Introducao ao Eritrograma

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Introdução ao Eritrograma 
HEMATOPOIESE: Divisão; diferenciação; e maturação das células sanguíneas desde a célula de origem
· Ocorre extravascularmente nos mamíferos; durante vida fetal e recém natal ocorre em outros órgãos 
· Em aves a granulopoiese acontece extravascular; eritropoiese e formação de trombócitos é intravascular
Hematopoiese se inicia no saco vitelino quando há início da formação vascular e com o desenvolvimento fetal fígado; baço e medula óssea são os maiores responsáveis pela hematopoiese
· Após nascimento ocorre apenas na medula óssea; no inicio a medula de todos os ossos participa desse processo, mas com o tempo somente os ossos chatos e epífises dos ossos longos participam (esterno; ílio; crânio; costelas fêmur e úmero)
· Demanda de eritrócitos diminui com a maturidade
*A medula óssea vermelha é considerada ativa; e com o crescimento do animal e diminuição da sua atividade eritropoietica ela é substituída por tecido gorduroso chamado de medula óssea amarela ou inativa*
· Em casos de necessidade o organismo regenera a medula óssea vermelha; 
· Na velhice medula amarela se torna medula fibrosada; lenta e difícil expansão; dificulta resposta rápida contra anemia 
ERITROPOIESE
Resulta na formação de eritrócitos maturos e dura cerca de 7 a 8 dias; início na medula óssea 
· O núcleo eritrocitário é expulso e fagocitado por macrófagos locais; o que não ocorre em aves; repteis; peixes e anfíbios
PROCESSO
Célula pluripotencial de origem mesenquimal CÉLULA TRONCO é estimulada a proliferação e diferenciação em “burst” de unidade formadora de colônia eritróide (BUF-E) pela IL-3 e pelo fator estimulante de colônia granulocitica-monocitica na presença de eritropoietina (EPO)
· Ocorre devido influência do microambiente medular e citocinas produzidas por macrófagos e linfócitos T ativados
Burst (BUF-E) se prolifera e diferencia para Unidade formadora de colônia eritróide (UFC-E)
· Ocorre devido aos mesmos fatores; e pode ser potencializado por fatores de crescimento adicional
EPO é o fator de crescimento primário para proliferação e diferenciação da UFC-E para rubriblasto, primeira célula morfologicamente reconhecível na linhagem dos eritróides
CÉLULA TRONCO BUF-E UFC-E Rubriblasto Pró rubricito rubricito basofílico rubricito policromático metarrubricito reticulócito ERITRÓCITO 
Envolve no mínimo 4 mitoses: uma na fase rubriblasto; uma no pró rubricito; duas no rubricito basofílico 
· Rubricito basofílico imaturo; matura e diferencia para rubricito policromático
· Metarrubricito perde o núcleo e se diferencia em reticulócito 
· Multiplicação dura de 2 – 3 dias; maturação de 5 dias 
PROERITROBLASTO (1): É a primeira célula da série vermelha morfologicamente diferenciada e apresenta citoplasma intensamente basofílico com halo claro ao redor do núcleo. Em geral, pode exibir extrusões citoplasmáticas (setas). A cromatina é frouxa e pode apresentar nucléolos. Normalmente, constitui 1% da medula óssea...
ERITROBLASTO BASÓFILO OU RUBRICITO BASÓFILO (2): É a célula do segundo dia da eritropoiese. O núcleo apresenta condensação de cromatina, já sem nucléolos visíveis. O citoplasma é basofílico. O tamanho é médio e constitui aproximadamente de 1% a 4% das células da medula óssea...
ERITROBLASTO POLICROMÁTICO (3): Esta célula tem o diâmetro um pouco menor que o eritroblasto basófilo, com citoplasma de cor acinzentada, resultante da acidofilia da hemoglobina e da basofilia do RNA. O núcleo apresenta cromatina condensada. Os eritroblastos policromáticos constituem em média de 2% a 5% das células da medula óssea...
ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO (4): Esta forma de maturação surge entre o 4º e o 5º dia do início da eritropoiese, apresentando um núcleo picnótico e geralmente excêntrico. O citoplasma policromático indica a existência de acentuada síntese de hemoglobina. O eritroblasto ortocromático constitui, em média, de 5% a 10% das células da medula óssea...
ERITROBLASTO ORTOCROMÁTICO EXPULSANDO O NÚCLEO (5): Antes de se transformar em reticulócito, o eritroblasto ortocromático expulsa o núcleo.
Eritrograma I
· Número total de Hemácias
· Volume Globular %
· Concentração de hemoglobina
· Volume corpuscular médio VCM
· Concentração de hemoglobina corpuscular média 
· Proteínas plasmáticas 
· Reticulócitos
· Metarrubricito
 se observa no esfregaço anisocitose; policromasia e outras alterações 
VOLUME GLOBULAR ou hematócrito representa a porcentagem de eritrócitos no sangue; após a centrifugação as células sedimentam e possibilita a leitura em régua de hematócrito
· Permite visualização da coloração do plasma e a capa leucocitária
· Microfilárias e Tripanossoma spp
	COLORAÇÃO DO PLASMA
	INTERPRETAÇÃO
	INCOLOR
	Normal em cães e gatos
	AMARELA
	Normal em herbívoros devido ao caroteno da dieta 
	AMARELA
	Ictérico em cães e gatos 
	BRANCO
	Fisiológico (lipemia pós brandial); patológico diabetes; hipotireoidismo...
	VERMELHO
	Hemólise por artefato de técnica; anemia hemolítica; Lupus; Babesia; intoxicação
· Anemia relativa há um aumento do plasma e o VG é diminuído
· Anemia absoluta há diminuição das células vermelhas e VG é diminuído
· Policitemia relativa há diminuição do plasma e VG aumenta
· Policitemia absoluta há aumento das células vermelhas e o VG aumenta
· Contração esplênica produz valores altos e é comum em cavalos excitados
· Alterações na hidratação afetam os parâmetros 
REALIZAÇÃO DO VG / HEMATÓCRITO
· Por capilaridade preencher 2/3 do tubo capilar (tamanho 75mm x 1mm) com a amostra de sangue com anticoagulante
· Fechar a extremidade seca com o bico de Bunsen ou massinha de modelar
· Centrifugar o tubo capilar em 1200rpm (1580G) por 5 minutos 
· Ler na régua ou tabela de hematócrito 
· Normal na média de 37% para gatos; 45% para cães
Eritrograma II
RETICULÓCITOS são precursores dos eritrócitos; apresentam um grau variável de dobras membranosas e invaginações de superfícies, assim como ribossomos, polirribossomos e mitocôndrias que sintetizam mais de 20% do conteúdo final de hemoglobina. Permanecem na medula óssea por cerca de 2 a 3 dias até chegarem ao sangue por diapedese e maturam se em eritrócitos após 24h a 48h na circulação ou no baço; nesse processo perdem algumas superfícies de membrana, receptores para transferrina e fibronectina, ribossomos e outras organelas, também obtém a concentração normal de hemoglobina, organização final do esqueleto submembranoso, redução do tamanho celular e mudança de forma para bicôncava.
