RELATÓRIO MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE (MIA) - UNIP - MARIO DE SOUZA 05 09 2023

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP. 
CURSO DE FARMÁCIA. 
 
 
 
 
 
Mario de Souza freiras Junior. 
R.A 2344814. 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO 01. 
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE (MIA). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO II – ERCILIA. 
2023 
 
 
2 
 
Sumário. 
AULA 01 E ROTEIRO 01: ANÁLISE EM 
ESPECTROFOTÔMETRO. I. ESPECTRO DE 
ABSORÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRA 
DESCONHECIDA. ...................................................................................... 4 
 
AULA 01 E ROTEIRO 02: ANÁLISE EM 
ESPECTROFOTÔMETRO: II. CONSTRUÇÃO DA 
CURVA DE CALIBRAÇÃO. ...................................................................... 5 
 
ANÁLISE DO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)......................... 7 
 
AULA 01 E ROTEIRO 03: AVALIAÇÃO DA 
SELETIVIDADE DO MÉTODO 
ESPECTROFOTOMÉTRICO DE DOSAGEM DE 
ALARANJADO DE METILA. ................................................................... 8 
 
AULA 01 E ROTEIRO 04: AVALIAÇÃO DA PRECISÃO 
E EXATIDÃO DO MÉTODO 
ESPECTROFOTOMÉTRICO DE DOSAGEM DE 
ALARANJADO DE METILA. ................................................................... 9 
 
AULA 01 E ROTEIRO 05: ANÁLISE POR 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. I. 
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE ÁCIDO 
ACETILSALICÍLICO E PARACETAMOL. ......................................... 11 
 
AULA 01 E ROTEIRO 06: CROMATOGRAFIA EM 
CAMADA DELGADA (CCD): II. ANÁLISE 
CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS. ............................................. 12 
 
AULA 01 E ROTEIRO 07: ANÁLISE POR 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE TROCA IÔNICA. 
HEMOGLOBINA GLICADA EM AMOSTRA DE 
SANGUE. .................................................................................................... 13 
 
REFERÊNCIAS ......................................................................................... 14 
 
1° AULA, PERÍODO DA MANHÃ - ROTEIRO DO 01 AO 
05 ( 02/09/2023). .......................................................................................... 15 
 
2° AULA, PERÍODO DA TARDE - ROTEIRO DO 05 AO 
07 ( 02/09/2023). .......................................................................................... 16 
 
 
3 
 
INTRODUÇÃO. 
 O controle de qualidade dos medicamentos exige a 
identificação e a quantificação das substâncias químicas 
presentes em formas farmacêuticas terminadas (comprimido, 
cápsula, creme, pomada etc.) que contém o fármaco, com 
realização de análises químicas e físicas. Atualmente, boa parte 
das análise químicas realizadas em medicamentos e insumos 
ligados ao setor farmacêutico se constitui de métodos 
instrumentais, como os espectrométricos, baseados na interação 
das espécies químicas com a energia; e os cromatográficos e 
potencio métricos, baseados em outras características físico-
químicas, a citar, o potencial químico e interações promovidas 
pelas moléculas e íons onde esses equipamentos de elevada 
precisão e robustez, serão capazes de identificar e quantificar os 
componentes de interesse na forma farmacêutica ou no insumo 
empregado para a produção do medicamento. Além disso, os 
métodos instrumentais serão capazes de identificar e quantificar 
as eventuais impurezas presentes no medicamento. (NEVES, 
2020). 
 A validação de um método, segundo a ANVISA, é um 
processo contínuo que começa no planejamento da estratégia 
analítica e contínua ao longo de todo o seu desenvolvimento e 
transferência. Deve-se garantir, através de estudos 
experimentais, que o método atenda às exigências das 
aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos 
resultados. Contam com vários requisitos e atributos, os quais 
podemos citar: seletividade, precisão e exatidão. (PEREZ, 
2010),segundo o INMETRO, a validação de um método 
analítico consiste em fornecer uma evidência documentada, por 
meio de um processo onde se realizam estudos laboratoriais que 
comprovam que determinado procedimento é o adequado para a 
finalidade, o qual foi indicado. Em outras palavras, é a 
confirmação por testes e apresentação de evidências objetivas 
de que determinados requisitos são preenchidos para um dado 
intencional (ISO/IEC 17025). 
 A validação no laboratório realiza as etapas de validação em 
um só laboratório, validando um método novo ou revalidando 
outro existente. A validação completa consiste em realizar um 
estudo inter laboratorial, a partir de uma matriz que será 
analisada por diversos laboratórios a fim de se verificar a 
reprodutibilidade do método e a incerteza expandida, incluir 
todas as características de desempenho, para que, ao final a 
metodologia possa ser aceita como oficial. A estimativa da 
dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos 
de uma mesma amostra, em condições estabelecidas (RDC 
nº166/2017) é determinada Precisão. Já a exatidão é definida 
por tendência e representa o grau de concordância entre 
resultados individuais encontrados e um aceito como 
referência(SWART & KRULL, 11 12 1998) e, segundo a 
ANVISA, é a proximidade dos resultados obtidos pelo método 
 
