation
Randon primer
*
Marcação das extremidades de oligonucleotídeos por quinase ou klenow
*
Ribossondas (sondas de RNA)
*
Hibridação
1 - DNA imobilizado em membranas
2 - RNA imobilizado em membranas
3 - Cromossomos fixados em lâminas
4 - Corte histológico
*
Hibridação em membrana um ácido nucléico é fixado a uma membrana e o outro ácido nucléico (sonda) é marcado e mantido em solução
- Southern Blot – hibridação de DNA
Southern EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503- 517.
*
- Northern Blot – hibridação de RNA
- Colony Blot – colônias de bactérias
- Dot Blot – amostras de DNA
- Slot Blot – amostras de DNA
- Microarray – amostras de DNA
*
• Tipos de membrana
– neutral nylon
– charged nylon
– nitrocelulose
*
• Suporte para hibridização
	–Fase sólida
• Transferência e fixação
–Membrana de nylon
–Membrana de nitrocelulose
–Membrana de PVDF (Polyvinyllideno difluoride)
–Fase líquida
– In situ
*
• Fase sólida – transferência
Vácuo, capilaridade, eletricidade
– Dot / Slot Blot
– Colony Blot
– Southern blot (DNA)
– Northern (RNA)
– Western Blot (Proteínas)
• Unidirecional
• Bidirecional
*
Detecção
• Autoradiografia
	– Radioisótopos
• Digoxigenina
• Avidina/Biotina
• Quimioluminescência (ECL)
*
• Obtenção de fitas simples/desenroladas
– Desnaturação: calor/álcali
– Transferência do material para a membrana
– Fixação do DNA/RNA (UV/calor)
• Pré-hibridização - Bloqueio de sítios inespecíficos
– BSA / gelatina / leite Molico® / DNA de esperma de salmão /
Solução de Denhardt + formamida ou tampão fosfato
*
• Desnaturação da sonda
	– calor
• Hibridização
– Concentração da sonda
– Temperatura de hibridização (Tm)
– Tampão utilizado – formamida / fosfato
• Lavagens de estringência
– Concentração salina – SDS / SSC
– Temperaturas de lavagens
• Revelação
*
• Concentração da sonda
	– Evitar desperdício e background
• Temperatura de hibridização
– Determina especificidade da hibridização
– Depende do conteúdo de CG da sonda e do tampão de
reação
– 5-25°C abaixo do Tm
– Determinada empiricamente
• Lavagens de estringência
	– Composição das soluções de lavagem (SDS / SSC)
	– Temperatura de lavagem
*
Southern blotting: 
			análise de DNA
Northern blotting: 
			análise de mRNA
Western blotting: 
			análise de proteina
*
Hibridização - Fase líquida
Captura híbrida
*
*
Hibridização - Fase sólida- Colony blot
*
Southern / Northern / Western
*
Southern Blotting ıE. M. Southern (1975)
Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose; Transferidos para membranas por ação capilar; DNA é desnaturado antes ou durante a transferência; Sonda radioativa de DNA hibridiza com o DNA na membrana; Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
Aplicação: Alterações
em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo.Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado.
*
Princípio do Southern Blot
*
Hibridização - Fase sólida - Southern / Northern blotting
*
Hibridização em Southern Blot
*
*
MW
La
Lb
Lc
H-1
H-2
H-3
H-4
NC
bp
587 -
458 –
298 -
236
*
*
Northern blotting: Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose; RNAs devem ser desnaturados (formaldeído); Sensibilidade a RNAses; Transferência para membrana por ação capilar; Sondas de RNA ou DNA para hibridar
Úteis em estudo de expressão gênica 
Estudo de diferentes tecidos 
Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo
*
Identificando seqüências alvo
*
Hibridização em Northern Blot:
Análise de expressão gênica
*
Western blotting
*
Hibridização de colônias
Sonda molecular
*
Mutação da anemia falciforme gera um RFLP doença específico
RFLP: Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição
*
Hibridização em dot blot
*
Hibridização in situ de tecidos
Sonda: ribossonda anti-senso da cadeia pesada da Beta-miosina marcada radioativamente. Tecido: camundongo
*
Micro ou Macroarranjos
*
Imperfeições no pareamento
Para cada 1% de bases não pareadas e que sejam distribuídas ao acaso na seqüência há uma diminuição da Tm em 0,72 ºC.
Isto implica na temperatura de lavagem das membranas de nylon em Southern Blot:
	Lavagens em Tm – 5 ºC elimina mais hibridações inespecíficas que em Tm – 25ºC
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*