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Antonia Tayane Vieira de Melo Gabriela Costa Veras Lydia Letícia Oliveira de Paulo Marcely Braga de Albuquerque Controle de Qualidade: Análise de Leite Universidade Estadual do Ceará - UECE Faculdade de Medicina Veterinária - FAVET Higiene, Insp. Tec. Prod. Origem Animal II Prof José Maria dos Santos Filho 1 INTRODUÇÃO1. 2 INTRODUÇÃO O Controle de Qualidade do leite refere-se às medidas e procedimentos realizados para garantir a segurança e conformidade do leite de acordo com os padrões estabelecidos pela legislação, visando garantir um produto qualificado para o consumo humano. 3 REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES2. 4 REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES ESTABELECIMENTOS RBQL ❖ INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 77/2018 - MAPA: LEITE CRU 5 REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES ANÁLISES PELOS ESTABELECIMENTOS I - temperatura; II - teste do Álcool/Alizarol III - acidez titulável; IV - índice crioscópico; V - densidade relativa VI - teor de gordura; VII - teor de sólidos totais e teor de sólidos não gordurosos; VIII - pesquisas de neutralizantes de acidez; IX- pesquisas de reconstituintes de densidade ou do índice crioscópico; e X - pesquisas de substâncias conservadoras. ANÁLISES PELO RBQL I - teor de gordura; II - teor de proteína total; III - teor de lactose anidra; IV - teor de sólidos não gordurosos; V - teor de sólidos totais; VI - contagem de células somáticas; VII - contagem padrão em placas; VIII - resíduos de produtos de uso veterinário; e IX - outros que venham a ser determinados em norma complementar. Instrução Normativa nº 77/2018 - MAPA 6 REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES ❖ ESTABELECIMENTOS/LATICÍNIOS: COLETA DAS AMOSTRAS Amostras na Propriedade Rural Amostras na Plataforma de Recepção 7 REALIZAÇÃO DAS ANÁLISES ❖ REDE BRASILEIRA DE QUALIDADE DO LEITE (RBQL) ❖ Conj. Laboratórios distribuídos em áreas geográficas de abrangência estratégica ❖ PNQL: Programa Nacional de Melhoria e Qualidade do Leite ❖ Amostras de leite cru refrigerado enviadas ao RBQL 1x mês Instrução Normativa nº 77/2018 - MAPA 8 TESTES PARA ANÁLISE DO LEITE3. 9 TESTE DO ÁLCOOL/ALIZAROL ❖ 1ª análise após ordenha ❖ Teste Qualitativo: Indicador de Acidez e Estabilidade térmica ❖ Realização: Propriedade Rural e Plataforma de Recepção ❖ Álcool/Alizarol 72% ➢ Alizarina + Álcool Etílico 72% ❖ Reação colorimétrica Instrução Normativa nº 77/2018 - MAPA 10 TESTE DO ÁLCOOL/ALIZAROL ❖ MÉTODO 2 ML LEITE + 2 ML ALIZAROL RESULTADO 11 TESTE DO ÁLCOOL/ALIZAROL ❖ RESULTADO Instrução Normativa nº 77/2018 - MAPA I. Coloração amarela ou marrom claro, ambas com grumos: leite com acidez elevada e não estável ao álcool 72% II. Coloração lilás a violeta: leite com reação alcalina sugerindo a presença de mastite ou de neutralizantes. III. Coloração vermelha tijolo sem grumos ou com poucos grumos muito finos: leite com acidez normal e estabilidade ao álcool 72% 12 TESTE DO ÁLCOOL/ALIZAROL ❖ RESULTADO ❖ Cor = pH (ESTIMATIVA!) ❖ pH normal; ácido; alcalino ❖ Importância: ➢ Deterioração do leite ➢ Tratamento Térmico: coagulação da caseínas ❖ Confirmar com a titulação da acidez! 