Introducao a Imunologia II

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Imunologi� II - Introduçã�
Imunidade inata: barreira cutânea ÍNTEGRA. A pele
produz antibióticos locais, as defensinas e catelicidinas
que ajudam a combater o microorganismos, junto
com linfócitos intraepiteliais.
Imunologi� Clínic�
→ Diagnóstico/ tratamento de doenças. Testes de
Gravidez, Pesquisa de anticorpos (Hepatite B, HIV),
Anticorpos importantes em doenças autoimunes
(FR)...
Sempre teremos um teste de triagem + confirmatório!
Amostras: maioria soro do sangue, tubo
vermelho/amarelo, centrifugados, que não possui os
fatores de coagulação.
OBS: o plasma (sangue com anticoagulante) contém
fibrinogênio, principal causa para não ser utilizado
nestas análises. O fibrinogênio pode interferir em
reações imunológicas de aglutinação, gerando
falsos-positivos.
Soro homólogo:
Soro coletado de seres-humanos e utilizado em
seres-humanos. Tomando uma vez, estamos
protegidos para sempre (temmemória).
Soro heterólogo:
Soro coletado de animais e utilizado em
seres-humanos. Tem que utilizar cada vez que
precisar, pois veio do animal e nosso corpo não
reconhece (ex: soro com anticorpos contra o veneno
da cobra).
Aglutinação: teste em que os anticorpos são
colocados no sangue e então se ligam aos sítios dos
patógenos, formando um aglutinado e mudando de
conformação. O IgM é muito utilizado pois é o maior,
possuindo 10 sítios de ligação e 5 cadeias.
Epítopo: parte do antígeno que é reconhecida pelas
regiões variáveis dos Fab. A especificidade é quando o
epítopo encaixa perfeitamente no sítio de ligação.
Afinidade: força de interação entre a CDR do
anticorpo e o epítopo do antígeno. Quanto mais
específicos, maior a afinidade e maior tempo ficaram
ligados.
Valência: Nº de antígenos que podem ser
reconhecidos ao mesmo tempo.
Avidez: Força total de ligação de cada CDR com seu
epítopo correspondente, emmúltiplos locais.
→ São diretamente proporcionais, quanto maior a
valência maior a avidez!
Reação cruzada:
Quando o anticorpo com menos complementaridade
se liga a um antígeno, por meio de ligações fracas com
regiões semelhantes. Antígenos diferentes podem
possuir epítopos parecidos. Exemplos:
1. Diabetes tipo I: antígenos do vírus rubéola
desencadeiam autoimunidade contra ilhotas
pancreáticas. Reação cruzada entre anticorpos contra
o vírus da Rubéola + células do pâncreas: ATAQUE!
2. Leite de vaca: produção de anticorpos auto reativos
contra o pâncreas (albumina bovina: semelhança de
aa com proteínas das células β-pancreáticas).
3. Reações cruzadas entre vírus da mesma família
(Flavivírus). Infecção precoce por Zika: os anticorpos
IgM reconhecem antígenos de Dengue.
Anticorpos policlonais: reconhece antígenos variados,
não fornece especificidade! Muita possibilidade de
ocorrer reações cruzadas.
Anticorpos monoclonais (mAb): muito específicos de
alta afinidade! Todos os anticorpos são idênticos, o
que fornece uma padronização no laboratório,
produção ilimitada e especificidade. Servem para:
Imunodiagnóstico: podemos retirar esses
antígenos/anticorpos de: sangue, urina, tecidos… e
utilizar para detectar hormônios, marcadores
tumorais, proteínas séricas, ELISA, radioimunoensaio,
testes rápidos..
Terapias: cânceres epiteliais, antiangiogênese, artrite
reumatóide, leucemias de células B, COVID-19.
Preparo de soluções e titulação:
→ Resultados expressos em forma de título.
Titulação: maior diluição que apresenta reação positiva!
VDRL, ALSO, PCR, FR→ Quanto maior o título do Ac,
maior a quantidade no organismo!
Acurácia / Exatidão: Capacidade do teste em entregar
resultados corretos. Necessário equipamentos
calibrados e reprodutibilidade (refazer o teste para
confirmação).
Testes podem dar:
● Verdadeiro positivo (VP)
● Verdadeiro negativo (VN)
● Falso positivo (FP)
● Falso negativo (FN)
→ O que se espera é que sempre se tenha os
“verdadeiros”, positivos e negativos.
Sensibilidade:% de indivíduos doentes com teste
positivo.
ex: 90%= 90 doentes e positivos + 10 doentes e negativos
(falso-negativos).
