Atividade Presencial - 2)

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● ROTEIRO DE ATIVIDADE 
PRESENCIAL 02 - ALUNO 
 
Disciplina: Imunologia Clínica 
Unidades Temáticas do Material Didático: aulas: aulas: 03, 04 – Unidade I; 02, 03, 06 e 
08 – Unidade III. 
Professor: Everton Padilha 
 
1. Atividade: Práticas de imunocromatografia e testes de hemaglutinação e 
aglutinação em látex. 
2. Conteúdos: 
1º dia: Mononucleose infecciosa: aglutinação em látex e anti-HBsAg: 
Imunocromatografia; 
2º dia: Teste para Chagas: Hemaglutinação e ASLO: Aglutinação em 
látex; 
3. Objetivo da atividade: desenvolver a prática no diagnóstico imunocromatográfico 
(teste rápido) para detecção de anticorpos e analisar a detecção da Estreptolisina O (S. 
pyogenes) e diagnóstico de Chagas. 
4. Importância do Conteúdo: O aluno conseguirá diferenciar testes positivos de 
negativos ou não reagentes para detectar anticorpos contra Hepatite B, sendo que é 
importante haver por sermos imunizados com a vacina; detectar a presença do vírus 
Epstein Barr causador da Mononucleose Infecciosa, uma doença que pode causar 
linfoma em crianças. O acadêmico também aprenderá realizar o teste de hemaglutinação 
para Chagas, uma doença que acomete coração, esôfago e intestino. Por fim, entenderá 
sobre o diagnóstico da febre reumática com a detecção do ASLO. 
5. Contextualização e preparação para o estudo: 
Mononucleose Infecciosa: A mononucleose infecciosa é uma doença aguda causada 
pelo vírus Epstein Barr, sendo benigna, em crianças e adultos jovens, se manifesta 
clinicamente por febre adenopatia cervical posterior e inflamação da garganta. 
Hematologicamente manifesta-se por aumento de monócitos e linfócitos, com mais de 
10% de formas atípicas e sorologicamente pelo aparecimento transitório de aglutininas 
de células de carneiro, hemolisinas de células bovinas e presença de anticorpos contra 
o vírus Epstein-Barr. Em 1932 Paul e Bunnel descobriram que, durante o curso da 
mononucleose, anticorpos da classe IgM, que aglutinavam eritrócitos de carneiro e 
cavalo, apareciam no soro dos pacientes. Mais tarde, Davidsohn observou a 
possibilidade de distinguir os anticorpos heterófilos da doença do soro em relação aos 
da mononucleose, introduzindo uma adsorção diferencial com extrator de rim de cobaia 
ou cavalo. Essa produção de anticorpos heterofilos se dá por o vírus infectar linfócitos B 
e ativa-los de maneira inespecífica. 
 
Anti-HBs: O HBsAg é o primeiro marcador sorológico a positivar em infecção por HBV. 
A presença de HBsAg freqüentemente antecede o início dos sintomas e das 
anormalidades bioquímicas hepáticas por 6-8 semanas. Em pacientes que se curam, o 
HBsAg desaparece do soro em 12-20 semanas após o início dos sintomas ou do 
aumento das concentrações das aminotransferases.Apersistência de HBsAg positivo por 
mais de 6 meses é geralmente indicativo de infecção crônica, podendo evoluir para 
cirrose ou carcinoma hepatocelular. O surgimento do anti-HBsAg e consequente 
desaparecimento do HBsAg confere imunidade ao indivíduo, fato esse em que se baseia 
a vacinação para a hepatite B através da utilização de HBsAg purificado para o 
desenvolvimento do anti-HBsAg. 
Entre o desaparecimento do HBsAg e o aparecimento do anti-HBsAg há um período 
onde não se encontram o marcador antígeno de superfície da hepatite B e seu 
correspondente anticorpo, o qual é conhecido como “janela imunológica”, provavelmente 
devido à presença de imunocomplexos HBsAg – anti-HBsAg. Nesta fase sorológica ou 
quando a concentração de HBsAg não atinge níveis mínimos de detecção do teste, a 
detecção do HBcAg-IgM torna-se o marcador isolado de infecção aguda do vírus da 
hepatite B. 
 