13 ACIDEZ TITULÁVEL ❖ TITULAÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO (PADRÃO) ➢ Quantitativo ➢ Gramas de Ácido Lático / 100 ml de leite ➢ Solução alcalina (NaOH) + Leite com indicador de pH e água pura ➢ Quanto de NaOH é necessário para modificar o pH do leite de 6,6 a 8,3 14 ACIDEZ TITULÁVEL ❖ MÉTODO 15 A N Á L IS E PA D R Ã O 20 ml + 40 ml (H2O) + 2 ml fenolftaleína 1% 20 ml + (40 ml H2O + 0,1 ml Fucsina) Instrução Normativa nº 77/2018 - MAPA ACIDEZ TITULÁVEL ❖ RESULTADO 16 ACIDEZ TITULÁVEL ❖ RESULTADO 17 Gramas de Ácido Lático / 100 ml de leite 0,14 a 0,18 g/100ml Instrução Normativa nº 76/2018 - MAPA Composição do leite O processamento do leite tem duas finalidades: produção de leite para consumo (leite pasteurizado ou leite UHT) e a produção de derivados. COMPOSIÇÃO DO LEITE 18 Teor de gordura ➔ O teor médio no leite cru é em torno de 3,9%, enquanto que a IN 62 estabelece teor mínimo de 3% AVALIAÇÃO TEOR DE GORDURA Diversos fatores influenciam no teor de gordura do leite como raça do animal, período de lactação, alimentação, entre outros A gordura pode ser determinada por métodos: Butirométrico ou Gerber,Rose-Gottlieb (métodos clássicos) e métodos instrumentais Os métodos clássicos são utilizados por apresentarem custo relativamente baixo e simplicidade 19 Método butirométrico ➔ Ataque seletivo da matéria orgânica pelo ácido sulfúrico ➔ A gordura será separada por centrifugação, auxiliada pelo álcool amílico, que modifica a tensão superficial. butirômetro de Gerber é feita a adição de um volume conhecido de amostra e dos reagentes e ao final do procedimento a leitura do teor de gordura é feita na escala do butirômetro. AVALIAÇÃO TEOR DE GORDURA 20 Método de Rose-Gottlie ➔ Uso de hidróxido de amônio para solubilizar a caseína ➔ Neutralizar a acidez e reduzir a viscosidade ➔ Uso de álcool etílico para quebrar a emulsão gordura-caseína e na mistura éter etílico/éter de petróleo para extrair a gordura A gordura assim extraída é determinada gravimetricamente (pesagem do extrato) e o teor de gordura é calculado em relação à massa inicial de amostra de leite utilizada AVALIAÇÃO TEOR DE GORDURA 21 EXTRATO SECO TOTAL E DESENGORDURADO O extrato seco total (EST) ou sólidos totais é o somatório da concentração de todos os componentes do leite exceto a água. O extrato seco desengordurado (ESD) é a diferença entre o EST e o teor de gordura. Em média, o EST no leite encontra-se entre 12% e 13% enquanto que, de acordo com a IN 62, o ESD deve ser de, no mínimo 8,4% 22 Método analíticos que podem ser usados para a determinação do EST: ➔ Método gravimétrico, ou retirada de água do leite ➔ EST é determinado pelo cálculo da diferença entre a massa de uma amostra de leite e a massa da amostra dessecada, convertido para porcentagem Fórmula de Fleishmann ➔ Leva em consideração os resultados de densidade (D) e de teor de gordura (G) EXTRATO SECO TOTAL E DESENGORDURADO 23 Método de Ackermann: São utilizados os valores da densidade e teor de gordura. Procedimento: 1. É utilizado um instrumento que consiste de dois discos concêntricos que possuem escalas com valores de densidade e gordura e uma escala externa com os valores de EST Leitura: 2. Faz-se coincidir os valores de (D) e (G) girando o disco e uma seta aponta para o valor de EST. A posição da flecha indicará no círculo o extrato seco total em % EXTRATO SECO TOTAL E DESENGORDURADO 24 Densidade: Relação entre a massa e o volume Diretamente relacionado a composição química do leite 12-13% de matéria sólida e 87 a 88% de água De acordo com a legislação, o leite fresco e de boa qualidade deve apresentar densidade relativa entre 1,028 g/mL e 1,034 g/mL, na temperatura de 15 °C DENSIDADE RELATIVA Influenciada pela concentração 25 Aumento no teor de proteína, lactose e sais minerais Aumento da densidade Aumento no teor de gordura com adição de água Diminuição da