Especificidade: probabilidade de VN é confundida
com FP.
ex: 90%= 90 saudáveis e negativos + 10 saudáveis e
positivos (falso-positivos).
OBS: testes de triagem tem que ser sensíveis,
enquanto os confirmatórios tem que ser muito
específicos!!
OBS2: o IGM é o anticorpo que mais gera reações
cruzadas, pois tem menor afinidade por seus
epítopos!!
Teste� d� Aglutinaçã�
→ Ligação do anticorpo altera o estado físico do
antígeno e forma redes de complexos visíveis,
chamados de grumos ou flocos.
→ Anticorpos devem ter no mínimo 2 sítios de ligação
(bivalentes) e antígenos devem ser bivalentes (ter 2+
epítopos para o anticorpo se ligar). Por isso o IGM é
mais utilizado, por ser maior e possuir mais sítios de
ligação, mas também é o motivo dele causar maior nº
de reações cruzadas.
Teste Reagente: formação de agregados, o paciente
tem anticorpos contra o agente pesquisado, então há
presença do antígeno!!
Teste não reagente: não ocorre formação de
agregados!
Podem ser:
Qualitativos: + ou -
Quantitativos: titulação seriada, fornece quantidade.
→ O médico utiliza o título para acompanhar a
evolução clínica do paciente. Se o tratamento for bem
sucedido, o título diminui! O “título” do paciente é a
última titulação que testou positivo. ex:
1:2 (+)
1:4 (+)
1:8 (+)
1:16 (+)→ é o título do paciente
1:32 (-)
Diluições: varia a quantidade de anticorpos conforme
é diluída a amostra. Quanto maior a diluição, maior a
quantidade de anticorpos na amostra testada.
*Efeito pró-zona: ↑ anticorpos ↓ antígenos
Efeito pós-zona: ↓ anticorpos ↑ antígenos
Zona de equivalência: anticorpos = antígenos
→ TODAS as amostras devem passar por titulação
antes do teste!!
VDRL: muito comum acontecer o efeito pró-zona
(excesso de anticorpos causa um falso negativo), por
isso deve ser feita titulação até o 1:8, no mínimo! Se
deu negativo no 1:8, é negativo. Se der positivo,
continuar fazendo até dar negativo.
Diluição x Titulação
Diluir: antígenos (amostras prontas)
Titular: feita com o soro (anticorpos) do paciente
Aglutinaçã� Diret�:
Ligação direta entre anticorpo total e antígeno. São
utilizadas bactérias e fungos (ex: Mycoplasma,
Brucella). O kit pode vir com os epítopos da bactéria
que se ligarão aos anticorpos, ou vir com os anticorpos
específicos para aquela bactéria que irão se ligar ao
antígeno do paciente (menos utilizado).
Teste de Widal para Salmonelose: diluição seriada. A
aglutinação vai diminuindo até chegar no 5.
*pc: controle positivo
*nc: controle negativo
→ Hemaglutinação direta: hemáceas são utilizadas
como antígeno! Serve para fazer tipagem sanguínea.
● Reagente: hemácias ficam homogêneas.
● Não reagente: formam “botão”.
OBS: é possível que o resultado seja falso, em caso de
RH “fraco”. Quando a hemácia possui o antígeno do
RH (positiva) porém em uma quantidade muito baixa,
não conseguimos identificar a aglutinação e parece
um RH negativo.
Aglutinaçã� Indiret�:
Anticorpos do paciente se ligam a um antígeno que
está ligado a uma partícula/aglutinina (“suportes”), que
reforçam a ligação. Podem ser hemácias, polímeros,
látex, etc. Os aglutinados parecem com grumos,
flocos, o que os torna mensuráveis!!
Proteína C Reativa: aumenta em inflamações ou
infecções, é muito inespecífica! São utilizadas
partículas de látex com anticorpos anti-PCR + o soro
do paciente em uma placa de fundo escuro.
● Aglutinou: positivo
● Não aglutinou: negativo
OBS: lipemia no soro pode dar em um falso positivo!!
ASLO: são utilizadas partículas de látex revestidas com
estreptolisina O + o soro paciente em uma placa de
fundo escuro.
● Aglutinou: positivo
● Não aglutinou: negativo
Fator Reumatóide: IgM ataca IgGs próprios =
Auto-anticorpos! É um indicativo para doença
autoimune e atividade inflamatória. São utilizadas
partículas de látex revestidas com anticorpos IgG na
superfície + o soro paciente em uma placa de fundo
escuro.
