Toxicologia: Intoxicação e Análises

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FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
TOXICOLOGIA E ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
Hélida Renata Tavares RA: 0614617 
 
 
Goiânia – Polo Bueno 
2023 
 2 
INTRODUÇÃO 
 
Intoxicação é um processo patológico causado por substâncias endógenas ou 
exógenas e caracterizado por desequilíbrio fisiológico, em consequência das 
alterações bioquímicas no organismo. Esse processo é evidenciado por sinais e 
sintomas ou mediante dados laboratoriais (OGA et al, 1996). 
As intoxicações são causas frequentes de procura de atendimento médico em 
serviços de urgência e emergência no Brasil, sendo muitos casos relacionados às 
tentativas de suicídio envolvendo crianças e idosos que se expuseram a doses acima 
da terapêutica, resultando em concentrações tóxicas na corrente sanguínea. No 
Brasil, as intoxicações envolvendo medicamentos alcançam o primeiro lugar como 
agente causal (AMARAL et al, 2008). 
O fato de os medicamentos serem apontados como a principal causa das 
intoxicações no Brasil nas últimas décadas aumenta o desafio dos laboratórios de 
análises toxicológicas, a desenvolverem metodologias analíticas para a pronta 
pesquisa e identificação de fármacos envolvidos nos casos de intoxicação aguda. 
Estas pesquisas requerem uma abordagem analítica ampla, rápida e segura em 
material biológico (LINI et al, 2014). 
A importância da escolha de um método de triagem é fundamental, pois define 
a gama de analitos que serão pesquisados e detectados. Portanto, deverá ter 
sensibilidade e abrangência de compostos para ser eficiente (MOREAU & SIQUEIRA, 
2008). 
A CCD é uma técnica simples, largamente utilizada quando se faz necessário 
a identificação ou confirmação de uma intoxicação aguda, ou ainda, no subsídio do 
tratamento ao paciente intoxicado (MOREAU & SIQUEIRA, 2008). Nessa técnica a 
separação das substâncias ocorre devido à diferença de polaridade que cada uma 
apresenta, ou seja, o composto que interage mais com a fase estacionária (sílica gel) 
percorre uma distância menor do que o composto que tem maior interação pela fase 
móvel ou sistema solvente (DEGANI et al, 1998). 
Apesar da existência de metodologias de análises modernas com a alta 
especificidade e elevada sensibilidade, grande parte dos laboratórios de toxicologia 
analítica ainda utilizam métodos clássicos, como a cromatografia em camada delgada 
(CCD) (LINDEN et al, 2007). 
 3 
Amostras para triagem de fármacos devem incluir sangue, urina e, se possível, 
conteúdo gástrico. Entre essas amostras a urina é a mais útil para a detecção 
qualitativa de substâncias químicas (MELLO, 1997). 
A exposição a agentes químicos no ambiente de trabalho tem sido responsável 
por números significativos de intoxicações. O monóxido de carbono é um dos agentes 
químicos mais perigosos para o homem. O grau de exposição ao CO é intensificado 
pelo tipo de atividade física exercida no local de trabalho e pela susceptibilidade 
individual. A quantidade do xenobiótico absorvida pelo organismo depende também 
das características físicas e químicas da substância, da intensidade e frequência da 
exposição e de hábitos pessoais, como o de fumar (MALHEIRO, 1991). 
A carboxihemoglobinemia pode ser determinada diretamente por métodos 
espectrofotométricos, ou indiretamente, pela quantificação do CO liberado da COHb 
(MALHEIROS, 1991). 
Os sais de nitrato e nitrito em excesso nos alimentos também prejudicam a 
saúde. A população não conhece os problemas que o consumo excessivo de alimento 
com nitrito pode causar, além de não ser possível avaliar se o produto contém mais 
nitrito que o determinado pela legislação apenas pelo aspecto visual do produto. Para 
isso é necessária análise laboratorial (CARTAXO, 2015). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
AULA 1 – Padronização de Fármacos por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) 
 