densidade A medida da densidade por si só é insuficiente para avaliar a composição Resultados de densidade fora do intervalo = possível adulteração com a adição de água DENSIDADE RELATIVA 26 A densidade é um parâmetro físico-químico influenciado pela temperatura A medida que a temperatura aumenta A densidade do leite diminui a temperatura em que o leite se encontra deve ser observada De acordo com a IN 62, o resultado é corrigido e expresso na temperatura de 15 °C. DENSIDADE RELATIVA 27 DENSIDADE RELATIVA A densidade é medida usando uma vidraria chamada termolactodensímetro DENSIDADE RELATIVA Como fazer? ➔ O leite é transferido para uma proveta de vidro de 250 mL ➔ o termolactodensímetro é inserido no leite ➔ A leitura da densidade é feita no nível do leite emrelação à escala graduada do termolactodensímetro ➔ É feita a leitura da temperatura para que seja feita a correção para a densidade a 15 °C É usado uma tabela preconizada na Instrução Normativa Nº 68 28 DENSIDADE RELATIVA é uma propriedade físico-química que define a temperatura de congelamento das substância É usada para identificar a adulteração pela adição de água A temperatura de congelamento do leite (índice crioscópico) é relativa O índice crioscópico do leite é inferior ao da água pura, que é 0 °C O leite de composição normal, não adulterado, possui índice crioscópico entre -0,512 °C e -0,531 °C concentração dos componentes que formam o extrato seco a adição de água faz com que o índice crioscópico se aproxime da temperatura de congelamento da água pura ÍNDICE CRIOSCÓPICO 29 DENSIDADE RELATIVA Atualmente, a determinação do índice crioscópico pode ser feita com equipamento eletrônico digital, chamado crioscópio Rápido resfriamento de uma amostra de 2,5 mL de leite até – 3,0 °C Imediata cristalização desta amostra, induzida por vibração mecânica Como fazer? Expressos na escala graus Horvet (°H) que é diferente da escala Celsius (°C) De acordo com a IN 62, o índice crioscópico pode ser expresso em °H ou em °C, sendo que o intervalo -0,512 °C e -0,531 °C corresponde a -0,530 °H e -0,550 °H ÍNDICE CRIOSCÓPICO 30 DENSIDADE RELATIVA A contagem bacteriana total do leite cru (CBT) é o teste empregado para avaliação da qualidade microbiológica do leite Os resultados fornecem: ➔ Indicação de cuidados com a higiene e manuseio ➔ Falha na limpeza de equipamentos ➔ Problemas de refrigeração do leite O resultado é dado em ufc/ml (unidades formadoras de colônias por mililitro de leite) CONTAGEM DE BACTÉRIAS 31 DENSIDADE RELATIVA Tabela 1: Principais grupos de bactéria que contamina o leite OBS: Apesar de a CBT ser um método padronizado e que permite obter resultados confiáveis, não permite identificar os diferentes grupos de microrganismos presentes na amostra. CONTAGEM DE BACTÉRIAS 32 DENSIDADE RELATIVA Como fazer? ➔ As amostras de leite são colocadas em placas de vidro (placas de Petri) e misturadas com o meio de cultura em estado líquido. ➔ À medida que o meio de cultura resfria, ele solidificará ➔ As bactérias presentes se multiplicam, sendo visualizadas como colônias, que são contadas Em diversos países existem limites legais para a contagem total de microrganismos do leite e são fornecidos incentivos aos produtores para redução dos limites estabelecidos. Os valores máximos aceitos para o leite cru pela União Européia e nos EUA são < 100.000 ufc/mL. Para o leite pasteurizado nos EUA, o limite legal é de 20.000 ufc/mL. CONTAGEM DE BACTÉRIAS 33 - O teste de redutase é um método utilizado para avaliar a qualidade microbiológica do leite. - É um método colorimétrico, onde o tempo de redução é inversamente proporcional ao número de bactérias presentes na amostra de leite no início da incubação, sendo que, quanto mais bactérias estiverem presentes na amostra, mais rapidamente se dará a redução da substância indicadora, tornando-se incolor. - O resultado é expresso em horas e não pelo número de bactérias. (HILLERTON, 2000). 