● Aglutinou: positivo
● Não aglutinou: negativo
→ Hemaglutinação indireta: Hemácia é associada a
um antígeno, o anticorpo se liga ao antígeno que está
na superfície da hemácia.
Floculaçã�:
Aglutinaçãoem flocos. Os anticorpos do paciente se
ligam às micelas do reagente, formando “flocos”.
VDRL: triagem para sífilis (Treponema pallidum),
identifica anticorpos não-treponêmicos. Deve ser feita
uma diluição mínima, pelo menos até 1:8 para ter
certeza e evitar o efeito pró-zona. A bactéria, ao
romper a célula rompe também sua M.P que libera
várias substâncias que haviam na sua bicamada
lipídica:
● Colesterol
● Lecitina
● Cardiolipina
Os anticorpos do paciente se ligam às micelas
(reagentes) que contém em sua superfície células
destas substâncias. Utiliza-se a placa de Kline. Exame
muito sensível porém não tão específico, necessita de
confirmação.
Treponêmicos: anticorpos que se ligam direto na
bactéria/ microorganismo.
Não-treponêmicos: anticorpos que se ligam a
substâncias que são liberadas a partir da ação da
bactéria.
Inibiçã� d� aglutinaçã�:
Anticorpos do paciente e anticorpos do reagente
(comprado) competem para se ligar ao antígeno
(comprado). O resultado se dá pela NÃO aglutinação.
Antigamente era muito utilizado para realizar exame
de BHCG.
● Aglutinou: negativo
● Não aglutinou: positivo
→ Um soro anti HCG é colocado junto com a
urina/soro, caso a paciente seja positiva, seus
antígenos de HCG se ligarão aos anticorpos do soro,
então quando acrescentarmos as partículas revestidas
de HCG, como já houve uma ligação prévia, não
formará aglutinação.
→ Já em uma paciente negativa, os anticorpos do soro
colocado na amostra não terão nada para se ligar,
então quando for acrescentado a partícula revestida,
eles se ligarão e formarão aglutinação.
Teste� d� Precipitaçã�
Quantificação de precipitados produzidos pela relação
entre antígeno e anticorpo.
Ac solúvel + Ag solúvel
=
Imunoprecipitado!!
→ O antígeno sofrerá precipitação apenas se tiver
vários locais de ligação de anticorpos. Reação pode ser
afetada pelo n° de sítios de ligação que cada anticorpo
possui para seu antígeno.
Curva de precipitação: quantidade de precipitado
formado quando se adiciona um antígeno a uma
constante de anticorpos. A quantidade depende de
fatores físico-químicos e das concentrações de Ag e
Ac.
● Precipitação máxima: quantidade de Ag e Ac
são equivalentes (região de equivalência).
● Precipitação decresce: quando há excesso ou de
Ag ou de Ac.
→ Reação de precipitação deve ocorrer em um meio
que permita a ligação Ag/Ac → pH, força iônica,
presença de detergentes, etc.
Imunodifusão: fenômeno de deslocamento de
moléculas de um soluto em um meio pela diferença
de concentração: as moléculas vão do meio de maior
concentração do soluto, para o meio de menor
concentração. Moléculas livres (solúveis)
movimentando-se ao acaso, a difusão para no
momento que se formam imunocomplexos de alto
peso molecular, que ficam imobilizados no gel!
Vantagens Desvantagens
Fácil execução
Não necessita de
aparato sofisticado
Boa especificidade
Várias amostras ao
mesmo tempo
Rápido, simples, barato
Problemas com
reprodutibilidade
Tempo de incubação
grande
Difícil preservação do
gel
Teste� d� Imunodifusã�:
→ Podem ser em:
Meio sólido:
● Imunodifusão Radial Simples
● Imunodifusão Radial Dupla
● Imunoeletroforese
Meio líquido:
● Turbidimetria
● Nefelometria
Simples:
Acs ou Ags estão fixados no gel, enquanto o outro
migra para formar o imunoprecipitado.
Dupla:
Ambos Acs e Ags estão livres para se moverem em
direção um ao outro e precipitar, formando o
imunoprecipitado.
Imunodifusão Radial Simples:
Apenas o Ag ou o Ac vai se movimentar, enquanto o
outro fica imobilizado. O halo é diretamente
proporcional à concentração de Ag! 2 métodos:
Mancini: mede o diâmetro do halo após término da
difusão.
Fahey: halos de precipitação podem ser medidos
antes do término da difusão.
Ag/Ac padrão, diluído em série: curva padrão.
