Curso hplc básico

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HPLC PREPARATIVA 
 
Letícia Fracarolli 
Disciplina: Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica: 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto 
SUMÁRIO 
1. Introdução 
1.1. Principais diferenças entre HPLC 
analítico e HPLC preparativo 
2. Colunas 
2.1. Fase estacionária 
3. Fase móvel 
4. Detectores utilizados em HPLC 
preparativo 
4.1. Splitter 
 4.1.1. Calibração do tempo de atraso 
5. Coletor de frações 
6. Preparação da amostra 
 
 
7. Desenvolvimento de métodos 
6.1. Scale-up 
 6.1.1. Scale-up otimizado 
6.2. Sobrecarga da coluna 
8. Sistema Reciclante 
9. Avaliação do resultado de 
uma corrida preparativa 
10. Aplicações 
11. Referências 
 
1. INTRODUÇÃO 
Separação de 
misturas por 
distribuição em 
duas fases móveis 
imiscíveis. 
 
Cromatografia 
 
 
Cromatografia 
líquida de alta 
performance 
preparativa 
 
É um processo de 
purificação que 
usa a 
cromatografia 
líquida. 
1. INTRODUÇÃO 
Esquema de um HPLC preparativo 
1. INTRODUÇÃO 
 Parâmetros para otimizar o fator de separação e 
resolução de picos: 
 
 Fase estacionária apropriada; 
 
 Fase móvel adequada; 
 
 Temperatura. 
1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC 
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO 
HPLC 
preparativo ≠ 
HPLC 
analítico 
Objetivo de isolamento 
ou purificação de 
substâncias de alto valor. 
Objetivo limitado a 
determinação qualitativa 
e quantitativa de um 
composto. 
HPLC 
preparativo 
HPLC 
analítico 
≠ 
Quantidades de amostra 
maiores (mg). 
Quantidades de amostra 
menores (µg). 
1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC 
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO 
O objetivo de uma 
purificação preparativa é a 
produção máxima de 
produto purificado por 
injeção. 
2. COLUNAS 
 
 O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de 
um método; 
 
 Capacidade do material de embalagem: visando maior 
rendimento, colunas com maior capacidade podem 
suportar mais material por injeção. 
 
 O custo de colunas preparativas aumenta com o tamanho. 
 
2. COLUNAS 
 Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de 
material que se deseja injetar. 
 
Diâmetro interno da coluna (mm) Utilidade 
4,6 HPLC preparativo em pequena escala 
7,8 HPLC semi-preparativo 
>21,2 HPLC preparativo em maior escala 
2. COLUNAS 
http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC 
http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC
2.1. FASE ESTACIONÁRIA 
 Componentes rígidos e porosos: 
Sílica – 
C8 
Sílica – 
C18 
Mais 
utilizadas: 
2.1. FASE ESTACIONÁRIA 
 
 Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a 
melhor seletividade para os componentes de interesse. 
 
 
 
 
 
 
2.1. FASE ESTACIONÁRIA 
 Tamanho de partícula: 
 
HPLC 
preparativo 
Partículas de 1,8-3,5 µm não são 
utilizadas. As partículas de 5 µm 
são as mais utilizadas. Para as 
amostras bem resolvidas, são 
escolhidas partículas de 7-10 µm. 
HPLC 
analítico 
Quanto menor o tamanho 
da partícula maior será a 
eficiência. 
≠ 
3. FASE MÓVEL 
 Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático. 
 
 Alguns fatores que influenciam na escolha do solvente 
são os seguintes: 
 
 Fase estacionária e condições de fase móvel com melhor 
seletividade para compostos de interesse; 
 
 Características espectroscópicas do solvente da fase móvel; 
 
 
3. FASE MÓVEL 
 Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração 
isolada; 
 
 Viscosidade; 
 
 Pureza; 
 
 Boas propriedades de solubilidade para cargas máximas de 
amostra; 
 
 Custo dos solventes utilizados. 
 
4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC 
PREPARATIVO 
 Detectores destrutivos: Espectrômetro de Massas, 
Detector Eletroquímico. 
 