A contagem de reticulócitos é o melhor indicativo da atividade (resposta) efetiva da eritropoiese medular; mas existem variações interespécies
· Equinos não liberam reticulócitos nem mesmo em anemia severa; cães e gatos respondem vigorosamente com reticulocitose durante anemia regenerativa; ruminantes tem resposta leve
· Eritropoietina influencia % de reticulócitos
· Coloração do esfregaço feita com corantes supravitais Azul de metileno ou azul cresil brilhante e observação microscópica
· A contagem de reticulócitos deve sempre ser comparada ao esfregaço sanguíneo para confirmar reticulocitose/reticulocitopenia
· Se a contagem de reticulócitos for maior que 2% e no esfregaço corado com panótico não houver policromasia refazer contagem de reticulócitos e esfregaço sanguíneo 
	GRAU DE RESPOSTA
	% DE RETICULÓCITOS
	
	Cães
	Gatos (agregados)
	Cavalos e ruminantes 
	NORMAL
	0 – 1,5
	0 – 0,4
	Ausentes
	LEVE
	1 – 4
	0,5 – 2,0
	1 é sinal regenerativo
	MODERADA
	5 – 20
	3,0 – 4,0
	-
	INTENSA
	21 – 50
	>50
	-
PROCEDIMENTO
· Colher amostra de sangue com EDTA, e diluir parte da amostra com azul cresil brilhante conforme os parâmetros
Hematócrito até 30% 12 gotas de sangue e 3 gotas de corante
Hematócrito 30 – 45% 9 gotas de sangue para 3 gotas de corante
Hematócrito acima de 45% 6 gotas de sangue para 3 gotas de corante
· Após diluir a amostra, homogeneizar e colocar em banho maria a 370C por 20 minutos
· Retirar do banho maria e homogeneizar; retirar uma gota e realizar o esfregaço
· Ler na objetiva de imersão; contar vários campos até a contagem de 1.000eritrócitos e anotar o número de reticulócitos nesses campos
· Utilizar a fórmula abaixo
CONTAGEM DE RELATIVA DE RETICULÓCITOS % = (reticulócitos contados / total de eritrócitos) 
RETICULÓCITOS CORRIGIDOS= % relativa de reticulócitos x (VG do paciente /VG médio normal)
· Após hemorragia aguda leva 3 a 4 dias para ter reticulocitose significante, e até 1 – 2 semanas para a resposta máxima 
· Anemia hemolítica severa reticulocitose em 1 – 2 dias, seguida de intensa eritropoiese
· Reticulócitos e eritrócitos jovens podem apresentar morfologia adicional como a fragmentação ou extrusão incompleta do núcleo formando o Corpusculo Howell Jolly; nesse caso o corpúsculo é removido no baço, indivíduos esplenectomizados ou com perda de função do baço podem apresentar essa alteração 
· Esfregaços avermelhados indicam um baixo tempo de ação do corante; esfregaços em tonalidades cinza indicam uma ação prolongada do corante 
*Reticulócitos são eritrócitos imaturos e anucleados que possuem RNA citoplasmático que pode ser corado; possuem grânulos citoplasmáticos e podem ser pontilhados ou agregados (+ jovens)* 
REGULAÇÃO DA ERITROPOIESE
O principal estimulo é a tensão tecidual de oxigênio P02. A hipoxia tecidual estimula produção do fator humoral ERITROPOIETINA pelos rins (células corticais endoteliais, glomerulares e intersticiais) e em menor quantidade pelo fígado (células de Kuppfer, hepatócitos e células endoteliais), cuja função é a produção de eritrócitos. A eritropoietina é gerada com a ativação do eritropoietinogênio (alfa globulina) pelo fator eritropoietico renal (eritrogenina) ou pela ativação da proeritropoietina que também é produzida nos rins.
· Eritropoietina estimula mitoses de células eritróides, reduz tempo de maturação, aumenta a liberação de reticulócitos e eritrócitos jovens no sangue 
· A glândula pituitária influencia a síntese de eritropoietina através da produção de TSH, ACTH, e hormônio do crescimento; adrenais através da produção de corticosteróides; tireóides com a produção de tiroxina; alteram a demando de oxigênio nos tecidos, alterando a necessidade de eritropoiese
· Estrógeno é uma influência negativa, inibitória
· Andrógenos aumentam a taxa de glóbulos vermelhos 
· Vitamina B12, ácido fólico, cobalto, ácido nicotínico servem como substrato para possibilitar a divisão celular
· Na hemoglobinização citoplasmática feita pelo RNA mensageiro precisa-se de ferro na forma ferrosa, cobre e pirodoxina
Aumento na produção de eritropoietina pelos rins e liberação na circulação sanguínea 
Liberação de reticulócitos pela medula óssea e aumento na circulação
Diminuição de O2 tecidual
· 
DESTRUIÇÃO ERITROCITÁRIA 
A contagem total, o tamanho e a vida média dos eritrócitos variam conforme as espécies. Os eritrócitos deixam a circulação por fagocitose de macrófagos ou por lise intravascular com liberação de hemoglobina; em casos de animais sadios.