Equações que descrevem as curvas podem ser
utilizadas para determinar concentração de qualquer
Ag com qualquer diâmetro.
.
Princípio: Ag no poço + Ac no gel (ou vice-versa),
difusão do Ag no gel, com a formação de
imunocomplexos que precipitam e formam um halo
ao redor do orifício.
Utilizado para determinação de concentrações séricas
de imunoglobulinas, proteínas do complemento (C3,
C4), PCR, etc.
→ Pesquisa de Imunoglobulinas: utilizada para
diagnósticos de infecção intra uterina como rubéola
(pesquisa de IgM no feto/recém-nascido).,
diagnósticos de câncer, alergias e imunodeficiências.
Imunodifusão Radial Dupla:
Precipitação ocorre na região de equivalência, entre os
orifícios. Antígenos e anticorpos difundidos no ágar.
No lugar de halos, temos linhas de precipitação.
→ Velocidade da difusão de cada substância depende
da concentração e tamanho da molécula, tamanho
dos poros do gel, temperatura, concentração do ágar,
pureza, etc.
→ Permite comparar vários sistemas antigênicos e
colocá-los em orifícios adjacentes contra um mesmo
sistema de anticorpos.
→ Semiquantitativo, de baixa sensibilidade, requer
muitos antígenos. Soros policlonais de alta avidez.
Imunoeletroforese:
O pH do gel é escolhido de forma que partículas
negativas migrem para o polo positivo! Combinação
de eletroforese e difusão dupla emmeio gelificado.
Princípio: Amostra de soro é colocada em um poço
em gel ou lâmina de vidro, a corrente elétrica é
passada através do gel e as proteínas movem-se no
campo elétrico de acordo com carga e tamanho. A
canaleta é cortada no ágar e preenchida com
anticorpos, que se difundem com os antígenos em
direção um do outro formando arcos de precipitados!
→ Proteínas são identificadas baseando-se na
intensidade, forma e posição das linhas de
precipitação.
Nefelometria e Turbidimetria:
Inversos, mas utilizados juntos.
● Nefelometria:mede luz dispersa
● Turbidimetria:mede luz transmitida
Vantagens: rápido, seguro, menos custos.
Turbidimetria:
Indica a turbidez em uma amostra provocada pela
presença maior ou menor de imunocomplexos.
Turbidez: redução da transparência de uma amostra
devido a presença de partículas em suspensão que
interferem na passagem de luz pelo fluido. Mais turva
= mais concentrada!
NTU: unidade de turbidez nefelométrica.
NTU <5: água clara
NTU <30: água ligeiramente turva
NTU >30: água turva
→ Detecta partículas grandes pela redução da
transmissão da luz (absorbância) devido à presença de
partículas em suspensão. Quantidade de dispersão é
proporcional à concentração de imunocomplexos!
→ Muito utilizada para dosar hemoglobina glicada,
análises ambientais e químicas, PCR, ASLO, C3 e C4…
Nefelometria:
Efeito “Tyndall”. Feixe luminoso sobre uma solução
contendo partículas que interferem na passagem da
luz, levando à dispersão da luz em todas as direções! É
bemmais sensível.
→ Quantidade de imunocomplexos formados é
comparada com uma curva-padrão. Fácil, rápida e
precisa. Mesma utilização da turbidimetria. É mais
utilizada para detectar antígenos do que anticorpos!!
Interferências: é comum se congelar e descongelar
para realizar a avaliação no outro dia, o que pode
interferir. Digitais, fibras, poeira, amostras lipêmicas,
hemólise e bolhas são outros fatores interferentes.
→ Ambas as técnicas podem se utilizar de qualquer
fluido corporal, necessitando de pouca quantidade de
amostra.
Ensai�� Conjugad��
Conjugado: anticorpo ligado a um substrato.
A ligação antígeno-anticorpo é MUITO forte!
→ Identificação de cada tipo de ensaio conjugado é
feita pela pesquisa do que se quer encontrar:
Infecções por HIV: ELISA!
Detecção de bactérias específicas: Imunofluorescência!
Teste de alergia: Radioimunoensaio!
ELISA :
Enzyme
Linked
Imuno
Sorbent
Assay
→ Ensaio de ligação entre o anticorpo e o antígeno,
com intuito de mensurar os níveis de anticorpos
contra um determinado antígeno, detectar vírus,
mensurar hormônios, mensurar citocinas, proteínas
inflamatórias, etc.
→ Não requer marcação radioativa ou equipamento
especial. A reação colorimétrica da enzima é estimada
por um espectrofotômetro.
