Aula 2 - Enterobactérias (Gram Negativas)

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Bactérias	Gram	negativas
Identificação	laboratorial
Enterobacteriacea
Profa.	Patrícia	Miorin
Fonte:	Plustil,	Procediemntos Básicos	em	Microbiologia	Clínica,	2010.
Prova	da	oxidase
• Finalidade:	verificar	se	a	bactéria	é	produtora	da	enzima	oxidase.
• A	fita	contém	o	reativo:	N,N,N,N,-tetrametil-p-fenileno diamina	mono-hidrocloridrato.	
Validade	da	fita:	3	meses	quando	conservada	em	frasco	escuro	de	2-8oC.
• Inocular	com	uma	haste	de	madeira	ou	plástico,	espalhar	uma	colônia	suspeita	sobre	a	
fita	oxidase.	Intepretação:
• Cor	original	da	fita:	branca	ou	levemente	azulada
• Oxidase	+:	produção	de	cor	roxa	imediatamente	no	local	da	inoculação	da	fita.
• Oxidase	-:	não	há	mudança	na	cor do	papel	no	local	da	inoculação	da	bactéria.	
Não	considerar	alterações	tardias.
• Controle	de	qualidade:	P.	aeruginosa positivo	e	E.coli negativo.
newprov
• Responsáveis	pela	maioria	das	infecções	nosocomiais: Escherichia	coli;	
Klebsiella pneumoniae;	Klebsiella oxytoca;	Proteus mirabilis;	
Enterobacter spp;	Salmonella (sorotipos);	Serratia marcescens;	
Citrobacter spp;	Providencia	spp.
• Vias	respiratórias	inferiores:	Klebsiella,	Enterobacter,	Escherichia.	
• Corrente	sanguínea	(bacteremia/septicemia):	Escherichia,	klebsiella,	
Enterobacter.	
• Gastrointestinal	(diarréias/desinterias):	Salmonella,	Shigella,	Yersinia,	
Escherichia	coli.
• Trato	urinário:	Escherichia,	Proteus,	Providencia,	Klebsiella.
Grande	parte	das	infecções	urinárias	e	muitas	infecções	intestinais.
Enterobacteriacea
Enterobacteriacea
• Bacilos	Gram-negativos	retos.
• Imóveis	ou	móveis	com	flagelos	peritríquios.
• Não	formam	endosporos.	
• Alguns	membros	possuem		cápsula.	
proeminentes	(Klebsiella sp).
• Anaeróbios	facultativos.
• Fermentam	a	glicose (com	ou	sem	produção	
de	gás).
• Reduzem	o	nitrato	em	nitrito.
• Oxidases	negativas,	catalase positivas.
• Fermentam	a	lactose	ou	não.
Catalase
• Ação	tóxica	do	peróxido	de	hidrogênio	sobre	as	células,	produzido	
durante	a	respiração	aeróbica.	
• Peróxido	de	hidrogênio	a	3%
• Os	microrganismos	sintetizam	enzimas	capazes	de	neutralizar	esta	
ação	tóxica.
• A	catalase converte	2H2O2 →	H2O	+	O2↑
• Catalase +	:	formação	de	bolhas	de	ar	(reação	imediata:	colônia	
bacteriana	produtora	de	catalase)
• Catalase - :	ausência	de	bolhas	de	ar
• Fermentação	da	lactose	em	MacConkey (meio	seletivo	e	diferencial):	sais	biliares	
e	cristal	violeta.
• Resistência	aos	sais	biliares	dos	patógenos	entéricos	em	relação	aos	micro-
organismos	comensais	presentes	no	trato	gastrointestinais.
• Lactose	positiva:	E.	coli,	Enterobacter,	Klebsiella spp (podem	ser	Lactose	tardia).
• Não	fermentam	a	lactose:	Shigella e	Salmonella,	Proteus (colônias	incolores).