4 
 
em estudo em relação ao valor verdadeiro. Seletividade é a 
capacidade de um método medir com exatidão um analito em 
presença de outros componentes (PEREZ, 2010). 
 Pode ser demonstrada comparando os resultados dos testes de 
amostras contendo interferentes e através de valores de uma 
amostra sem os interferentes, somente o analito. Os métodos 
instrumentais de análise tornaram-se um dos principais meios 
de obtenção de informações em diversas áreas da ciência e 
tecnologia. Fatores como a velocidade e alta sensibilidade para 
aquisição de dados, baixos limites de detecção, automação de 
instrumentos etc., quando comparados aos métodos clássicos de 
análise, justificam o interesse dos profissionais em diversas 
áreas, no emprego das técnicas instrumentais. Dessa forma, os 
profissionais e estudantes devem ter em sua formação a 
compreensão dos princípios fundamentais das diferentes 
técnicas, conhecimento dos instrumentos e suas aplicações. 
(NEVES, 2020) 
 
AULA 01 E ROTEIRO 01: ANÁLISE EM 
ESPECTROFOTÔMETRO. I. ESPECTRO DE 
ABSORÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRA 
DESCONHECIDA. 
 
Foi feita a varredura de absorbância no espectrofotômetro em 
diferentes comprimentos de onda para análise de solução de 
alaranjado de metila 4,0 mg/L. 
 
λ (nm) A (nm). 
400. 0,228. 
410. 0,260. 
420. 0.293. 
430. 0,320. 
440. 0,345. 
450. 0,366. 
460. 0,375. 
470. 0,366. 
480. 0,343. 
490. 0,300. 
500. 0,244 
510. 0,181. 
520. 0,118. 
530. 0,074. 
540. 0,043. 
550. 0,022. 
560. 0,011. 
 
 
 
5 
 
 
Analisando a tabela e o gráfico, obtemos o valor de λmax = 
460nm de comprimento de onda para a máxima absorbância 
0,375 para o alaranjado de metila 4,0 mg/L. 
 
PARTE II: Determinação da absorbância de amostras com 
concentração desconhecida de alaranjado de metila. 
 Após ser diluída a amostra de alaranjado de metila, ajustamos 
o comprimento de onda no espectrofotômetro correspondente à 
máxima absorção para o alaranjado de metila (λmax = 460nm ), 
definido após análise dos resultados da parte I, lemos o valor 
de absorbância: A = 1,785 
 