Doença de Chagas: A doença de Chagas ou Tripanossomíase. Americana é uma 
infecção endêmica, de evolução essencialmente crônica, causada por um protozoário, o 
Trypanosoma cruzi, e transmitida ao homem por um inseto, o triatomíneo. 
Imunologicamente, 3 estágios podem ser considerados: agudo, latente ou indeterminado 
e crônico. Na fase aguda, verificam-se febre, miocardiopatia, linfoadenopatia, 
hepatoesplenomegalia e parasitemia. A multiplicação intracelular dos parasitas nos 
músculos lisos e estriados e células do sistema retículo endotelial acarreta a formação 
de pseudocistos. Na fase intermediária ou latente não há sintomas. A doença pode 
evoluir para a fase crônica com sinais de miocardiopatia, degeneração das células 
ganglionares do sistema nervoso central e periférico, hipertrofia e dilatação de certos 
órgãos, tais como esôfago e cólon, constituindo os mega. Como a minoria dos indivíduos 
com sorologia positiva para T. cruzi desenvolve evidências clínicas da doença crônica, 
as informações prestadas pelo laboratório clínico tornam-se decisivas no diagnóstico 
etiológico. 
 
ASLO: A estreptolisina O, produzida por quase todas as cepas de Streptococus 
pyogenes, é uma hemolisina oxigênio-lábil (inativada pelo oxigênio), com potente 
antigenicidade. O anticorpo formulado contra ela, o antiestreptolisina O, tem se tornado 
o indicador de infecções estreptocócicas e suas complicações, tais como a febre 
reumática e a glomerulonefrite aguda. A concentração de anticorpos antiestreptolisina O 
aumenta no final da primeira semana após a infecção estreptocócica e atinge seu valor 
máximo entre a 3ª e 5ª semanas, retornando, na maioria dos casos, ao nível normal do 
segundo ao quarto mês. 
 
6. Descrição da atividade: 
1º dia: MONONUCLEOSE INFECCIOSA e ANTI-HBsAg 
 
Mononucleose Infecciosa 
Procedimento: 
1. Pipetar 25 μL da amostra do paciente em uma área do cartão-teste. 
2. Homogeneizar a suspensão de látex (1) e pipetar 25 μL na mesma área da amostra. 
3. Com uma vareta plástica misturar muito bem o soro com o látex, espalhando cuidadosamente. 
4. Através de movimentos suaves de rotação, sob uma boa fonte de luz, observar durante 1 
minuto a formação de uma eventual aglutinação. 
ATENÇÃO: 
1) Para cada série de testes deve-se fazer um controle positivo e negativo para verificar a correta 
execução da técnica e o estado de conservação dos reagentes. 
2) Nos casos em que o paciente apresenta clínica exuberante de mononucleose e o teste é 
negativo, aconselha-se repetir o teste diluindo a amostra a 1:10 com salina (0,9% de NaCI), 
devido a possibilidade de prozona. 
Para teste com a diluição: 
1. Colocar 90 μL solução salina (0,9% de NaCl) em cada tubo de ensaio, e adicionar 10 μL da 
amostra no primeiro tubo, homogeneizando 5 vezes, retirando 10 μL do primeiro tubo e passando 
para o segundo, assim consequentemente até o ultimo tubo, desprezando os últimos 10 μL (vide 
vídeo-aula informativa). 
2. Pipetar 25 μL na área do cartão teste. 
3. Pipetar 25 μL da suspensão de látex em cada diluição. Misturar com vareta plástica e 
desprezar, sem utilizar de uma diluição para outra. 
 