A técnica de CCD é considerada como método de escolha para triagem de 
substâncias desconhecidas devido a sua velocidade, confiabilidade, simplicidade, 
baixo custo e habilidade de gerar parâmetros como cor e fator de retenção (Rf), 
frequentemente expresso multiplicado por 100 (hRf), em um curto intervalo de tempo, 
sendo considerada uma técnica de triagem mais abrangente que os imunoensaios 
(LINDEN et al, 2007). 
Para a execução do procedimento utilizou-se placa cromatográfica e capilar 
para aplicação da amostra de Ácido salicílico na placa. A placa foi preparada fazendo-
se dois traços com grafite, sendo um a 2cm da borda inferior e o segundo a 10cm a 
partir do primeiro traço. Inseriu-se o capilar no padrão (Ácido salicílico), depois 
encostou-se com cuidado o capilar na placa cromatográfica para aplicar o padrão 
gerando uma mancha pequena de mais ou menos 5mm de diâmetro. 
Logo após, colocou-se a placa na cuba aguardando o desenvolvimento da 
placa até a marcação de 10cm. Concluído o desenvolvimento da placa até a 
marcação, retirou-se a placa da cuba e colocou-a na capela para executar a revelação 
com o cloreto férrico (FeCl3) para avaliação. O passo a passo do procedimento foi 
registrado no esquema a seguir. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
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O resultado obtido após a revelação da placa cromatográfica possibilitou 
observar uma mancha irregular de coloração violeta/roxo. Devido a irregularidade da 
mancha durante a padronização, para fins didáticos foi efetuado a marcação do centro 
superior da mancha para cálculo do Rf. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
Os resultados foram expressos a partir dos cálculos a seguir: 
 
Rf = distância percorrida pelo analito 
 distância percorrida pela fase móvel 
 
Rf = 3 / 10 = 0,3 
 
hRf = Rf x 100 
hRf = 0,3 x 100 = 30 
 
Foi disponibilizado pelo professor uma outra placa com padrão, cujo formato da 
mancha está adequado para o cálculo do Rf, como mostra a imagem a seguir. 
 
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Fonte: do autor, 2023. 
 
Os resultados da placa disponibilizada pelo professor foram expressos a partir 
dos cálculos demonstrados abaixo. 
 
Rf = distância percorrida pelo analito 
 distância percorrida pela fase móvel 
 
Rf = 2 / 10 = 0,2 
 
hRf = 0,2 x 100 = 20 
 
A reprodutibilidade dos valores de hRf são influenciados por diversos fatores, 
tais como: temperatura e umidade ambiental, tamanho da placa, grau de saturação 
da cuba cromatográfica, quantidade de amostra aplicada e efeito dos compostos 
coextraídos (efeito matriz). 
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) é uma técnica de triagem, 
portanto, precisa ser complementada para que seja confirmatório. Na mesma placa 
de CCD pode-se haver vários padrões desde que a aplicação desses padrões ou das 
amostras mantenham distância adequada para que não haja interferência no 
desenvolvimento do analito na placa cromatográfica. 
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AULA 2 – Triagem em Urina por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
 Extração Líquido/Líquido e Identificação de Fármacos por CCD 
 
A urina é a amostra ideal para triagem qualitativa e usualmente é disponível em 
grandes volumes. Via de regra contém concentrações maiores de fármacos ou drogas 
que o sangue. A presença de produtos de biotransformação na urina também pode 
ser utilizada para auxiliar a identificação, principalmente se forem utilizadas técnicas 
cromatográficas, capazes de separar o precursor de seu metabólito (MELLO, 1997). 
A amostra de urina deve ser coletada preferencialmente antes de qualquer 
medicamento ser administrado ao paciente (diuréticos, tranquilizantes), pois estes 
podem causar interferências nas análises. 
O objetivo do ensaio era a identificação por CCD do ácido salicílico na urina 
previamente contaminada, após a extração líquido/líquido realizando a comparação 
com o padrão conhecido de ácido salicílico. 
Para a execução do procedimento, primeiramente, separou-se 10mL de 
amostra da urina contaminada em béquer, verificou-se o pH da amostracom uma tira 
universal de pH, cujo resultado foi igual a 5,0, conforme a imagem a seguir. 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
Colocou-se em a amostra de urina (10mL) em funil de separação adicionando 
20mL da mistura de clorofórmio: éter (3:1), agitando vigorosamente o funil por 1 
 8 
minuto. Deixou-se o funil em repouso por 5 minutos para a separação da fase orgânica 
(clorofórmio: éter) e aquosa. 
Concluída a separação das fases, recolheu-se o extrato em béquer. Evaporou-
se o solvente à secura e reservou-se o resíduo. Descartou-se o remanescente aquoso 
que ficou no funil de separação. 
Após a volatilização dos solventes, procedeu-se com o preparo da placa 
cromatográfica com os resíduos extraídos da urina para a análise por CCD nas 
condições previamente padronizadas. Realizou-se a revelação da placa 
cromatográfica e foi possível observar uma mancha com comportamento 
cromatográfico similar ao padrão desenvolvido na AULA 1. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
Evidenciou-se uma mancha com coloração roxo/violeta e deslocamento similar 
ao padrão. Esses resultados sugerem a presença de salicilato na amostra, porém, não 
é possível confirmar em um ensaio de triagem por ensaio em CCD. 
 