34 TESTE DE REDUTASE - 10 mL de leite + 1 mL de Azul de Metileno ou Resazruina em um tubo de ensaio. - Homogeneizar. - Banho-maria ou estufa a 37°C. Observar em quanto tempo ocorre a atividade redutora das bactérias presentes no leite a partir da observação da coloração. Tubo com azul de metileno. Fonte: SANTOS et al., 2020. Amostras após homogeneização. Fonte: SANTOS et al., 2020 35 TESTE DE REDUTASE Para interpretar ainda mais, podemos ter seis níveis de qualidade: 1. A qualidade do leite é excelente se houver redução de cor azul em 8 horas. 2. A qualidade do leite é boa, se temos a descoloração em 6,5 - 7,5 horas. 3. A qualidade do leite é razoável, se temos a descoloração em 2,5 - 6 horas. 4. A qualidade do leite é regular se temos descoloração entre de 1,5 e 2 horas . 5. A qualidade do leite é péssima se temos descoloração em menos de 1,5 horas. 6. Se o leite não descolorir em 8 horas existe algum inibidor bacteriano no leite (ex: antibiótico). 36 TESTE DE REDUTASE - A contagem de células somáticas é um método de análise da qualidade do leite. - As principais formas de contaminação são: glândula mamária infectada e má higienização de úberes, tetos, pele e ordenhador. - A contagem de células somáticas pode ser realizada isoladamente, avaliando-se o leite após a adição de um reagente próprio, ou diretamente, contando-se as células através do microscópio ou por meio de equipamentos eletrônicos (Richter et al., 2013). 37 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS - California Mastitis Test (CMT): 2 mL de leite + 2 mL de reagente. California Mastitis Test (CMT). Fonte: BERNARDES, 2023. - Método instrumental baseado na citometria de fluxo, onde é utilizado um reagente com a capacidade de se ligar nas células somáticas, possibilitando que se realize a quantificação por meio de fluorescência molecular. Pela análise de um volume conhecido de amostra de leite, o software do equipamento calcula a concentração de células somáticas por mL de amostra. Equipamento Combiscope FTIR 400 (Delta Instruments) utilizado para determinação de CCS e componentes do leite cru. Fonte: DIAS, 2014 38 CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS Com auxílio de uma pipeta, colocar em tubo de ensaio: ● 10 mL de leite Centrifugar por 5 minutos a 1.200 - 1.500 rpm. Resultados ● Positivo: Coloração rósea ou vermelha intensa, com grumos ou filamentos corados. ● Negativo: Sem coloração vermelha e sem formação de grupos ou filamentos corados. (TRONCO 2008) 39 PESQUISA DE SANGUE O leite pode conter resíduos de substâncias administradas aos animais ou usadas no meio ambiente da fazenda, incluindo antibióticos, desinfetantes e pesticidas. Antibióticos Efeitos adversos Resistência Interferência no processamento do leite 40 DETECÇÃO DE RESÍDUOS KIT SNAP TEST (IDEXX) - Tetraciclinas É utilizado para detectar rapidamente resíduos de tetraciclinas, oxitetraciclinas e clortetraciclinas no leite. Resultado Positivo Amostra de cor igual ou mais escura que o padrão. Resultado Negativo Amostra de cor mais clara que o padrão. Kit SNAP Test para tetraciclinas. Fonte: MORAIS, 2003. 