Anti-HBsAg 
Amostras: Usar amostras recém-colhidas de sangue total, soro ou plasma livre de hemólise, 
lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. 
Para armazenagem mais longa, as amostras de soro ou plasma devem ser mantidas no freezer 
a -20 ºC. Sangue total deve ser colhido por punção digital sem a utilização de anticoagulantes, 
pois em casos de amostras com baixa reatividade, pode induzir a um resultado falso negativo. 
Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. 
Procedimento: 
1. Deixar a placa-teste (1) adquirir a temperatura ambiente antes de retirá-la do envelope 
laminado. 
2. Pipetar 100 μL da amostra ou controle (sem bolhas de ar) na cavidade da amostra na placa-
teste. 
3. Fazer a leitura dos resultados entre 15 e 20 minutos. Não considerar resultados lidos após 20 
minutos. 
 
2º dia: CHAGAS e ASLO 
 
Chagas (hemaglutinação): 
Usar soros de pacientes em jejum, frescos ou conservados a –20 ºC. Evitar o congelamento e 
descongelamento repetidos do soro. Os soros envelhecidos tendem a gelificar em contato com 
2-mercaptoetanol, provocando resultados falso-positivos. 
PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES· SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS SENSIBILIZADAS (1): pronta para uso. Estável até a data do 
vencimento se conservada entre 2-8 ºC. Não congelar. Homogeneizar bem antes do uso, 
sempre com movimentos circulares do frasco entre as mãos e por inversão do frasco, mas 
nunca por agitação, pois esta pode acarretar hemólise e/ou autoaglutinação. Antes de ser 
usada, deixar em temperatura ambiente. 
SOLUÇÃO DILUENTE (2): conservar entre 2-30 ºC. No momento do uso, acrescentar 70 μL de 
2-mercaptoetanol (3) para cada 10 mL da solução diluente. Esta solução diluente com 2-
mercaptoetanol é usada para diluir as amostras do soro. O uso do 2-mercaptoetanol tem como 
objetivo a retirada de anticorpos interferentes. (NOTA: para não diluir em grande quantidade, 
adicionar 7 μL do β-mercaptoetanol em 1 mL da solução diluente. CUIDADO com a 
volatilidade, pois essa substância é tóxica e tem mau cheiro), vide vídeo-aula prática. 
Todos os outros reagentes estão prontos para uso, não havendo necessidade de diluir. 
b. Teste Qualitativo 
1. Colocar a placa sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas. 
2. Usar 1 cavidade de placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. 
3. Fazer diluição da amostra em solução salina a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e 1/32, se necessário (vide 
vídeo explicativo da aula prática) ou 10 μL da amostra em 310 μL da solução diluente com o β-
mercaptoetanol. 
4. Pipetar 50 μL do soro controle positivo, negativo e da diluição 1/32 de cada amostra nas 
respectivas cavidades da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo e A3, A4, 
A5... soros a serem testados. 
OBS: Não diluir soros controles positivo e negativo, pronto para uso, já diluído 1/32. 
5. Adicionar 25 μL da suspensão homogênea de hemácias (1) em cada cavidade. 
6. Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo, com os dedos, nas 
bordas da placa por 3 a 4 minutos. 
7. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações 
(IMPORTANTE). 
8. Fazer leitura. 
Reação Negativa: quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade formando um botão. 
Reação Positiva: quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, as 
vezes com bordas irregulares. 
 