AULA 01 E ROTEIRO 02: ANÁLISE EM 
ESPECTROFOTÔMETRO: II. CONSTRUÇÃO DA 
CURVA DE CALIBRAÇÃO. 
Este experimento tem por objetivo construir a curva de 
calibração (concentração em função da absorbância) para a 
análise do alaranjado de metila por espectrofotometria. 
Foi feito o preparo do alaranjado de metila em várias 
concentrações através da solução de estoque com os seguintes 
cálculos: 
𝐶1. 𝑉1 = 𝐶2. 𝑉2 
10. 𝑉1 = 8.100 
𝑉1 = 8 × 100 = 𝑉1 = 80𝑚𝑙 
10 
𝐶1. 𝑉1 = 𝐶2. 𝑉2 
10. 𝑉1 = 2,5.100 
 
6 
 
𝑉1 = 2.5 × 100 = 𝑉1 = 25𝑚𝑙 
10 
𝐶1. 𝑉1 = 𝐶2. 𝑉2 
10. 𝑉1 = 5.100 
𝑉1 = 5 × 100 = 𝑉1 = 50𝑚𝑙 
10 
𝐶1. 𝑉1 = 𝐶2. 𝑉2 
10. 𝑉1 = 1.100 
𝑉1 = 1× 100 = 𝑉1 = 10𝑚𝑙 
10 
Concentração. V estoque (ml). 
1,0. 10ml. 
2,5. 25ml. 
5,0. 50ml. 
8,0. 80ml. 
 
Imagem 01: Amostras.Fonte: Autoria própria. 
Medimos a absorbância de todas as concentrações no 
espectrofotômetro com o comprimento de onda (λ) em 460nm: 
 
 
7 
 
Concentração (mg/l) Absorbância 
1,0. 10ml. 
2,5. 25ml. 
5,0. 50ml. 
8,0. 80ml. 
 
Curva de calibração para o alaranjado de metila, tendo 
absorbância em função da concentração. Determinação da 
equação da reta e coeficiente de correlação: 
𝐴𝑏𝑠 = × [𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑎𝑜] + 
 
1785 = 0,0933+ 0,0097 
 
ANÁLISE DO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO 
(r). 
 
 O valor calculado deverá estar próximo a 1,000, o que indica 
boa correlação entre a absorbância obtida no espectrofotômetro 
para as diferentes concentrações de alaranjado de metila. 
Segundo a RDC 166/2017, o método será considerado LINEAR 
quando apresentar r ≥ 0,990. 
 Com a equação de reta correspondente à calibração para as 
soluções de alaranjado de metila, efetuamos o cálculo do teor 
(concentração) dessa substância que estava presente na amostra 
desconhecida analisada na prática 1 (Parte 2). 
 
 
8 
 
AULA 01 E ROTEIRO 03: AVALIAÇÃO DA 
SELETIVIDADE DO MÉTODO 
ESPECTROFOTOMÉTRICO DE DOSAGEM DE 
ALARANJADO DE METILA. 
 Realizamos os ensaios de seletividade, precisão e exatidão 
para a validação parcial do método instrumental de 
quantificação do teor de alaranjado de metila em solução. 
 Parte I: Calculamos a massa a ser pesada de alaranjado de 
metila para a obtenção de 200 mL de solução de amostra na 
concentração 4,0 mg/L. Transferimos a solução de amostra 4,0 
mg/L para um frasco e rotulamos, indicando que se trata da 
solução de amostra preparada. 
𝑉 = 200𝑚𝑙 4 1000 
𝐶 = 4𝑚𝑔/𝑙 X 200 
𝑥 = 0,8𝑚𝑔 
 
Parte II: Ensaio de seletividade 
 
Tubo. Absorbância. 
A. A=0,250. 
B. AP= 0,284. 
 P= 0,331 
 
 
 AP - A 
% Recup = ---------------- .100 
 P 
AP-Concentração para amostra com adição do padrão de 
referência. 
A – Concentração para a amostra se m adição do padrão de 
referência. 
 P – Concentração do padrão de referência. 
No método de adição de padrão de padrão, os valores 
aceitos são entre 80% - 120% de recuperação para que o 
método possa ser considerado seletivo. 
 0,284 – 0,250 0,034. 
% Recup = -------------------- = ---------- = 0,103.100 = 10,27% 
 P = 0,331 0,331. 
 
