Diluição seriada

Prévia do material em texto

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO DELTA DO PARNAÍBA (UFDPAR)
COORDENAÇÃO DO CURSO DE BACHARELADO EM BIOMEDICINA
LANA KARLA HOLANDA FREITAS
Relatório de Prática 
	
PARNAÍBA / PIAUÍ
2023
LANA KARLA HOLANDA FREITAS
PRÁTICA 2: CÁLCULOS APLICADOS AO LABORATÓRIO
	
Relatório de práticas IV em Biomedicina como parte dos requisitos para a obtenção de nota e aprovação na disciplina. 
PARNAÍBA / PIAUÍ 
2023
1. INTRODUÇÃO 
	Uma solução é uma mistura homogênea de duas ou mais substâncias. As soluções podem ser de gases, líquidos e sólidos. Cada uma das substâncias em uma solução é chamada de componente da solução. A substância presente em maior quantidade é normalmente chamada de solvente, enquanto o componente que há em menor quantidade é chamado de soluto. Elas são utilizadas rotineiramente no laboratório e são frequentemente compradas ou preparadas na forma concentrada, sendo chamadas de soluções estoque. (BROWN et al., 2005)
	A solução de baixa concentração pode ser obtida com adição de água, reagente e/ou solução salina. Esse processo é chamado de diluição. Vale ressaltar que, quando o solvente é adicionado à solução, a quantidade de matéria do soluto permanece inalterada. Na diluição seriada, ocorre a amplificação do fator de diluição de uma diluição simples, que é o número total de volumes em que a amostra será dissolvida, sendo utilizada a diluição anterior como fonte para a diluição seguinte. O fator de diluição é o mesmo para toda a série. Por exemplo, se a diluição for 1/2, o fator de diluição é 2. Então, todas as diluições seguintes serão multiplicadas por 2 (1/2 x 2 = 1/4 x 2 = 1/8 x 2 = 1/16…)
	Vários métodos laboratoriais indicam o uso de uma série de diluições, em alguns exames com resultados positivos, como por exemplo VDRL, ASO LÁTEX, PCR e Fator Reumatoide (aglutinação em látex), a diluição seriada é utilizada para ver em qual diluição da série houve o último sinal de reatividade.
2. OBJETIVO
	O propósito da prática foi entender a importância do processo de diluição simples e seriada no Laboratório de Imunologia médica, além de realizar o processo de diluição seriada e determinar o fator de diluição.
3. DESENVOLVIMENTO
Para a prática de diluição seriada fez-se uso dos seguintes materiais:
· Micropipetador P 10 à P100;
· Micropipetador P 20 à P200;
· Micropipetador P1000;
· Ponteiras Amarelas;
· Ponteiras Azuis;
· Solução Colorida Amarela;
· Solução diluente;
· Tubos de Ensaio.
Antes de iniciar a diluição propriamente dita, foi preciso calcular os valores necessários de amostra e diluente, a fim de prevenir erros e confusões na hora da técnica. Para isso, foi de suma importância ter conhecimento dos seguintes cálculos:
· Volume final da solução: 
· Volume final = diluente + alíquota
· Volume necessário da alíquota: 
· Volume final X Fator da diluição
· Volume necessário de diluente: 
· Volume total - Volume da alíquota
· Fator da diluição:
· Volume final / Volume da alíquota
Para um volume final estabelecido em 400 μL e fazendo os cálculos, obtivemos os seguintes resultados:
· Volume final da solução: 400 μL
· Volume necessário da alíquota: 
· 400 μL x 1/2 = 200 μL
· 400 μL x 1/4 = 100 μL
· 400 μL x 1/8 = 50 μL
· 400 μL x 1/16 = 25 μL
· Quantidade de diluente: 
· 400 μL – 200 μL = 200 μL
· 400 μL - 100 μL= 300 μL
· 400 μL - 50 μL = 350 μL
· 400 μL - 25 μL = 375 μL
· Fator de diluição: 
· 400 μL / 200 μL = 2
Feitos os cálculos, a diluição seriada foi iniciada com 1/2 para 4 pontos a partir da amostra pura (solução salina). Então, tivemos 4 tubos de ensaio identificados da seguinte forma: 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Em seguida, foi iniciada a pipetagem, sempre começando do maior para o menor volume. 
Foram preparados 5 tubos de ensaio com 200 μL do de diluente em cada um. A amostra não diluída (solução colorida amarela) foi adicionada ao primeiro tubo na proporção de 1/2, com 200 μL de amostra mais 200 μL de diluente (que já estavam no tubo) e, em seguida, diluída em série nos tubos seguintes. 
Ao final da diluição, foi realizado o cálculo da proporção da diluição final da diluição seriada. A proporção total da diluição pode ser encontrada multiplicando-se o fator de diluição de cada etapa até a etapa final. Assim, Dt = D1 x D2 x D3 x … x Dn, onde Dt é o fator de diluição total e Dn é a proporção da diluição. Exemplificando, a diluição realizada pelo grupo foi de “1:2” do líquido 4 vezes. Ou seja, substituindo o fator de diluição à equação: Dt = 2 x 2 x 2 x 2 x 2 = 32. O fator de diluição final do quinto tubo na diluição em série é “1:16”. Logo, a concentração da substância foi de 16 mil vezes menor que a solução não diluída original.