Enterobacteriacea
Metabolização	da	lactose
β –galactosídeo 
permease
Lactose Glicose
+
galactose
Ácido pirúvico
ácidos mistos
Ácido lático
Ácido fórmico
Ácido acético
PRODUÇÃO DE GÁS
Glicólise:	glicose	degradada	em	duas	moléculas	ácido	pirúvico
Klebsiella spp.
MacConkey
Eosin	Methylene	Blue	Agar	(EMB)
• corantes	eosina	Y e	azul-de-metileno:
• inibem	as	bactérias	Gram-positivas	
• indicadores	de	fermentação	da	lactose	por	micro-
organismos.	
•Os	coliformes	produzem	colónias	pretas-azuladas.
• Salmonella e	Shigella são	incolores	ou	têm	uma	
cor	âmbar	transparente.		
• Escherichia	coli apresenta	um	reflexo	verde	
metalizado característico,	devido	à	rápida	
fermentação	da	lactose.
E.coli EMB
Klebsiella pneunoniae EMB
Pseudomonas	spp.	EMB
Salmonella spp.
A: E. coli eozina azul de metileno (colônias verde metálico) B: E.Coli MacConckey
Fonte:http://www.bmbtrj.org/viewimage.asp?img=BiomedBiotechnolResJ_2018_2_4_281_247244_f1.jpg
Fatores	de	Virulência	
Fímbrias	(pili)	(adesina):	projeções	
sobre	a	superfície	dos	bacilos	(fixação	
às	células	do	hospedeiro).	
LPS	(parede	celular);	antígeno	H	
(flagelo)	e	antígeno	K (cápsula):	
são	os	três	principais	grupos	de	
antígenos	específicos	associados	à	
meningite,	gastroenterite	e	infecções	das	
vias	urinárias.	Antígenos	detectados	por	
aglutinação	com	anticorpos	específicos	
(classificação	sorológica).
Fatores	de	Virulência	
• Antígenos	K capsulares	(termolábel):
• Associado	ao	aumento	da	virulência.	
• Proteção	contra	fagocitose	mediada	por	anticorpos	(antígenos	capsulares	hidrofílicos,	
repelem	a	superfície	celular	hidrofóbica	dos	fagócitos).		
• Ex.	antígeno	capsular	da	Salmonella tiphi é	denominado	antíg.	Vi.	
Escherichia	coli	K1
• Lipopolissacarídeo (LPS)	termoestável	(endotoxina):	
• Manifestações	tóxicas	das	infecções.	
• Principal	antígeno	da	parede	celular.	Consiste	em:	
• Polissacarídeo	O	somático	(comum	em	todas	as	Enterobacteriaceae)	
• Lipideo A:	febre;	Leucopenia	seguida	por	leucocitose;	Coagulação	intravascular	
disseminada;	redução	da	circulação	periférica	e	perfusão	para	importantes	órgãos;	
choque,	morte.	
• Antígenos	H	(proteínas	flagelares	termolábeis):
• Presentes	nos	flagelos	bacterianos
• Aderência	das	cepas	nefrogênicas ao	uroepitélio antes	do	estabelecimento	da	infecção.
• Ex.	sorotipoespecífico de	cepas	patogênicas	como	E.	coli		O157:H7
Klebsiella sp.
�Possuem	cápsula	proeminente	
responsável	pelo	aspécto mucóide das	
colônias	isoladas	e	pela	virulência	
aumentada	dos	micro-organismos	in	
vivo.
�Membro	mais	comumente	isolado:	K.	
pneumoniae:	pode	causar	pneumonia	
lobar primária	adquirida	na	
comunidade.	
�Estas	bactérias	também	causam	
infecções	de	feridas,	dos	tecidos	moles	e	
das	vias	urinárias.
Proteus sp.	urease
• infecções	urinárias;	bacteremia;	pneumonia;	infecções	localizadas	e	infecção	
nosocomial.
• Infecções	das	vias	urinárias	por	P.	mirabilis
• As	cepas	produzem	grandes	quantidades	de	urease:
• uréia																			amônia		+	CO2→	↑pH	da	urina.