% Recup = 10,27% - 100 = 89,73% 
 
 
9 
 
Através dos cálculos podemos afirmar que a avaliação da 
seletividade foi aprovada, pois a % de Recup – 89,73% 
está dentro do intervalo aceito. (80 a 120%). 
 
AULA 01 E ROTEIRO 04: AVALIAÇÃO DA 
PRECISÃO E EXATIDÃO DO MÉTODO 
ESPECTROFOTOMÉTRICO DE DOSAGEM DE 
ALARANJADO DE METILA. 
 
Solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) e a solução de 
referência de alaranjado de metila (10 mg/L) deverão ser 
preparados pelo técnico do laboratório dissolvendo a 
substancia em agua destilada. 
PARTE I: Ensaio de precisão e exatidão. 
 Cálculo do teor a 80 % da concentração de solução de 
alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L. Para essa 
analise o aluno deve efetuar uma diluição da solução de 
referencia (10mg/L) d e forma a se alcançar uma 
concentração igual a 3,2 mg/L. 
 
Replicata (80% da concentração). Absorbância (A). 
1. 0,179. 
2. 0,178. 
3. 0,181. 
Média. 0,538. 
Concentração (mg/l). 3,2mg/L 
Cálculo 1: teor de 80 % da concentração da solução 
de alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L 
 
C1 . V1 = C2 . V210 
V1 = 3,2 . 100 
V1 = 32 mL 
Cálculo do teor a 120% da concentração da solução de 
alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L. A 
amostra preparada pelo aluno (5,0 mg/L) será necessário 
efetuar uma diluição de da solução de referencia (10 
mg/L) de forma a alcançar uma concentração igual a 4,8 mg/L. 
 
Replicata (120% da 
concentração). 
Absorbância (A). 
1. 0,272. 
2. 0,269. 
3. 0,268. 
Média. 0,269. 
Concentração (mg/L). 4,8 mg/L 
 
Cálculo 2: teor de 100 % da concentração da solução de 
alaranjado de metila com concentração 4,0 mg/L. 
 
10 
 
C1 . V1 = C2 . V210 . 
V1 = 4 . 100 
V1 = 40 mL 
 
 Transferimos 40 mL da solução referência (10,0mg/L) para 
balão volumétrico de 100 mL e completamos o volume com 
água destilada. Após medimos três vezes (descartando e 
colocando novamente a solução na cubeta e fazendo o ajuste do 
zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 460 nm, 
utilizando água destilada para a juste do zero. Registramos as 
medidas de Absorbância (A) na tabela a seguir. 
 
Replicata (100% da concentração). Absorbância (A) 
1. 0,235. 
2. 0,234. 
3. 0,232. 
Média. 0,233. 
Concentração (mg/L). 4,0 mg/L 
 
Após a análise utilizamos os resultados para o cálculo da média, 
desvio padrão e coeficiente de variação no excel. Abaixo os 
resultados: 
 
Para 3,2 mg/L (80%). 
Valor 1. 0,179. 
Valor 2. 0,178. 
Valor 3. 0,181. 
Média. 0,179. 
Desvio Padrão. 0,002. 
Coeficiente de Variação. 0,852. 
 
 
Para 4,0 mg/L (100%). 
Valor 1. 0,235. 
Valor 2. 0,234. 
Valor 3. 0,232. 
Média. 0,234. 
Desvio Padrão. 0,002. 
Coeficiente de Variação. 0,654. 
 
 
 
Para 4,8 mg/L (120%). 
Valor 1. 0,272. 
Valor 2. 0,269. 
Valor 3. 0,268. 
Média. 0,27. 
Desvio Padrão. 0,002. 
Coeficiente de Variação. 0,772. 
 
