Bioquimica- Eletroforese

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Sumário
Pra que serve a Eletroforese? – Fundamentos 
Técnicas em gel – O que é?
Separação de moléculas de DNA
Análise dos fragmentos de DNA
Eletroforese capilar, saliva e suas proteínas
Lista de Figuras
Figura 1. Preparação para a realização da eletroforese
Figura 2. Eletroforese e a formação do DNA
Figura 3. Reação PCR
Para que serve a Eletroforese? – Fundamentos 
Trata-se de um recurso para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente mediante um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras. 
As moléculas de DNA integralmente, possuem iguais quantidades de carga por massa. Porquanto, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quanto eles são grandes em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos. 
Figura 1: Preparação para a realização da eletroforese
O gel recebe uma corrente elétrica, como o DNA tem carga negativa, ele corre em direção à parte POSITIVA da corrente. Os fragmentos maiores têm dificuldade para atravessar o gel, e acabam correndo mais devagar que os fragmentos menores. Por isso, há o GEL, que tem a capacidade de separar os fragmentos de DNA por tamanho.
A separação das moléculas na eletroforese fundamenta-se na carga (aquilo que é atraído) e na efetiva seção transversal da molécula em qualquer estado em que se encontre – dobrada, desenrolada, ligada a outras moléculas, etc.
Não obstante, existem ressalvas. Algumas moléculas de DNA são circulares (como os plasmídeos bacterianos), enquanto outras são lineares. As moléculas de DNA circulares podem correr no gel diferentemente do que as lineares. Os plasmídeos, por exemplo, podem existir em um formato chamada "superenrolado" com o qual movem-se através do gel com mais rapidez do que deveriam para o seu tamanho, já que foram contorcidos em formas mais estreitas que podem se mover através do gel mais facilmente.
Técnicas em gel – O que é?
A gel eletroforese “rodeia” um gel (uma placa de material gelatinoso). Géis para separação de DNA são cotidianamente feitos do polissacarídeo que se chama agarose, que apresenta-se na forma de flocos secos em pó. Assim, a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e enjeitada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são retidas unidas por ligações de hidrogênio e formam micro poros.
A eletroforese em gel de poliacrilamida (ou PAGE) é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede". O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base). A poliacrilamida apresenta algumas desvantagens, entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em solução, isto é, quando não polimerizada, ser neurotóxica (danifica o sistema nervoso), portanto a preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra.
Previamente, no momento que amostras de DNA são adicionadas, o gel deve ser posto em uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir corrente. A extremidade do gel com os poços está voltada para o eletrodo negativo. A extremidade sem poços (para a qual os fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o eletrodo positivo.
Figura 2: Eletroforese e a formação do DNA
A figura expressa o procedimento ao qual se separa os fragmentos de DNA de uma amostra; é inserida a amostra num lado de um recipiente com gel de agarose (o polissacarídeo mais utilizado), e ligado o lado negativo de uma unidade provedora de energia e a parte positiva do outro ao do gel e assim cada fragmento de DNA migra para o lado positivo, mas devido às formas e tamanhos diferentes, os fragmentos menores tendem a realizar esse processo mais rapidamente.
Separação de moléculas de DNA
Se o gel estiver na caixa, todas as amostras de DNA (cada reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) deverá ser meticulosamente transportada para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. 
As amostras de DNA são carregadas nos poços na extremidade do eletrodo negativo do gel. A energia é ligada e os fragmentos de DNA migram através do gel (para o eletrodo positivo). Após a corrida do gel, os fragmentos são separados por tamanho. Os fragmentos maiores estão perto da extremidade superior do gel (eletrodo negativo, onde eles começaram), e os fragmentos menores estão próximos da extremidade inferior (eletrodo positivo).
Análise dos fragmentos de DNA
Posto que, os fragmentos estejam separados, conseguimos olhar o gel e ver a dimensão de faixas descobertos. Esporadicamente, um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os elementos de DNA brilham, nos permitindo observar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.
Figura 3: Reação PCR 
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel. . Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.
Uma "linha" bem determinada de DNA em um gel é autodenominada banda. Toda banda abrange uma imensa quantidade de fragmentos de DNA do mesmo porte e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. 
Eletroforese capilar, saliva e suas proteínas
A eletroforese capilar é uma técnica que surgiu por volta da década de 80, trazendo inúmeros avanços, principalmente quando se trata de amostras, possibilitando melhores análises. Na bioquímica odontológica, utilizamos esses recursos para entender as inúmeras reações existentes.
Na saliva (onde há muito analitos de interesse para seleção, diagnóstico, etc) existe um grupo de proteínas ricas no aminoácido prolina (fosfoproteínas, glicoproteínas e mucina), estas proteínas ricas em prolina tem como característica principal rigidez estrutural que lhes confere resistência ou estabilidade às mudanças conformacionais. Exemplo: colágeno, que serve de suporte estrutural ao tecido conjuntivo. São encontrados na saliva: albumina, globulina, aglutininas, enzimas e anticorpos.