 Detectores não destrutivos: Detectores UV VIS, DAD, 
Detector de Índice de Refração, Detector de 
Espalhamento de Luz, Detector de Fluorescência. 
4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC 
PREPARATIVO 
 Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para 
desviar uma pequena parte da amostra para o detector e o 
restante para o coletor de frações. 
4.1. SPLITTER 
 Divisor de fluxo tradicional: divisor passivo. 
4.1. SPLITTER 
 Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e 
uma válvula de troca rápida, que transfere o composto a 
partir do fluxo principal para o fluxo de make-up. 
4.1. SPLITTER 
Possibilidade de selecionar 
diferentes proporções de 
divisão, alterando a 
frequência de troca da 
válvula; 
Proporções exatas e 
constantes, divisão não é 
afetada pela viscosidade, 
temperatura e comprimento 
da tubulação; 
Dois caminhos de fluxo 
independentes, permitem o 
uso de diferentes 
modificadores; 
Contra-pressão mínima, não 
há o perigo de danificar a 
célula detectora. 
Vantagens do 
divisor ativo 
4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO 
 A troca da válvula tem de ser atrasada até que o 
composto passe da célula detectora para a entrada da 
válvula de desvio. Este tempo é chamado de tempo de 
delay (tempo de atraso) (TD1) e deve ser determinada de 
antemão: 
 
Procedimento de 
calibração de 
atraso 
4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO 
Procedimento de 
calibração de 
atraso 
Usado para determinar o 
tempo de atraso entre o 
detector e o coletor de 
frações. 
Injetar um corante concentrado 
sobre o sistema e controlar o 
sinal do detector no visor on-
line do software de controle. 
Começar com um volume de 
atraso estimado ou 
calculado. 
5. COLETOR DE FRAÇÕES 
 
HPLC 
preparativo 
≠ 
HPLC 
analítico 
Amostra vai direto 
para o descarte. 
Amostra vai para o 
coletor de frações. 
5. COLETOR DE FRAÇÕES 
 Disponíveis em diferentes tamanhos e modelos. 
Exemplos: 
 
 Coletor de micro fração: é projetado para vazões abaixo de 
100 µL / min; 
 
 Coletor de fração em escala analítica: é projetado para vazões 
abaixo de 10 mL / min; 
 
 Coletor de fração em escala preparativa: é projetado para 
vazões de até 100 mL / min. 
5. COLETOR DE FRAÇÕES 
 O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de 
fração através da agulha de coleta de fração. 
 Utilizando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por 
exemplo, através de programação de tempo, ou em função de 
um sinal do detector. 
 
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 
 A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar 
HPLC preparativa sobre colunas caras e, embora os 
objetivos não são necessariamente os mesmos, muitos 
dos procedimentos utilizados são idênticos aos 
encontrados em HPLC analítica. 
 Correta dissolução; 
 Filtração de amostra, etc. 
HPLC 
preparativo 
HPLC 
analítico ≠ 
Quantidades de amostra 
maiores (mg). 
Quantidades de amostra 
menores (µg). 
1. Scale-up (ampliação) do 
sistema de análise; 
 
2. Sobrecarga da coluna. 
7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS 
7.1. SCALE-UP 
 Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro 
maior, maior vazão e maior volume da amostra com o 
comprimento da coluna e concentração da amostra 
permanecendo constante. 
 
 Os picos permanecem 
nítidos e simétricos. 
Uso de colunas grandes e 
volumes elevados de 
solventes, portanto, o 
método não seria 
econômico. 
7.1. SCALE-UP 
 Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma 
coluna com D.I menor para uma coluna com D.I maior: 
1. Quantidade de amostra aplicada à coluna; 
2. Vazão. 
 