11 
 
AULA 01 E ROTEIRO 05: ANÁLISE POR 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. I. 
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE ÁCIDO 
ACETILSALICÍLICO E PARACETAMOL. 
 
Análise cromatográfica de ácido acetilsalicílico e paracetamol. 
Esta aula tem como objetivo avaliar o princípio da separação de 
substâncias analgésicas por CCD e estudar a utilização de 
métodos cromatográficos para separar e analisar substâncias 
com base na sua estrutura química e fenómenos de absorção 
cromatográfica com exemplos de aspirina, paracetamol e 
Coristin D. 
 Parte 1: Preparação das amostras de analgésicos (técnico do 
laboratório) Transferimos para o béquer, previamente, a 
amostra triturada de ácido acetilsalicílico e paracetamol 
(substância a ser analisada). Foi colocado um béquer para cada 
amostra triturada Para obtenção dos resultados seguimos 
rigorosamente todo o procedimento descrito no roteiro. 
Parte 2: Análise cromatográfica O técnico deverá deixar 
preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de 
etila com 0,5% de ácido acético glacial). Deverá esperar 
tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. 
Manter a cuba coberta até o momento da análise. Para 
realizar o procedimento começamos cortando a placa de 
sílica e fazendo uma linha clara com duas marcas 
sinalizando o ponto de aplicação e o ponto final 
adicionamos 1 gota de amostra de paracetamol e 1 gota 
de ácido salicílico na linha e adicionamos cuidadosamente 
a placa de sílica na cuba por cerca de 30 minutos, 
retiramos da cuba e aguardamos secar, para que fosse 
possível a visualização tivemos que usar a lâmpada UV 
usando óculos e todas as proteções necessários e nunca 
focando a luz em sua direção, evitando acidentes, quanto 
menos exposto a luz melhor, marcamos com um lápis 
onde parava cada ponto do analgésico na placa de silica e 
com a régua mensuramos a distância de cada ponto para 
calcular o valor de Rf, a migração do solvente foi de 7 ,3 
e os valores Rfs obtidos foram os seguintes: 
 
Molécula. Rf. 
Paracetamol. 0,497. 
Ácido Acetilsalicílico. 0,667. 
 
• Rf = 2,3 / (PT) 4,8 = 0,479 comprimido. 
• Rf = 3,2 / (AAS) 4,8 = 0,6667 comprimido. 
• Paracetamol padrão = 2,3/4,8 = 0,479. 
•Paracetamol amostra = 2,3/4,8 = 0,479. 
• AAS padrão = 3,2/4,8 = 0,6666. 
• AAS amostra = 3,2/4,8 = 0,6666. 
 
12 
 
 
Imagem 01: Fórmula Paracetamol. 
 
 
Imagem 02: Ácido Acetilsalicílico. 
 
 
 
 
AULA 01 E ROTEIRO 06: CROMATOGRAFIA EM 
CAMADA DELGADA (CCD): II. ANÁLISE 
CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS. 
 
Parte 1: O extrato foi preparado pelo técnico de 
laboratório (os alunos a iniciaram a partir da etapa 
8)dividimos e descartamos a fase aquosa no béquer, 
transferimos a fase orgânica para um Erlenmeyer e adicionamos 
2 g de sulfato de sódio anidro, deixando repousar, filtramos 
o extrato em um béquer aquecendo com uma manta até o 
volume de 1 ml. 
 Parte 2: Análise cromatográfica, o hexano com 5% de 
acetona, já havia sido preparado pelo técnico, a partir daí 
nos alunos efetuamos as marcações na placa de sílica 
indicando os pontos de marcação da amostra e a ponta do 
final a corrida, com auxilio de um capilar aplicamos na 
placa de silico uma gota de cada extrato concentrado do 
pimentão (verde, amarelo, vermelho) em posições diferentes, 
levamos cuidadosamente a placa na cuba e aguardamos até 
que o solvente atinja a segunda marcação no topo da 
placa, removemos da cuba e deixamos secar por 
 
13 
 
aproximadamente 10 minutos e observamos as manchas 
coloridas formadas, medimos com auxilio de uma régua e 
os resultados se deu da seguinte forma: 
 Migração só solvente 5,8 cm, pimentão amarelo 3 ,8 cm, 
pimentão vermelho 3,9 cm, pimentão verde 3,9 cm. 
Figura 3 -Cromatrogafia em camada delcada (CCD). 
 