As fosfoproteínas apresentam grande afinidade pela hidroxiapatita, pois possuem uma concentração relativamente alta de radicais de ácidos, sendo um dos principais constituintes da película adquirida que se forma rapidamente sobre a superfície dos dentes. Também estão envolvidas no processo de remineralização do esmalte e na estabilidade da concentração supersaturada dos íons Cálcio (Ca) e Fosfato (PO₄³⁻) da saliva. Estas proteínas podem agregar os íons de cálcio da saliva em uma determinada região do esmalte, em virtude de seus radicaisácidos, favorecendo uma precipitação desses íons sobre superfícies destruídas pela cárie ou agente ácidos. Um exemplo desse tipo de fosfoproteínas é a rstaterina, que possui grande afinidade pelos íons cálcio.
Estas proteínas apresentam regiões moleculares com alta densidade de cargas elétricas negativas, o que lhes facilita a aderência dos tecidos orais. Por isso seu principal papel fisiológico é formar coberturas orgânicas sobre as superfícies das mucosas e dos dentes, além de envolverem os alimentos, lubrificando-os e facilitando sua mastigação e deglutição (como é o caso da mucina).
A gustina, que assim como a estaterina é rica em aminoácidos aromáticos, transporta e armazena íon zinco junto às papilas gustativas. Ela é uma proteína de saliva de parótida humana, com alta quantidade de Zinco e alta concentração de Histidina.
A lactoferrina, também rica em resíduos aromáticos, sendo básica, está ligada ao transporte de íons Ferro da saliva, apresentam atividade antimicrobiana, inclusive contra Streptococcus mutans que necessita de ferro para o seu crescimento, e este deixa de estar disponível por que se liga à proteína.
Aglutininas salivares exercem papel antimicrobiano considerando que os agregados macromoleculares em solução podem ser eliminados pela deglutição ou também podem se aderir às superfícies dentais em condições favoráveis durante a formação da placa. Acredita-se que estes agregados bacterianos se formam da seguinte maneira: A aglutinação ocorre pela ligação de microorganismos às proteínas salivares por interações de cargas elétricas via ponte de Cálcio ou por ligações das proteínas em receptores específicos na membrana dos microorganismos. As imunoglobulinas são proteínas existentes no plasma e que desempenham funções de defesa contra microorganismos agressores denominados antígenos. A classe predominante da saliva e em outras secreções é a imunoglobulina A (Ig-Alfa) ela representa a primeira linha de defesa do organismo contra a invasão virótica ou bacteriana. Pela maior afinidade que as imunoglobulinas secretoras tem pelos antígenos dos microorganismos, elas formam com os mesmos agregados macromoleculares, impedindo dessa forma a sua aderência às superfícies das mucosas as que facilitam a remoção por deglutição.
Ao que se sabe, as gamaglobulinas, que são anticorpos, existem na saliva como um produto de secreção das glândulas salivares e não originário dos fluidos gengivais uma vez que pacientes adultos também o possui em alto nível. Há fundamentos de que a secreção de anticorpos é importante na proteção contra a carie dental.
A Sialina é um peptídeo rico em arginina capaz de aumentar o pH da placa após a inibição da mesma com solução diluída de glicose ou sacarose. Ela produz um maior efeito sobre o aumento do pH da placa ou sedimento salivar do que a mesma quantidade de Arginina. Isto significa que as células bateristas apresentam uma permeabilidade maior ao peptídeo do que ao aminoácido.
Um estudo foi feito analisando amostras de salivas no Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas: A saliva humana contém muitos analitos de interesse para a seleção, diagnóstico, e monitoramento. A composição da saliva consiste de 99,4% água, 0,3% proteínas que são os componentes mais importantes desta (principalmente enzimas), e 0,3% mucopolissacarídeos e eletrólitos. O pH da saliva coletada de forma não-estimulada está na faixa de 5,6 a 7,0 e aumenta com a estimulação até um máximo de 8,0 [4]. O objetivo do trabalho foi avaliar a utilização da eletroforese capilar na determinação de compostos de interesse fisiológico em amostras de saliva, tais como, cloreto, nitrito, nitrato e tiocianato. Foi utilizado um equipamento de eletroforese capilar construído em laboratório, munido de uma fonte de alta tensão. 
O método desenvolvido vem sendo aplicado na avaliação de doenças relacionadas à saúde bucal e problemas metabólicos ou fisiológicos.
A CE (eletroforese capilar) é uma poderosa ferramenta de separação e, devido à alta resolução obtida, permite a determinação simultânea de diversos íons presentes na saliva.
Referências Bibliográficas
Khan Academy. Reação em cadeia da polimerase (PCR). Disponível em < https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr> Acesso em 11 maio, 2018.
Khan Academy. Eletroforese em Gel. Disponível em < https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis> Acesso em 11 maio, 2018
Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel. Disponível em <https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php> Acesso em 12 maio, 2018.
Determinação de Ânions em Amostras de Saliva por Eletroforese Capilar. Disponível em <http://sec.sbq.org.br/cdrom/31ra/resumos/T1390-1.pdf> Acesso em 12 maio, 2018.