AULA 3 – Identificação de Aflatoxina por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
 
 9 
Devido a limitação de alguns recursos para o desenvolvimento da pesquisa de 
aflatoxinas foi realizado a apresentação teórica do preparo da amostra, extração e 
purificação das aflatoxinas. Posteriormente, foi discutido sobre a interpretação dos 
resultados. As aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 podem ser visualizadas na placa 
cromatográfica a partir do deslocamento e fluorescência, sendo azul para as 
aflatoxinas B1 e B2, e verde para as aflatoxinas G1 e G2, conforme pode ser 
observado nas figuras 1 e 2 abaixo. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
 
A apresentação destas imagens tem finalidade didática para ilustrar um 
possível resultado para o procedimento. 
 
AULA 4 – Determinação da Carboxihemoglobinemia 
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O monóxido de carbono é um dos agentes químicos mais perigosos para o 
homem e para outros animais. Esta periculosidade está ligada diretamente às 
condições de exposição ao xenobiótico. A exposição no ambiente de trabalho tem sido 
responsável por numero significativo de intoxicações. 
A carboxihemoglobina é um indicador biológico que avalia a absorção, assim 
como reflete a intensidade do efeito nocivo do monóxido de carbono no organismo. 
As amostras de sangue, para determinação dos teores de COHb, devem ser 
colhidas no final da jornada de trabalho ou durante a exposição às altas 
concentrações. 
Para realizar a determinação de carboxihemoglobinemia em sangue 
previamente contaminado realizou-se o procedimento a seguir utilizando as seguintes 
soluções: 
 
• Solução Tampão – KH2PO4 (fosfato monobásico de potássio) 
• Solução hemolisante – diluição: 10mL da solução tampão + 90mL de água 
destilada 
• Solução diluente – 25mg de hidrossulfito de sódio dissolvida em 20mL de 
solução tampão 
 
Após o preparo das soluções, transferiu-se 0,1mL de sangue para um tubo de 
ensaio grande e adicionou-se 12mL da solução hemolisante agitando em agitador e 
aguardou em repouso por 10 minutos. 
Diluiu-se 200µL do hemolisado em 2,3mL da solução diluente e aguardou em 
repouso por 10 minutos. 
Após o repouso leu-se as absorbâncias à 420 e 432nm, utilizando-se a solução 
diluente como branco. 
Os resultados da leitura foram: 
 
• Absorbância à 420nm = 0,447 
• Absorbância à 432nm = 0,208 
 
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Fonte: do autor, 2023. 
 
Após a leitura realizou-se os cálculos para determinação da 
carboxihemoglobinemia, utilizando a seguinte fórmula: 
 
%COHb = 1 – (AR x F1) x 100 
 AR (F2 – F1) – F3 + 1 
 
Sendo que: 
 
AR = Abs 420 
 Abs 432 
AR = 0,447 
 0,208 
AR = 2,1490 
 
Os valores de F1, F2 e F3 foram fornecidos pelo professor, descritos na tabela 
abaixo: 
 
F1 1,3330 
F2 0,4787 
F3 1,9939 
 
Substituindo os valores obtidos na fórmula: 
 
 
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%COHb = 1 – (2,1490 x 1,3330) x 100 
 2,1490 (0,4787 – 1,3330) – 1,9939 + 1 
 
%COHb = - 1,8646 x 100 
 - 4,8300 
 
%COHb = 0,3860 x 100 
 
%COHb = 38% 
 
O Índice Biológico Permitido (IBMP) é de 3,5% e o Valor de Referência (VR) é 
< 1%, ambos para não fumantes. Portanto, o resultado de COHb encontrado na 
análise é superior ao VR e IBMP. Esse valor ultrapassa também o nível que indica 
toxicidade (≥ %COHb 20%) e sugere redução da oxigenação e/ou anoxia (ausência 
de oxigenação) podendo levar o indivíduo à óbito. 
 