 
 
Cálculos: 
 Rf. Verde =3,9 Rf. Amarelo =3,8 Rf. 
Vermelho =2,5 5,8 5,8 
5,8 
 Análise o resultado da CCD e indique qual a molécula 
presente em cada mancha cromato gráfica obtida. Molécula 
caroteno mancha amarela, criptoxantina mancha verde, 
capsantina mancha vermelha. Assim ficou a Relação da 
molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha: 
 
Molécula. Rf. 
Caroteno. 0,655. 
Capsantina. 0,431. 
Criptoxantina. 0,655. 
 
AULA 01 E ROTEIRO 07: ANÁLISE POR 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE TROCA 
IÔNICA. HEMOGLOBINA GLICADA EM 
AMOSTRA DE SANGUE. 
 
PARTE 1: Preparação da amostra de hemolisado (executado 
pelo(a) técnico(a) 
do laboratório). 
Parte II: Separamos 4 tubos, sendo dois com tampa cinza 
e nomeamos como T1 e P1e dois tubos com tampa 
vermelha e nomeamos como T2 e P2. 
 No tubo T1 adicionamos com auxílio de uma pipeta 
20µL hemoglobina teste (sangue) e no tuboP1 
adicionamos 20µL com auxílio de uma pipeta 
 
14 
 
hemoderivado padrão, após homogeneizamos e colocamos 
na centrifuga por 5 min. 
 No tubo T2 adicionamos 100µL de hemolisado teste e 
no tubo P2 adicionamos 100µL de padrão, 
homogeneizamos e levamos para centrifuga por 5 min. Após 
os 5 min fizemos a leitura da absorbância de 415nm 
no espectrofotômetro para cada amostra, calibrando com 
uma cubeta contendo água. 
Os resultados foram: T1- 0,740; P1- 0,240; T2- 0,339; 
P2- 0,297. Após efetuamos o cálculo de hemoglobina 
glicada na amostra de sangue, que foi igual a 27,25, ou 
seja um valor alto, pois o valor de referência é de 5,3% a 8,0%. 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
1. Perez M.A.F. Validação de métodos 
analíticos: como fazer Por que ela é 
importante Boletim de tecnologia e 
desenvolvimento de embalagens- ITA 2, nº 
3,2010. 
 
2. Neves, LCM. Métodos instrumentais de 
análises. São Paulo. Editora Sol,2020,84p. 
 
3. Silva C B,et.al. Desafios ao controle da 
qualidade de medicamentos no Brasil Cad.Saúde 
Colet., 2017, Rio de Janeiro, 25 (3): 362-370. 
 
4. Filho, B. H, et.al. Espectrofotometria no 
ultravioleta e visível. 2010. Universidade de São 
Paulo. São Paulo, 2010. 
 
6. Serafim F. A. T. O papel da cromatografia no 
controle de qualidade, conformidade e na 
rastreabilidade das aguardentes. Scientia 
Chromatographica 2018; 10(4):230-242. 
Disponível em: http://dx.doi.org/10.5935/sc.2019.002 
 
 
15 
 
1° AULA, PERÍODO DA MANHÃ - ROTEIRO DO 01 AO 05 ( 02/09/2023). 
 
 
16 
 
2° AULA, PERÍODO DA TARDE - ROTEIRO DO 05 AO 07 ( 02/09/2023).