· Deformabilidade, alteração na fluidez interna da hemoglobina, propriedades visco elásticas intrínsecas de membrana; são alterações capazes de ativar a destruição eritrocitária que ocorre principalmente no baço e no fígado 
· Presença de IgG na superfície de membrana de eritrócitos velhos ou danificados ativam a atividade fagocitaria dos eritrócitos 
· A perda de eritrócitos é compensada e balanceada com a liberação de reticulócitos pela medula óssea 
· Reticulócitos permitem classificar as anemias em regenerativas, ou arregenerativas (sem presença de reticulócitos)
· Babesiose aumento de reticulócitos em 4 – 5 dias 
*HEMOCATERESE é o processo que ocorre no baço com destruição de eritrócitos velhos e danificados por fagocitose dos macrófagos e liberação do ferro e hemoglobina para o organismo*
	ESPÉCIE
	NÚMERO TOTAL (milhões/mm3)
	TAMANHO
	VIDA MÉDIA (DIAS)
	CANINO
	6 – 8
	7
	120
	FELINO
	5 – 10
	5,8
	70
	EQUINO
	9 – 12
	5,7
	150
	BOVINO
	5 – 10
	5,5
	160
	OVINO
	9 – 15
	4,5
	100
	CAPRINO
	8 – 18
	4
	100
	SUINO
	5 – 8
	6
	65
HEMOGLOBINA
É uma proteína conjugada formada de 96% de proteínas globinas e 4% pelo grupo heme (ferro e grupamentos porfirinicos); sua produção ocorre no citoplasma das células nucleadas precursoras dos eritrócitos.
O ferro necessário para a eritropoiese provem dos macrófagos adjacentes que recebem o ferro através de endocitose da ferritina (proteína transportadora), as moléculas de ferritina são milhares de átomos de ferro envoltos pela proteína apoferritina e estão localizadas na membrana celular ou no citoplasma de células eritróides e macrófagos
A ferritina é lipossolúvel e é degradada em hemossiderina insolúvel por enzimas lisossomais intracelulares nos macrófagos, mas ambas são usadas na síntese de ferro para porção heme 
Formação deficiente de hemoglobina
1-Deficiencia de ferro por ingestão deficiente ou absorção anormal deste elemento
2-Interferencia na atividade normal das células macrofagicas (SRE) que produzem normalmente a hemoglobina; pode ocorrer por envenenamento por metais, toxemias, neoplasias, nefrites...
3-Anormalidades renais que interferem na formação da eritropoietina
Hemólise é o processo onde a união entre a hemoglobina e o estroma eritrocitário se quebra devido a ação do agente hemolítico, nesse processo ocorre a liberação de hemoglobina livre que é rapidamente decomposta por oxidação e liga-se a haptoglobina que é excretada pelos rins, observando hemoglobinúria; ou ainda pode ser destruída pelo Sistema Fagocitário Mononuclear (SMF). A hemoglobinemia é a cor avermelhada do plasma por presença de hemoglobina; o excesso de hemoglobina livre é oxidado em meta-hemoglobina que se dissocia e libera hematina, que se liga a hemopexina e albumina sucessivamente formando complexos que são removidos pelos hepatócitos.
Nos macrófagos o ferro da fração heme e os aminoácidos da fração globina são reciclados para o organismo, a protoporfirina é degradada em biliverdina pela heme microssomal oxigenasse; e a bilirrubina redutase transforma a biliverdina em bilirrubina
· Aves secretam apenas biliverdina pois não possuem a enzima bilirrubina redutase 
A bilirrubina é liberada no plasma e liga-se a albumina para se transportar até as células hepáticas onde é conjugada em ácido glicurônico pela enzima UDP (glucoronil transferase). A bilirrubina conjugada é secretada pelos canalículos biliares e excretada na luz intestinal através da bile; no intestino é degradada a urobilinogênios para a sua excreção nas fezes, também ocorre reabsorção parcial para a circulação e re-excreção biliar no ciclo entero-hepático da bile. Uma pequena quantidade bilirrubina conjugada e urobilinogênio escapam da re-excreção hepática e são excretados pela urina, em quantidades muito elevadas pode indicar problemas hepáticos.