Além disso, é possível determinar a concentração da solução após a diluição. Para isso, faz-se uso da seguinte equação química: Cfinal = Cinicial / D onde Cfinal é a concentração final da solução diluída, Cinicial é a concentração inicial da solução original e D é a proporção previamente determinada da diluição. 
Em testes rápidos há a presença do termo Cutt off (CO) ou limiar de reatividade de um teste. Ele determina o valor limite acima do qual deve-se considerar aquele resultado como reagente. Esse CO pode variar de acordo com a técnica empregada, o antígeno utilizado nessa técnica e também de acordo com a doença pesquisada, por isso, deve sempre vir descrito no kit a ser utilizado.
Um exemplo de diluição seriada amplamente utilizado em laboratórios é o teste de VDRL, que é um teste não-treponêmico, que utiliza como antígeno a cardiolipina, não específico para os antígenos do Treponema pallidum, mas que se apresenta elevado em pacientes com sífilis. Este teste consiste em uma reação de floculação, apresentando alta sensibilidade e baixa especificidade, pois a sensibilidade varia de acordo com a fase da sífilis. Além disso, ele é semiquantitativo e as titulações são obtidas através de diluições seriadas do soro, sendo o título final a última diluição que apresentar reatividade no teste. 
Outro teste bastante utilizado é o de “ELISA” (Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay). Ele baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações enzimáticas. A enzima mais utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. Existem vários modelos de testes de ELISA, porém, a sua forma mais simples é chamada ELISA indireto. Nela um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado e, em seguida coloca-se sobre este os soros em teste (ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.
Já o exame ASLO, também chamado de ASO, AEO ou da antiestreptolisina O, tem como objetivo identificar a presença de uma toxina liberada pela bactéria Streptococcus pyogenes, a estreptolisina O, que está normalmente associada a casos de faringite ou febre reumática e glomerulonefrite, nos casos mais graves. Nele é feita uma prova quantitativa a partir de uma série de diluições do soro entre 1:2 e 1:128 (podendo ir além deste título), numerando 7 tubos (1:2, 1:4, 1:8,1:16, 1:32, 1:64 e 1:128), acrescentando a seguir 0,5 mL de tampão glicina pH 8,2 em cada um deles, e 0,5 mL da amostra no primeiro tubo, homogeneizando e transferindo 0,5 mL desta diluição para o próximo tubo, e assim por diante, desprezando a última alíquota.
4. CONCLUSÃO
	Ao fim da prática realizada foi possível compreender a importância do processo de diluição simples e seriada no Laboratório, bem como realizar o processo de diluição seriada e determinar o fator de diluição. Vale salientar que essas técnicas são de suma importância na rotina laboratoriais, pois vários testes indicam o seu uso, como VDRL, ELISA e ASO LÁTEX e a soluções são frequentemente compradasou preparadas na forma concentrada. 
5. REFERÊNCIAS
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai SHIV. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015
BROWN, LEMAY & BURSTEN, Química A Ciência Central - 9.ed. Pearson Prentice Hall ed. 2005
CÂMARA, Bruno. Biomedicina Padrão – Como fazer e calcular diluições. Disponível em: <https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/09/como-fazer-e-calcular-diluicoes.html> Acesso em: 17 de fevereiro de 2023.
MARIZ, Flávia Viana. Procedimento teste de VDRL. POP UAD.049. Universidade Federal de Campina Grande – Hospital Universitário Júlio Bandeira de Mello. Disponível em: <https://www.gov.br/ebserh/ptbr/hospitaisuniversitarios/regiaonordeste/hujbufcg/acesso-a-informacao/gestao-documental/gerencia-de-atencao-a-saude/pop-049-pop-do-teste-do-vdrl-1.pdf> Acesso em: 17 de fevereiro de 2023. 
UEMURA, Elisa Hizuru. ASO LÁTEX POP LABORCLIN. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda. Disponível em: < https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/Aso_latex_551018_551020_551021.pdf> Acesso em: 17 de fevereiro de 2023.