41 DETECÇÃO DE RESÍDUOS KIT DELVOTEST SP - Betalactâmicos O princípio do teste é a inibição do crescimento microbiano. Deve ser incubado em 64°C de 2-3 horas. Resultado Positivo A cor não é alterada Resultado Negativo A cor muda para amarelo Kit Delvotest SP para betalactâmicos. Fonte: MORAIS, 2003. 42 DETECÇÃO DE RESÍDUOS Aumentar o volume do produto, para obter mais lucro. Diminui o valor nutritivo do leite e serve de veículo carreador de microorganismos psicrotróficos (Veisseyre (1998)). Aumenta o ponto crioscópico do leite. - TESTE 43 ADIÇÃO DE ÁGUA ● Amido 10ml de leite aquecido -> resfriar em banho de gelo + 5 gotas de solução saturada de iodo solução ficar azul, teste positivo 44 SUBS. RECONSTITUINTES DE DENSIDADE ● Sacarose 5ml de leite + 2ml de ácido sulfúrico a 50%: aquecer em banho maria 50-60ºC 5min +3 a 5 gotas de resorcina a 1% teste positivo se aparecer uma cor róseo-avermelhada 45 SUBS. RECONSTITUINTES DE DENSIDADE ● Soro do Leite: método para detecção é caro. Cromatografia e eletroforese. Quantificar caseína macropeptídeo (CMP), esta é a fração mais solúvel das caseínas, liberada durante a coagulação enzimática e que permanece no soro. Somente quando o índice de CMP for até 30mg/L, o leite poderá ser destinado ao abastecimento direto. 46 SUBS. RECONSTITUINTES DE DENSIDADE ● Soro do Leite: 47 SUBS. RECONSTITUINTES DE DENSIDADE ● Uréia: objetivo de aumentar o teor de proteína detectado nos testes laboratoriais. Método: reflectométricocom tiras de teste e reagente 0.2 - 7.0 mg/l NH₄⁺ Reflectoquant®. Mede íons de amônia e amônio dissolvidos. Tiras de teste rápido e de alta sensibilidade para detecção de neutralizantes, peróxido de hidrogênio e adulteração de ureia. 48 SUBS. RECONSTITUINTES DE DENSIDADE Substâncias químicas ou outros agentes que freiam a multiplicação de microorganismos. De acordo com o RIISPOA, se for detectada alguma dessas substâncias, esse leite só poderá ser usado para produção de sabão ou caseína industrial. (Portaria número 0005/83) ● Ácido bórico e seus sais ● Ácido salicílico e seus sais ● Água oxigenada ● Dicromato de potássio ● Formol ● Cloro Ácido salicílico Água oxigenada Ácido Bórico Dicromato de Potássio 49 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Ácido bórico (H3B03) e boratos: substância antisséptica e adstringente, que age como desinfetante em situações de infecções por bactérias ou fungos. 5ml de leite + 3 gotas de vermelho de fenol + NaOH 0,1mol/L -> cór rósea +1 ml de glicerina 1. Desaparecimento da cor rósea: teste positivo 2. Cor rosa persiste: leite não adulterado. 50 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Ácido salicílico: diminuição do crescimento de microorganismos 100ml de leite + 5ml de HCl -> filtrar para funil de separação +50 ml de éter etílico: agitar formação de duas camadas: a) camada aquosa; b)camada etérea Camada etérea: evaporar o éter espontaneamente + banho maria 1 gota de tricloreto de ferro a 0,5% cor violeta roxo, teste positivo 51 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Água oxigenada: prevenir a proliferação de microorganismos 5ml de leite + 3 gotas de lugol a 40% teste positivo se a solução ficar amarelada 52 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Cloro e hipoclorito: usado em resíduos sanitizantes dos equipamentos de ordenha 5ml de leite + 0,5ml de iodeto de potássio a 7,5% teste positivo se a solução ficar amarelada 53 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Formol: ação antimicrobiana Reativo de Nessler: iodeto de potássio + cloreto de mercúrio + hidróxido de potássio 3ml de leite + 2ml reativo de Nessler formação de