 
Considere uma ampliação de uma coluna de 4,6 × 150 mm para uma de 19 × 150 
mm: 
Sendo assim, podemos 
dizer que pode ser aplicado 
aproximadamente 17-135 
mg de amostra nesta 
coluna preparativa. 
7.1. SCALE-UP 
Vazão: 
 
 
 
 
Duração do Gradiente: 
 
7.1. SCALE-UP 
 Carregamento (massa) razoável para colunas 
preparativas de acordo com o tamanho, no modo 
gradiente: 
7.2. SCALE-UP OTIMIZADO 
 Otimização e scale-up de uma análise de um método preparativo é feito em 
três passos:Desenvolver e 
otimizar a 
separação inicial 
sobre uma coluna 
de tamanho 
analítica 
Sobrecarregar a 
coluna, mantendo a 
separação adequada 
de componentes de 
interesse 
• Como 
otimizar? 
Aumentar a escala de 
acordo com uma 
coluna preparativa 
com base na 
quantidade de 
composto necessária 
para purificar. 
Coluna: Shim-pack PREP-
ODS(H) Kit 
A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm 
B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm 
 
Fase móvel: 0.1% ácido fórmico/ 
metanol = 1/9 (v/v) 
 
Vazão: 
A) 0.8 mL/min 
B) 15 mL/min 
 
Temperatura ambiente 
 
Detecção em 254 nm 
 
Picos: 1: Ácido Benzóico 
2: 2-naftol 
3: Benzeno 
4: Naftaleno 
5: Bifenilo 
6: Fenantreno 
7: Antraceno 
8: Fluoranteno 
Shimadzu Catalogue 
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA 
 Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas 
condições de análise; 
 
 Geralmente é o método de escolha; 
 
 Permite separar amostras na gama de mg mesmo em 
colunas analíticas. 
 
 Pode ser feito de duas maneiras: 
 Sobrecarga de concentração; 
 Sobrecarga de volume. 
 Sobrecarga de concentração: a concentração da 
amostra é aumentada, mas o volume de amostra injetada 
permanece o mesmo; 
 Sobrecarga de volume: quando o composto tem baixa 
solubilidade. 
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA 
Ambas as técnicas de 
sobrecarga são 
usadas ​​em 
combinação. 
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA 
8. SISTEMA RECICLANTE 
 
 
 A reciclagem em circuito fechado é um método de 
purificação que melhora a separação; 
 
 Reduzir os custos com colunas de grandes 
comprimentos. 
 
8. SISTEMA RECICLANTE 
 A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de 
modo que é possível acomodar a separação e purificação 
de compostos que são normalmente difíceis de separar; 
 
 Não há necessidade de ligar um número de colunas em 
série, de modo que é possível controlar o custo das 
colunas, e reduzir o consumo de solvente utilizado como 
fase móvel. 
 
8. SISTEMA RECICLANTE 
 
9. AVALIAÇÃO DO RESULTADO DE UMA CORRIDA 
PREPARATIVA: 
 Três parâmetros importantes: pureza do produto, o 
rendimento e produtividade; 
 São dependentes uns dos outros, não sendo possível 
otimizar um método de HPLC preparativa com respeito a 
todos os três parâmetros. 
10. APLICAÇÕES 
 Variam de escala para laboratório até escala industrial: 
 
 Separações quirais; 
 Purificação de misturas sintéticas complexas; 
 Isolamento extrato natural; 
 Purificação de peptídeos. 
 
 
 
 
 
 “Estudos epidemiológicos têm mostrado que o aumento 
do consumo de vegetais, como brócolis e couve, pode 
reduzir o risco de desenvolvimento de câncer no 
pâncreas, pulmão, colo-retal e próstata”. 
 