• ↑da	alcalinidade	da	urina:
• 	Facilita	a	formação	de	cálculos	renais
• Urina	alcalina	é	tóxico	para	o	epitélio	urinário.
Proteus spp.	ágar	Cledurease
Diagnóstico	laboratorial	Microbiológica
Enterobacteriacea
Amostra	
biológica
Cultura	
↓
Crescimento	
microbiano
Coloração	de	
Gram	
(baciloscopia)
Provas	
bioquímicas
Indol
Citrato
Lisina
Motilidade
Uréia
Glicose	
Sacarose		
Lactose	
Gás	de	glicose	
H2S	
Fenilalanina		
Ornitina
Bacilos	Gram	negativos
Provas	Bioquímica:	alça	microbiológica	em	agulha	
PRINCÍPIO
INDOL
24h +
Motilidade
24 h +
Lisina +
24h
CITRATO
72-96h -
TSI
24h 
Amarelo e gás
E.coli
Ureia	-
Fenilalania -
Indol:	24h/37OC:
• Produto	da	degradação	do	aminoácido	triptofano,	contido	no	meio	de	
cultura.	Bactérias	possuem	a	enzima	triptofanase:	cliva	o	triptofano
produzindo	indol.	
• Detecção	do	indol:	solução	contendo	p-dimetilaminobenzaldeído.	
• Reagente	de	Kovacs ou	Reativo	de	Ehrlich (mais	sensível	para	
detecção	de	bacilos	não	fermentadores	ou	anaeróbios	nos	quais	a	
produção	de	indol é	mínima).
• 1	a	2	gotas	do	reativo	de	Kovacs:	
• anel	violeta	:	indol positivo
• anel	permanece	amarelo:	indol negativo
Triptofanase
Triptofano ------------------------------→ piruvato
indol
amônia
24h/37oC
Violeta	
positivo
Amarelo	
negativo
• Utilização	do	citrato de	sódio	como	única	fonte	de	
carbono	para	o	seu	metabolismo	com	
alcalinização	do	meio	(verde para	azul).
• Primeiro	meio	da	séria	bioquímica	a	ser	semeado	
para	evitar	o	transporte	de	proteínas	ou	de	
carboidratos	dos	outros	meios.
• Semear	um	pequeno	inoculo	de	uma	colônia	na	
superfície	inclinada	do	meio.	
• Se	o	inoculo	for	demasiadamente	grande,	
compostos	orgânicos	pré-formados	dentro	da	
parede	celular	de	bactérias	que	estão	morrendo	
podem	liberar	carbono	e	nitrogênio	em	
quantidades	suficientes	para	dar	um	resultado	
falso-positivo.
Citrato de	Simmons (72-96h /37ºC):
�Glicose,	lactose	e	sacarose:	
• vermelho: alcalino (-)
• amarelo: ácido (+)
�Produção	de	gás	de	glicose	ou	não:	bolhas	de	ar	(CO2)
�Produção	de	sulfeto	de	hidrogênio	(H2S):		
� capacidade	de	liberar	enxofre	na	forma	de	H2S	a	partir	de	
aminoácidos	e	outros	compostos	que	contém	enxofre.	
Glicose	
sacrose
lactose
Gás	de	glicose
H2S
TSI	(triplo	- açúcar	- ferro):
sulfeto	de	
hidrogênio	
(H2S)
reage	com	saisde	ferro	
(sulfato	ferroso	e	citrato de	
ferro	e	amônia)	incorporados	
ao	meio
para	produzir	um	
precipitado	preto	
insolúvel:	
sulfeto	ferroso	
(FeS).
GÁS
TSI
24h 
Amarelo
E.coli
TSI estéril
A/A negativo H2S
Produção de gás 
(E. coli)
Sacarose
Glicose
Lactose
A/A H2S positivo
Produção de gás
Motilidade
meio	semi-sólido
+																						-
• Presença	de	flagelos.	Meio	semi-
sólido	(0,4%	de	ágar	ou	menos).	