AULA 5 – Determinação de Nitrito em Alimento 
 
É secular o emprego de sais de nitrito e nitrato em produtos embutidos de 
carne. Segundo alguns pesquisadores, a utilização desses sais tem por finalidade 
conferir cor e sabor aos produtos, além de funcionar como agente antimicrobiano e 
antioxidante. A aplicação desses sais acima do limite máximo estabelecido pela 
legislação vigente pode acarretar sérios riscos à saúde humana, pela possibilidade de 
manifestações de efeitos tóxicos agudos e crônicos. O nitrito em excesso pode agir 
sobre a hemoglobina e originar a metahemoglobinemia, impedindo que ela exeerca a 
função normal de transportar o oxigênio (MELO FILHO et al, 2004). 
Para determinação dos teores de nitrito como conservante em amostra de 
salsicha para verificar se estão dentro dos Limites Máximos Permitidos segundo a 
Legislação Brasileira preconizados pelo Ministério da Agricultura procedeu-se 
primeiramente com o processo de desproteinização preparando a amostra, pesando-
se em béquer de 250mL 10g da salsicha previamente triturada. 
 
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Fonte: do autor, 2023. 
 
Adicionou-se ao béquer 5mL de bórax e 40mL de água destilada previamente 
aquecida acima de 70ºC. Logo após, aqueceu-se a mistura em banho de água 
fervente por 15 minutos, agitando frequentemente. Depois de esfriar a temperatura 
ambiente, adicionou-se 2mL de ferrocianeto de potássio, agitando vigorosamente. 
Depois, adicionou-se 2mL de acetato de zinco e agitou-se novamente. 
Transferiu-se para balão volumétrico de 100mL, deixando em repouso por 30 
minutos a temperatura ambiente. Depois, completou-se o balão com água destilada 
q.s.p. 100mL, agitando-se vigorosamente para proceder com a filtragem em papel livre 
de nitritos. 
 
 
Fonte: do autor, 2023. 
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Simultaneamente, realizou-se a padronização, utilizando-se as seguintes 
soluções: 
 
• Solução I – Tetraborato de sódio decahidratado 
• Solução II – Ferrocianeto de potássio trihidratado 
• Solução III – Acetato de zinco dihidratado 
 
Solução (1) – Transferiu-se alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16mL da solução padrão 
de nitrito de sódio em 5 diferentes balões volumétricos de 100mL e adicionou-se 5mL 
do tampão e completou-se com água destilada, q.s.p. 100mL a cada um dos balões, 
conforme demonstrado na tabela abaixo. 
 
Padrão de nitrito Tampão Água destilada 
1mL 5mL q.s.p 100mL 
2mL 5mL q.s.p 100mL 
4mL 5mL q.s.p 100mL 
8mL 5mL q.s.p 100mL 
16mL 5mL q.s.p 100mL 
 
 Solução (2) – Transferiu-se 10mL de cada alíquota da solução preparada 
anteriormente para 5 diferentes balões volumétricos de 100mL e completou-se com 
água destilada, q.s.p. 100mL, a cada um dos balões, de acordo com a tabela abaixo. 
 
Solução (1) Água destilada 
10mL q.s.p 100mL 
10mL q.s.p 100mL 
10mL q.s.p 100mL 
10mL q.s.p 100mL 
10mL q.s.p 100mL 
 
 
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Solução (3) – Transferiu-se 5mL de cada uma das soluções (2) em tubos de 
vidro e acrescentou-se 10mL de reagente cromogênico, 5mL de água destilada e 5mL 
da solução tampão a cada um dos diferentes tubos, de acordo com a tabela a seguir. 
 