um anel roxo-violeta anel na cor cinza, teste positivo 54 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Formol: ação antimicrobiana Floroglucina 10ml de leite + 1ml de floroglucina 1% + 2ml de NaOH a 10% solução vermelho-salmão, teste positivo 55 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Formol: ação antimicrobiana 5ml de leite + 2ml de ácido sulfúrico a 50% + 1ml de percloreto de ferro a 2% aquecer solução até ebulição solução de cor roxa ou violeta, teste positivo solução na cor amarela, teste negativo 56 SUBS. CONSERVADORAS OU INIBIDORAS ● Cal virgem ● Bicarbonato de Sódio Aumento da acidez do leiteBactérias lácticas fermentam lactose Produção de Ácido Láctico 57 SUBS. REDUTORAS DE ACIDEZ ● Cal virgem CaO (cal virgem) + 2C3H6O3 (ácido lático) → Ca(C3H5O3)2 (lactato de cálcio) + H2O 10ml de leite + 10ml de álcool absoluto - agitar e filtrar +3 gotas de ácido rosálico a 5% solução vermelho-carmim, para teste positivo 58 SUBS. REDUTORAS DE ACIDEZ ● Bicarbonato de Sódio NaHCO₃ + C₃H₆O₃ → C₃H₅O₃Na (lactato de sódio)+ H₂O + CO₂ 2ml de leite + 2 a 3 gotas de solução de alizarina a 2,0% solução mudar para cor violeta, teste positivo solução mudar para cor róseo-tijolo, teste negativo 59 SUBS. REDUTORAS DE ACIDEZ 60 61 100l leite + 10l água + 1l uréia 62 100l leite + 10l água + 1l uréia 63 CONCLUSÃO 64 A compreensão dos processos de controle de qualidade do leite e a familiaridade com análises físico-químicas e microbiológicas são igualmente relevantes na inspeção de produtos de origem animal. O médico veterinário desempenha um papel fundamental na inspeção do leite, garantindo a conformidade com os padrões sanitários e regulamentações específicas. Além disso, o profissional pode avaliar a qualidade e a segurança dos produtos lácteos, bem como identificar e prevenir potenciais problemas de contaminação ou adulteração, oferecendo um leite seguro e de qualidade, ao proteger a saúde pública e promover a confiança dos consumidores. 65 Obrigada! 66 Referências BERNARDES, Aline. Mastite bovina: Saiba o que é mastite clÍnica e subclínica, como identificar e tratar! Disponível em: https://blog.prodap.com.br/mastite-clinica-o-que-e-causas-como-tratar-e-principais-indicadores/. Acesso em: 15 jun. 2023. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa 62 de 29 de dezembro de 2011.Dispõe sobre regulamentos técnicos de produção, identidade, qualidade, coleta e transporte do leite. Diário Oficial da União, Brasília, Seção 1, 30 dez. 2011. DIAS, Juliana Alves; ANTES, Fabiane Goldschmidt. Qualidade físico-química, higiênico-sanitária e composicional do leite cru Indicadores e aplicações práticas da Instrução Normativa 62. Rondônia: Embrapa, 2014. DÜRR, J. W. Produção de leite conforme Instrução Normativa n° 62. 4. ed. Brasília: Senar, 2012. 44 p. HILLERTON, E. Contagem Bacteriana no Leite: Importância para a Indústria e Medidas de Controle. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE A QUALIDADE DO LEITE, 2, Curitiba-PR, 2000. MORAIS, Christina Maria Queiroz de Jesus. Viabilidade do uso de métodos rápidos para detecção de resíduos de antibióticos em leite em um Programa Nacional de Monitoramento. Disponível em: https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/handle/icict/14076/Morais_Cap-8.pdf;jsessionid=EE7CF505B636FD99E7540173EF7A609F?sequence=2. Acesso em: 15 jun. 2023. Richter, EM, T. Melo, M. Ruoso, N. Zeolla e V. Groenwold. 2013. Ações de manejo e sanitárias no controle de CCS em rebanhos leiteiros agroecológicos. 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