• Exame	macroscópico	para	
visualização	de	crescimento	projetado	
a	partir	da	linha	de	inoculação.
• Negativo:	crescimento	na	picada.
• Positivo:	turvação	do	meio,	
crescimento	além	da	picada.
• Ágar	Indol	Sulfeto	Motilidade	(SIM)	
• meio	semissólido:	produção	de	
sulfeto,	formação	de	indol	e	
motilidade.
Caldo	lisina
• Cor	original	do	meio	roxo.
• Inocular	colônias	bacterianas	recentes	(crescimento	18	a	24h)	
e	colocar	vaselina.	Incubar	a	35-37oC	por	até	72h.
• Negativo:		
• fermentação	da	glicose	→	abaixa	pH	→		meio	muda	de	
roxo	para	amarelo		(indicador	de	pH	ácido).	
• Positivo:	a	atividade	da	enzima	lisina	descarboxilase	aumenta	
pH:
• Aminoácido	Lisina																																		amina	cadaverina	+	
CO2	→	alcaliniza	o	meio	→	neutralizando	o	ácido	
produzido	pela	glicose	→	meio	voltará	a	apresentar	
coloração	roxa	(indicador	de	pH	alcalino).
lisina	descarboxilada
Caldo	lisina	
Controle	de	esterilidade:	incubar	uma	amostra	do	lote	de	
Meio	de	cultura	por	24h	a	35-37oC.	Ausência	de	alteração
da	cor	do	meio,	liberar	lote	para	uso.
Controle	de	crescimento:	K.	pneumoniae ATCC	13883	(cor	amarela);	
Enterobacter cloacae ATCC	13047	(cor	roxo	intensa).
Lisina	+:	qualquer	cor	diferente	do	amarelo
Lisina	-:	amarelo	claro	e	brilhante
A
BC
- ++
Prova	da	Ornitina
• Presença	da	enzima	ornitina	descarboxilase.	
• Meio	de	coloração	roxa.
• Negativo:		
• fermentação	da	glicose	→	abaixa	pH			→		meio	muda	de	
roxo	para	amarelo		(indicador	de	pH	ácido).	
• Positivo:	a	atividade	da	enzima	ornitina	descarboxilase		
aumenta	pH:
• Aminoácido	Ornitina																																		amina	putrescina	+	
CO2	→	alcaliniza	o	meio	→	neutralizando	o	ácido	produzido	
pela	glicose	→	meio	voltará	a	apresentar	coloração	roxa	
(indicador	de	pH	alcalino).
Ornitina descarboxilada
Agar	MIO:	
motilidade	
(semi-sólido),	
Indol,	ornitina
Fenilalanina	
• Detecção	da	enzima:	Produção	de	ácido	fenilpirúvico a	partir	da	
fenilalanina	por	ação	enzimática	(fenilalanina	desaminase).
• Semear	a	colônia	na	superfície	do	meio
• Incubar	35-37oC/24h
• 4	gotas	cloreto	férrico	a	10%
• Positivo:	verde	na	superfície	do	meio
• Negativo:	meio	inalterado
Aminoácido		FENILALANINA																																																		ÁCIDO	FENILPIRÍVICO
fenilalanina	desaminase Pingas	
cloreto	
férrico	10%
Verde
+
Meio	
inalterado	
-
Provas	bioquímicas
• Urease:
• Presença	da	enzima	UREASE:	
hidrolisa	a	uréia liberando	
amônia.
• Positivo	pink:	mudança	de	
cor	do	indicador	de	pH	
devido	alcalinização	do	
meio	pela	produção	de	
amônia	(pH	acima	de	8.0).
• Negativo	amarelo:	
fermentação	da	glicose.
uréia
+																	-
Meio	Rugai
• Reação	positiva:	glicose	e	sacarose:	amarelo;	ureia:	
azul	intensa;	H2S: preto.