Solução (2) Reagente cromogênico Água destilada Tampão 
5mL 10mL 5mL 5mL 
5mL 10mL 5mL 5mL 
5mL 10mL 5mL 5mL 
5mL 10mL 5mL 5mL5mL 10mL 5mL 5mL 
 
Após o preparo da etapa final, deixou-se as soluções em banho de água a 30ºC 
por 30 minutos. Após esse tempo, realizou-se a leitura espectrofotométrica em 474nm, 
contra um branco. Os resultados das leituras foram expressos na tabela abaixo. 
 
Concentração (mg/mL) Absorbância 
0,0005mg/mL 0,059 
0,001mg/mL 0,091 
0,002mg/mL 0,176 
0,004mg/mL 0,321 
0,008mg/mL 0,682 
 
O gráfico abaixo demonstra a curva padrão obtida por meio das diluições de 
uma solução estoque de nitrito. 
 
 
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Após o preparo da curva padrão, pipetou-se 10mL da solução desproteinada 
da amostra de salsicha para um tubo de ensaio. Adicionou-se 5mL da solução tampão 
e 10mL da solução de alfa-naftol. Deixou-se em banho de água a 30ºC por 30 minutos. 
Após o resfriamento a temperatura ambiente, realizou-se a leitura espectrofotométrica 
em 474nm. A absorbância da amostra foi 0,156. 
Calculou-se o valor de nitrito presente na amostra, utilizando a curva padrão 
estabelecida no gráfico acima. 
 
y = 83,134x + 0,0081 
 
0,156 = 83,134x + 0,0081 
 
83,134x = 0,156 – 0,0081 
 
x = 0,1479 
 83,134 
 
x = 0,0017 mg de nitrito (0,17mg/kg) 
 
Segundo a Portaria nº. 1.004 de 11 de dezembro de 1998 da Secretaria de 
Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, a quantidade residual máxima de nitritos 
e nitratos em produtos cárneos, excetuando-se o charque brasileiro, é de 150mg/kg e 
300mh/kg, respectivamente, expressos como sal de sódio. Portanto, a quantidade de 
nitrito expressa na amostra analisada (0,17mg/kg), se encontra dentro da quantidade 
residual máxima de nitritos permitida pelo Ministério da Saúde. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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REFERÊNCIAS 
 
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Toxicologia, ed. Atheneu. São Paulo, 1996. p.3-7. 
 
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medicamentos. Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Editoria Atheneu, 2008. 
 
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delgada. Revista Brasileira de Farmácia. 2014. 
 
MOREAU, R. L. M; SIQUEIRA, M. E. P. B. Toxicologia Analítica. 1ª edição. Rio de 
Janeiro: Editora Guanabara Koogan S. A, 2008. 
 
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. 
Química Nova na Escola. 1998. 
 
LINDEN, R.; SARTORI, S.; KELLERMANN, E.; SOUTO, A. A. Identificação de 
substâncias em análise toxicológica sistemática utilizando um sistema informatizado 
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Nova, 30: 468-475, 2007. 
 
MELLO, Sueli Moreira de. Cromatografia em fase gasosa como técnica de triagem 
para diagnóstico laboratorial das intoxicações agudas por medicamentos 
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como técnica de triagem para diagnóstico laboratorial das intoxicações agudas 
por medicamentos que causam síndrome de depressores do sistema nervoso 
central. 1997. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo. 
 
MALHEIRO, Ana Cristina Calhabeutt Gabriel da Costa. Determinação 
espectrofotométrica da carboxihemoglobinemia em indivíduos expostos 
ocupacionalmente ao monóxido de carbono. 1991. Dissertação (Mestrado em 
Toxicologia e Análises Toxicológicas) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, 
 18 
Universidade de São Paulo, São Paulo, 1991. doi:10.11606/D.9.1991.tde-03032015-
160133. Acesso em: 2023-05-05 
 
CARTAXO, James Linneker da Silva. Riscos associados aos níveis de nitrito em 
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https://repositorio.ufpb.br/jspui/handle/123456789/936 Acesso em: 2023-05-05 
 
MELO FILHO, A. B.; BISCONTINI, T. M. B.; ANDRADE, S. A. C. Níveis de nitrito e 
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Sociedade Brasileira de Ciências e Tecnologia de Alimentos. São Paulo, 2004. 
Disponível em: https://doi.org/10.1590/S0101-20612004000300015 Acesso em: 2023-
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