 
Brassica oleracea var. Italica: 
As cultivares de brócolis 
brigadeiro foram cultivadas 
até a maturidade de colheita 
Sementes foram 
selecionadas devido ao 
alto teor de glicorafanina 
Foram moídas com 
água da torneira. 
Desengorduradas 3 x com 
excesso de hexano e 
deixadas a secar durante a 
noite numa coifa. 
Os glicosinolatos foram 
hidrolisados por adição de água 
(03:01 de água/semente 
desengordurada), e a 
mistura foi deixada em autólise 
durante 8 h à temperatura 
ambiente. 
Foram misturados 
cloreto de sódio, a 
farinha molhada e 
sulfato de sódio 
(1:1:0,75). 
A pasta formada foi 
extraída 3 x com iguais 
volumes de cloreto de 
metileno em excesso, a 
qual foi combinada e 
secou-se a 32 ° C sob 
vácuo num evaporador 
rotativo. 
O resíduo resultante foi 
dissolvido em 120 mL 
de acetonitrila 5% em 
água (v /v) e lavado 3 x 
com hexano para 
remover o excesso de 
contaminantes apolares. 
A fase aquosa foi filtrada em 
um filtro de membrana de 
0,22 µm, e preparada para a 
injeção em HPLC. 
Foi injetado 2 mL da 
amostra filtrada. 
MATERIAIS E 
MÉTODOS 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm) 
HR C-18 reversed-phase HPLC column (Waters, Milford, 
MA); 
 Vazão: 9 mL/min; 
 FM: 10 % de acetonitrila em água durante 3 min; mudou 
linearmente durante 2 min a 25 % de acetonitrila, e mantidas 
isocráticamente durante 15 min. A porcentagem de acetonitrila 
foi aumentada para 100% mais de 2 min e seguiu assim, 
isocraticamente por 2 min para purgar a coluna. 
 Detectores: Detector por índice de refração para detectar o 
sulforafano nitrila, e a absorvância a 254 nm foi utilizada para 
detectar o sulforafano. 
 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg 
de sulforafano purificada, e a fração de eluato 
correspondente a cada pico de sulforafano nitrila rendeu 
3,3 mg de sulforafano nitrila purificada. Com base nestes 
resultados, cada quilograma de semente extraída pode 
produzir 4,8 g de sulforafano e 3,8 g de sulforafano 
nitrila. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou 
de síntese. Porém, estes métodos são concebidos apenas 
para a produção de quantidades de mg destes compostos, 
e não se prevê a produção de larga escala necessária para 
estudos extensivos in vivo. Sulforafano está 
comercialmente disponível, mas é muito caro, e 
Sulforafano nitrila não está comercialmente disponível 
no momento. As sementes de vegetais crucíferos 
possuem níveis relativamente elevados de glucosinolatos 
por grama, reduzindo a quantidade de material de partida 
necessário para se obter um extrato aquoso concentrado 
adequado para a separação por HPLC.” 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 “Além disso, a utilização de sementes de brócolis 
brigadeiro facilitou a extração de grandes quantidades de 
sulforafano e sulforafano nitrila, porque verificou-se que 
contém níveis elevados de glicorafanina em comparação 
com outros cultivares.” 
 “Embora não testado no artigo em questão, é provável 
que as sementes de outras variedades de brócolis tendo 
níveis elevados glicorafanina também proporcionarão 
uma boa fonte para purificação de sulforafano e 
sulforafano nitrila com o mesmo método.” 
 
11. REFERÊNCIAS 
 AGILENT TECHNOLOGIES. Principles in preparative HPLC. Agilent Technologies Inc, 
Printed in Germany, April 2007. 
 
 WELLINGS, D. A. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elsevier, 2006. 
 
 KAZAKEVICH, Y.; LOBRUTTO, R. HPLC for pharmaceutical scientists. Wiley, 2007. 
 
 MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, fourth edition. Wiley, 
2004. 
 
 SHIMADZU CATALOGUE. Prominence Preparative HPLC System. 
 
 WATERS CATALOGUE. Preparative LC Columns and Consumables. 
 
 MATUSHESKI, N. V.; WALLIG M. A.; JUVIK, J. A.; KLEIN, B. P.; KUSHAD, M. M.; 
JEFFERY, E. H. Preparative HPLC Method for the Purification of Sulforaphane and 
Sulforaphane Nitrile from Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1867-1872. 
 
11. REFERÊNCIAS 
 How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em: 
<http://www.waters.com/waters/pt_BR/How-Does-High-Performance-Liquid-
Chromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055&locale=pt_BR> Acessado em: 
10/10/2013. 
 
 Scaling Up. Disponível em: <http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/prep/prep3.html> 
Acessado em: 10/10/2013. 
 
 Recycling Preparative HPLC Instrument. Disponível em: 
<http://www.columnex.com/chromatography/instruments/prep-hplc-recycling/> Acessado 
em: 17/10/2013. 
 
 HPLC preparativo. Disponível em: 
<https://pt.vwr.com/app/Header?tmpl=/chromatography/preparative_hplc.htm> Acessado 
em: 17/10/2013. 
 
 Phenomenex Preparative Columns: Disponível em: 
<http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC> Acessado em 24/10/2013.