 
ALSO (ANTI-ESTREPTOLISINA O) 
PROCEDIMENTO 
a. Teste Qualitativo 
1. Pipetar 25 μL do soro do paciente em uma área do cartão-teste. 
2. Homogeneizar a suspensão de látex (1) e pipetar 25 μL na mesma área da amostra. 
3. Misturar muito bem o soro com o látex, espalhando-se cuidadosamente com uma vareta 
plástica. 
4. Através de movimentos suaves de rotação, sob uma boa fonte de luz, observar durante 2 
minutos a formação de uma eventual aglutinação. 
ATENÇÃO: Para cada série de testes devem se fazer controles positivo e negativo para verificar 
a correta execução da técnica e o estado de conservação dos reagentes. Efeito pró-zona pode 
ocorrer em concentrações superiores a 1500UI/ml. Se houver suspeita de níveis superiores a 
este, a amostra deverá ser diluída. 
RESULTADO DAS LEITURAS 
Resultado Positivo: Aglutinação tênue ou nítida. Concentração igual ou superior a 200Ul/mL. 
Resultado Negativo: Total ausência de aglutinação. Concentração inferior a 200Ul/mL. 
ATENÇÃO: A sensibilidade do teste foi ajustada para detectar 200Ul/mL. Portanto, consideram-
se soros negativos os que possuam menos que 200Ul/mL. 
b. Teste Semi-Quantitativo 
1. Diluir o soro do paciente em salina (NaCl a 0,9%) 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e mais se necessário. 
2. Pipetar 25 μL de cada diluição em cada área do cartão-teste. 
3. Homogeneizar a suspensão de látex (1) e pipetar 25 μL em cada área onde se encontra a 
diluição da amostra. 
4. Misturar muito bem o soro com o látex, espalhando-se cuidadosamente com uma vareta 
plástica (uma para cada diluição). 
5. Através de movimentos suaves de rotação, sob uma boa fonte de luz, observar durante 2 
minutos a formação de aglutinação (vide resultado das leituras). O título da amostra 
corresponderá a maior diluição em que ocorrer aglutinação. A concentração de ASLO será dada 
pelo seguinte cálculo: Concentração (Ul/mL) = 200 x D, onde 200 é a sensibilidade do teste e D, 
a maior diluição que apresenta aglutinação. 
EXEMPLO: Se o título obtido for 1:8, a concentração aproximada de ASLO existente na amostra 
será: 200 x 8 = 1600Ul/mL. 
 
Questões: 
1ª) Qual a importância dos anticorpos heterofilos no diagnóstico de doenças? 
2ª) Qual a diferença entre detectar o HBsAg e o Anti-HBsAg clinicamente? 
3ª) A presença de Anti-HBsAg é indicativo da donça viral? 
4ª) Como funciona a técnica de Hemaglutinação? 
5ª) Quais as diferenças entre as técnicas de Imuno-látex de MNI e ASLO? 
 
7. Fontes de pesquisa 
WAMA Diagnóstica, Imuno-rápido Anti-HBsAg. I Edição: Rev. 07/2011 
WAMA Diagnóstica, Imuno-látex MNI. Edição VI: Rev. 02/2011 – C. 
 
WAMA Diagnóstica, Imuno-HAI Chagas. Edição VI: Rev. 10/2010 - B 
WAMA Diagnóstica, Imuno-látex - ASLO. Edição VI: Rev. 02/2011 - B 
8. Referências bibliográficas 
ABDALLAH ATIYEH M., ABU-MADI MARAWAN. The Genetic Control of the 
Rheumatic Heart: Closing the Genotype-Phenotype Gap, Frontiers in Medicine, 
Vol 8, 2021. 
CARDOSO MS, REIS-CUNHA JL AND BARTHOLOMEU DC. Evasion of the 
Immune Response by Trypanosoma cruzi during Acute Infection. Front. 
Immunol. 6:659, 2016. 
COEN, DONALD M.; SCHAFFER, PRISCILLA A. Antiherpesvirus drugs: a 
promising spectrum of new drugs and drug targets. Nature Reviews Drug 
Discovery, 2003. 
TIMMY RICHARDO, HISASHI IIZASA, HIRONORI YOSHIYAMA, et al. Epstein-
Barr Virus Mediated Signaling in Nasopharyngeal Carcinoma Carcinogenesis. 
Cancers, August 2020. 
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/07_0044_M2.pdf 
Viral Hepatitis and Liver Disease, acesso: https://www.hepatitis.va.gov/hcv 
 
 
 
 
ATENÇÃO 
Os roteiros devem ser enviados, impreterivelmente, 15 dias antes 
do início da disciplina, visando possibilitar que todos os envolvidos 
realizem a preparação necessária para o desenvolvimento da atividade. 
No momento do envio para o Coordenador de Curso, copie no e-mail o 
tutor mediador da disciplina e a secretária do núcleo a qual o curso 
pertence. 
No segundo encontro presencial de cada semana deve ser dada 
continuidade ao desenvolvimento da atividade presencial proposta neste 
roteiro, esclarecendo dúvidas, discutindo resultados, estimulando a 
interação entre os alunos, etc.