· Bilirrubina livre ou indireta e bilirrubina conjugada ou direta
· A bilirrubina não conjugada não é filtrada pelo rim; acumulo de bilirrubina na circulação leva a icterícia 
· Anemia hemolítica tem maior presença de bilirrubina não conjugada; e na obstrução extra hepática do ducto biliar a aumento de bilirrubina conjugada; nas doenças hepatocelulares há aumento de ambas as formas
· A concentração de bilirrubina na circulação dos equinos é alta comparada as outras espécies 
ESFREGAÇO SANGUINEO 
ÂNGULO DE APROXIMADAMENTE 450
ERROS COMUNS NO ESFREGAÇO!!!
A coloração pode ser feita com a técnica de Leishamann que utiliza Eosina-Azul de metileno e metanol; ou com Panótico solução comercial de 3 corantes de uso em série, sendo o primeiro um agente fixador; o segundo corante de hemácias e o terceiro corante de leucócitos e plaquetas.
DETERMINAÇÃO DA HEMOGLOBINA
O método de cianometa-hemoglobina tem margem de erro próximo a 5% e utiliza um fotocolorimetro ou espectrofotômetro; aparelhos automáticos medem diretamente a densidade ótica da oxi-hemoglobina. O método da hematina ácida possui margem de erro de 12% e utiliza-se o hemoglobinômetro de Sahli. Hemoglobina corresponde a aproximadamente 1/3 do hematócrito.
PROCESSO
· Diluição do sangue com solução contendo cianeto de potássio e ferrocianeto de potássio (Reativo deDrabkin) que converte a hemoglobina em cianometahemoglobina
Reativo de Drabkin: cianeto de potássio (50mg); ferrocianeto de potássio (20mg) e água destilada (1000ml)
· Amostra de sangue colhida com EDTA; preencher 20µg da pipeta de Sahli com o sangue e adicionar a 4ml de reativo de Drakbin e agitar por inversão 
· Repousar por cerca de 10 minutos a temperatura ambiente 
· Ler em espectonômetro a 546 nanômetros usando tubos específicos 
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE HEMÁCIAS
Pode ser feita por hemocitômetro mas tem grande possibilidade de erro, a contagem por aparelhos automáticos tem valores mais exatos. Solução fisiológica (0,9% NaCl) pode ser usada para diluição; mas os diluentes mais usados são diluente de Marcano e diluente de Gower
Diluente de Marcano: sulfato de sódio (50g); formol 40% (10ml); água destilada (1000ml)
Diluente de Gower: sulfato de sódio (12,5g); ácido acético glacial (33,3ml); água destilada (200ml)
PROCESSO
· Amostra de sangue colhida com EDTA; homogeneizar e pipetar com a pipeta de Thoma até a marca de 0,5; limpar o excesso da ponta da pipeta
· Diluir o sangue com solução fisiológica ate a marca 101; agitar e desprezar as primeiras gotas
· Encher a câmara de Neubauer por capilaridade
· Contar hemácias de 5 quadrados médios e multiplicar por 10.000/µl
MORFOLOGIA DOS ERITRÓCITOS
TAMANHO
NORMAL: célula normalmente grande em caninos, e normalmente pequena em caprinos
ANISOCITOSE: diferença de tamanho entre as hemácias; quanto mais grave a anemia maior a anisocitose 
MACROCITOSE: predomínio de hemácias maiores, geralmente são céulas jovens; presente em reticulocitose; metarrubricítos; hipertireoidismo; deficiência de fatores de multiplicação; animais jovens
MICROCITOSE: predomínio de hemácias menores; ocorre em anemias crônicas principalmente ferropriva; quanto maior a quantidade mais grave. É fisiológico em idosos e algumas raças
FORMA
BICÔNCOVA: normal