→ Os anticorpos no soro são proporcionais a atividade
enzimática, reação colorimétrica positiva se dará pela
maior diluição do soro desse paciente.
Reação positiva: aparece cor!! Forma-seo complexo
antígeno-anticorpo, onde se fixou o conjugado.
Reação negativa: não aparece cor!! O conjugado não
teve onde se fixar pois não teve a ligação.
ELISA direto:
Adiciona-se uma amostra com antígeno na placa de
teste, um anticorpo específico conjugado, um
substrato cromogênico. O substrato é degradado e
aparece a cor. ex: testes de gravidez.
Qualitativo: utiliza o soro do paciente para ver se
encontra o antígeno, é positivo ou negativo.
Quantitativo: precisa de concentrações já conhecidas
do antígeno, é mais rápido e precisa de apenas um
anticorpo, porém tem baixa amplificação de sinal, sem
flexibilidade na escolha, cara e demorada.
OBS: A intensidade da cor é diretamente proporcional
à concentração de Ag da amostra pesquisada! Quanto
mais antígeno, mais cor!!
ELISA indireto:
Utiliza-se uma placa sensibilizada com o antígeno, a
amostra que será testada com anticorpos. O anticorpo
específico conjugado (anti-Ig humana) reage com o
anticorpo da amostra, adiciona-se o substrato
cromogênico que vai dar a intensidade da cor
(diretamente proporcional à concentração de Ac da
amostra pesquisada). ex: doença de chagas, HIV,
Leishmaniose.
Vantagens: variedade de anticorpos, versátil, máxima
imunoreatividade, maior sensibilidade, vários
marcadores.
Desvantagens: reações cruzadas, mais etapas.
OBS: não nos diz se ele está doente agora, apenas se
já teve contato com aquele agente!
ELISA sanduíche:
O antígeno fica entre 2 anticorpos (um de captura e
um de detecção). É sensível, específico e eficaz! A
utilização de um anticorpo de captura aumenta a
especificidade da ligação com a amostra, ou seja, ela
não precisará ser purificada, evitando a competição
de outros antígenos! ex: para mensurar citocinas,
proteínas inflamatórias, etc.
OBS: Utilizado normalmente contra FP, devido a alta
especificidade!
ELISA de competição:
Quanto menos cor, mais positiva é a amostra! 1
antígeno e 2 anticorpos: 1 conjugado (pronto) e 1 do
soro do paciente (caso houver). Os anticorpos do
paciente são muito mais atraídos pelo antígeno do
que os conjugados, portanto se for positivo os
anticorpos do paciente se ligam ao antígeno e não
sobra espaço para os conjugados, depois de feita a
lavagem, o substrato não terá anticorpos conjugados
para reagir com ele, deixando sem cor.
Imunofluorescênci�:
Fluorocromos: incidência de luz UV no conjugado
anticorpo-fluorocromo, já ligado com o antígeno que se
quer localizar, causa sua excitação, que gera emissão
de luz visível (fluorescência).
→ Verificação por microscópio de fluorescência.
Anticorpos são marcados com corantes fluorescentes
para identificar antígenos na superfície de bactérias e
células.
Lâmina de fluorescência: antígeno comercial ou
pesquisa-se o antígeno em um material coletado do
paciente. ex: imunocruzi (Trypanosoma cruzi).
→ Antissoro (anti IgG ou IgM) é obtido a partir de uma
espécie heteróloga, normalmente carneiros ou cabras,
purificada e marcada com fluorocromo.
1. Reação de imunofluorescência direta (RIFD):
Pesquisa antígenos em células ou tecidos, muito
sensível e específico! Possui um conjugado para cada
sistema. Anticorpos conhecidos e marcados se ligam
aos antígenos desconhecidos, o corante conjugado ao
anticorpo interage na superfície da célula.
2. Reação de imunofluorescência indireta (RIFI):
Mais sensível que o direto, pesquisa anticorpos contra
agentes infecciosos. O antígeno do agente infeccioso
é colocado na lâmina junto com o soro do paciente,
passando por uma lavagem. O antígeno ligado ao
anticorpo é incubado junto com o conjugado de
anti-IgG ou IgM de espécie heteróloga.
→ É utilizado para detecção de anticorpos de
Treponema pallidum (FTA-ABS), Toxoplasma gondii,
vírus da rubéola, vírus herpes simples 1 e 2,
citomegalovírus, Trypanosoma cruzi, Plasmodium
falciparum, Leishmania, etc.