• LTD:	enzima	L	
triptofano desaminase: desaminação oxidativa do	
aminoácido	L-triptofano,	convertendo-o	em	ácido	
indol pirúvico,	o	qual	reage	com	sais	de	ferro	
originando	um	composto	de	cor	verde	escura.
• Produção	de	Indol:	enzima	triptofanase clivagem	do		
triptofano,	liberando	do	indol.	Reativo	de	kovacs.	
(LTD)
(triptofanase)
Papel	de	filtro	na	tampa
36oC/18-24h
Tampa	frouxa
EPM-MILI
• Testes	EPM:
• Produção	de	gás	por	fermentação	da	glicose
• Produção	de	H2S
• Hidrólise	da	uréia
• Desaminação do	triptofano
• Testes	MILi:
• Motilidade
• Produção	de	indol
• Descarboxilização da	lisina
• Acrescentar	citrato
• Semeadura
• Tocar	com	uma	alça	em	agulha	uma	colônia	bem	isolada	e	inocular	os	2	meios.
• EPM:	introduzir	a	agulha	até	o	fundo	do	tubo	e	ao	retirá-la	semear	a	superfície	do	meio.
• MILi:	deve	ser	feita	por	picada	central,	introduzindo	a	agulha	até	o	fundo	do	tubo.
• Incubar	os	tubos	com	as	tampas	semirosqueadas 37oC/	18-24h.
Conservar entre 10 a 30º C
EPM-MILi
�Meio	EPM:
¡ PRODUÇÃO	DE	GÁS:	aparecimento	de	bolhas	ou	deslocamento	do	meio	de	cultura	
para	cima.
¡ PRODUÇÃO	DE	H2S:	escurecimento	do	meio	em	qualquer	grau.
¡ HIDRÓLISE	DA	URÉIA:	aparecimento	de	cor	azul	ou	verde-azulada	(reação	fraca)	que	
se	estende	para	a	base	do	meio,	envolvendo-o	totalmente	ou	não.
¡ DESAMINAÇÃO	DO	TRIPTOFANO:	aparecimento	de	cor	verde-escuro	na	superfície	do	
meio;	quando	a	reação	é	negativa,	a	superfície	do	meio	adquire	coloração	azul	ou	
amarela	(rara)
• Meio	MILi:
• MOTILIDADE:	bactéria	móvel	cresce	além	da	picada,	turvando	parcialmente	ou	
totalmente	o	meio,	bactéria	imóvel	cresce	somente	na	linha	semeada.
• DESCARBOXILAÇÃO	DA	LISINA:	se	a	lisina	é	descarboxilada,	meio	adquire	coloração	
arroxeada;	quando	o	aa	não	é	utilizado,	meio	se	torna	amarelo	nos	seus	2/3	
inferiores.
• PRODUÇÃO	DE	INDOL:	após	a	leitura	dos	testes,	adicionar	3-4	gotas	do	reativo	de	
Kovacs à	superfície	do	meio	e	agitar	levemente.	Quando	a	bact.	Produz	indol
reativo	de	cor	rosa	ou	vermelha.	Quando	não	produz,	o	reativo	mantém	cor	
original.
Interatividades	e	caso	clínico
Exercícios.
• Explique	como	é	feito	a	prova	da	oxidase.	As	enterobactérias
possuem	essa	enzima?
• Quais	as	principais	características	das	enterobactérias?
• Explique	a	prova	da	catalase.
• Todas	as	Enterobactérias fermentam	a	glicose	e	a	lactose?	
• Qual	meio	de	cultura	podemos	observar	a	fermentação	da	lactose?
• Dê	dois	exemplos	de	Enterobactérias.
• Cite	e	explique	um	dos	fatores	de	virulência	das	enterobactérias.
• Para	a	identificação	laboratorial	das	enterobactérias utilizamos	as	
provas	bioquímicas.	Explique	o	princípio	e	a	leitura	de	cada	uma:	
Indol,	Citrato,	Lisina,	Motilidade,	Uréia,	fenilalanina	e	TSI.