ESFERÓCITOS: hemácias com formas esféricas e intensa coloração pela perda de conteúdo de membrana sem a perda de hemoglobina devido eritrofagocitose parcial dos anticorpos e/ou complementos dos eritrócitos pelos macrófagos do SMF; presente em anemia hemolítica autoimune primária ou induzida por drogas; transfusão incompatível 
POIQUILÓCITOS: alterações de formato da hemácia; no baço devido a microcirculação esplênica a hemácia muda de forma devido a presença de glicoproteínas na membrana do eritrócito; assim são removidas prematuramente da circulação causando anemia hemolítica 
EQUINÓCITOS: hemácias espiculadas com projeções regulares; ocorre em amostras velhas; excesso de EDTA; uremia; coagulação intravascular disseminada (CID)
ACANTÓCITOS: projeções irregulares e variadas; ocorre em cães com hiperbilirrubinemia; hemangiossarcoma ou hemangioma esplênico e doença hepática difusa; shunts portossistêmico; dietas ricas em colesterol
ESQUISÓCITOS: fragmentos irregulares das hemácias; ocorre em falha renal; mielofibrose; glomerulonefrite; deficiência crônica de ferro; fluxo sanguíneo turbulento
LEPTÓCITOS: aumento do diâmetro e diminuição da espessura; quando hipocrômico ocorre por produção reduzida de hemoglobina (anemia ferropriva); quando policrômico consistem em reticulócitos indicando regeneração; com ortocromia indicam arregeneração; aparência em alvo
DACRIÓCITOS: hemácias em forma de gota; ocorre por mielofibrose ou desordens mieloproliferativas
CRENAÇÃO: hemácias em forma de engrenagem, comum em bovinos; artefatos de técnica; desidratação 
COLORAÇÃO 
VERMELHO CLARO: normal no microscópio óptico
POLICROMASIA: presença de hemácias mais coradas (presença de RNA residual); representa os reticulócitos; aumento indica aumento da atividade eritropoietica e resposta a anemia regenerativa; algumas células policromáticas em cães e gatos é comum 
HIPOCROMIA: hemácias menos coradas e área central pálida e aumentada; indica quantidade insuficiente de hemoglobina na hemácia; deficiência de ferro 
OUTRAS ALTERAÇÕES 
CORPUSCULO DE HOWELL JOLLY: inclusão eritrocitária de restos celulares (núcleo); é uma resposta da medula óssea a anemia; uso de glicocorticoides em cães e diminuição da função esplênica 
METARRUBRICITOS: eritrócitos imaturos e nucleados; indicam anemia regenerativa; hemangiossarcomas ou doenças mieloproliferativas
CORPUSCULO DE HEINZ: estruturas redondas na membrana interna do eritrócito devido a desnaturação oxidativa da hemoglobina; normal em felinos até 50%; incomum em cães; pode ocorrer com o uso de glicocorticoides ou esplenectomizados 
RETICULÓCITOS: são eritrócitos imaturos; indicam boa resposta medular para a anemia 
PONTEADO BASOFILICO: hemácias com pequenos pontos basófilos no citoplasma; ocorre em eritropoiese intensa; intoxicação por chumbo se houver metarrubricitos sem anemia; e nas anemias de bovinos e ovinos
ROLEAUX: hemácias empilhadas; normal em equinos sadios e ocorre por desidratação/inflamação nas outras espécies; em equinos anêmicos ou caquéticos pode estar ausente; em ruminantes é raro em sadios e doentes
AGLUTINAÇÃO: aglomeração espontânea dos eritrócitos; ocorre em doenças autoimunes; transfusões incompatíveis; devido presença de anticorpos contra as hemácias 
PARASITAS: pode ocorrer dentro ou na superfície dos eritrócitos; Haemobartonella felis; H. canis; Anaplasma marginalis; Babesia equi; B. caballi; B. canis; Eperythrozoon suis e Cytauxzoon felis