guia de cuidados e operação com o equipamento

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HPLC 
GUIA DE OPERAÇÃO E CUIDADOS COM O EQUIPAMENTO 
 
 
GRACE KELLI PEREIRA 
 
 
 
 
 
 
 
Av. barão do bananal, 2381 
Ribeirão preto – SP 
www.insolution.com.br 
contato@insolution.com.br 
 
 
 
 3 
 
ÍNDICE 
 
1. OVERVIEW DO EQUIPAMENTO 4 
2. FASE MÓVEL 6 
3. DESGASEIFICADOR 11 
4. BOMBA 12 
5. INJETOR 13 
6. PREPARO DE AMOSTRA PARA INJEÇÃO 18 
7. COLUNA CROMATOGRÁFICA 19 
8. DETECTORES 21 
9. PREPARAÇÃO DO SISTEMA PARA ANÁLISE 23 
10. DESLIGANDO O EQUIPAMENTO 26 
11. VAZAMENTOS E ENTUPIMENTOS 27 
12. MANUTENÇÃO PREVENTIVA 28 
13. PROBLEMAS ANALÍTICOS E SUAS POSSÍVEIS CAUSAS 28 
ANEXO I – PRINCIPAIS PARÂMETROS DE UM MÉTODO DE HPLC/UV/DAD 30 
ANEXO II – CÁLCULOS BÁSICOS 31 
 
 
 
 
 
 
 4 
1. OVERVIEW DO EQUIPAMENTO 
 
Um equipamento de HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) pode ter várias 
configurações, podendo ser composto por um único bloco ou por vários módulos, o que 
depende do fabricante, mas todos eles têm em comum os seguintes componentes: 
 
- linhas de fase móvel, normalmente identificadas como linha A, B, C ou D, que podem 
estar acopladas a um desgaseificador automático; 
- bomba(s) de alta pressão, 
- injetor, que pode ser manual ou automático; 
- coluna, que pode ou não estar dentro de um forno; 
- detector; 
- descarte; 
- registrador (computador e software); 
- medidor de pressão 
 
A quantidade de bombas de um sistema HPLC varia de acordo com a configuração do 
equipamento. Existem equipamentos onde uma única bomba controla várias linhas de fase 
móvel (Figura 1) e outros equipamentos com um conjunto de bombas onde cada bomba 
controla uma única linha de fase móvel (Figura 2). Em ambos os casos, existe um 
dispositivo chamado mixer, que faz a mistura dos solventes na proporção da fase móvel 
estabelecida no método. 
 
 
 
 
 
Figura 1: Quando uma única bomba controla várias linhas de fase móvel. Sistema 
conhecido como “sistema gradiente de baixa pressão” 
 5 
 
 
 
 
 
Figura 2: Quando cada bomba controla uma única linha de fase móvel. Sistema 
conhecido como “sistema gradiente de alta pressão” 
 
 
 
 
Detectores que não destroem a amostra, como por exemplo o detector de UV e DAD, 
podem ser acoplados em série a um outro detector, como o espectrômetro de massas (MS), 
aumentado o poder de identificação dos compostos da amostra. 
 
 
 
A espectrometria de massas se torna cada dia mais popular em laboratórios de controle de 
qualidade e diagnóstico, especialmente na área farmacêutica, de alimentos e ambiental. A 
Figura 3 mostra um exemplo de um equipamento HPLC/UV/MS. 
 
 
 
 
 
 6 
 
 
Figura 3: Um exemplo de equipamento HPLC modular, com sistema gradiente de alta 
pressão configurado com duas bombas, desgaseificador, injetor automático, detector UV e 
detector de massas (MS) acoplados em série. Note que nessa configuração de equipamento 
não há forno de coluna. 
 
 
2. FASE MÓVEL: 
 
A fase móvel pode ser um solvente puro, uma mistura de solventes, um tampão, uma 
solução ácida ou básica. A composição da fase móvel é determinada na etapa de 
desenvolvimento do método e ela está diretamente relacionada com o tempo de retenção 
dos compostos (analitos). 
 
 
IMPORTANTE: Qualquer mudança na composição da fase móvel vai causar 
alteração no tempo de retenção dos analitos. 
 
 
Todos os solventes que compõem a fase móvel devem ser miscíveis. O gráfico da Figura 4 
mostra a miscibilidade entre solventes. 
 
 
 
 7 
 
 
 
 
Figura 4: Gráfico de miscibilidade entre solventes 
 
 
 
 
 
 
 
 8 
CUIDADO: Quando a fase móvel é composta por uma mistura de solventes, a 
medida do volume de cada solvente deve ser feita com proveta, nunca com 
béquer. 
 
 
 
Os solventes ou soluções da fase móvel são armazenados, preferencialmente, em um frasco 
de vidro (Figura 5) com um furo na tampa para a passagem da linha (tubulação de teflon). 
 
 
 
 
Figura 5: Exemplo de frasco para a fase móvel, 
com a tampa furada para a passagem da linha. 
 
 
 
Normalmente, cada linha vem com uma marca (A, B, C ou D) para o analista relacionar a 
linha com a fase móvel. Por isso, é importante etiquetar o frasco com o nome da fase 
móvel e anotar em seu caderno de laboratório em qual linha cada frasco está. 
 
 
 
CUIDADO: Trocar as linhas é um erro muito comum, que provoca mudança na 
composição da fase móvel e, consequentemente, um deslocamento do tempo de 
retenção dos compostos, especialmente indesejado em análises quantitativas ou de 
rotina em laboratórios de controle de qualidade. 
 
 
 
 
 9 
DICA: Procure usar sempre a mesma linha para o mesmo solvente. Por exemplo, 
usar a água sempre na linha A e, de preferência, no mesmo frasco. 
 
 
IMPORTANTE: Manipule solventes dentro de uma capela de fluxo laminar, pois 
a maioria dos solventes são tóxicos. 
 
 
LEMBRE-SE: Use EPIs adequadas como luvas, óculos de segurança, avental 
abaixo do joelho, calça comprida, sapato fechado e cabelo preso, se for o caso. Não 
se esqueça da sua segurança. 
 
 
 
Na extremidade de cada linha da fase móvel é acoplado um filtro de sucção, mostrado na 
Figura 6. 
 
 
 
 
Figura 6: Exemplo de filtros de sucção de 
fase móvel, em diferentes linhas. 
 
 
 
CUIDADO: Não tocar o filtro de sucção com as mãos para não contaminar a fase 
móvel. 
 
 
 
IMPORTANTE: O filtro de sucção deve estar completamente mergulhado na 
fase móvel sempre que a bomba estiver ligada. Se o filtro sair do líquido entrará ar 
no sistema. 
 
 
 
 
 10 
DICA: Quando você for trocar ou repor a fase móvel, embrulhar o filtro de sucção 
em papel alumínio ou mergulhá-lo em um béquer com o mesmo solvente. 
 
 
 
Se a fase móvel for composta por água e for utilizada água do tipo Milli-Q (ultra pura), a 
coleta da água deve ser fresca, logo antes da análise. 
 
 
 
CUIDADO: Água funga, por isso pegar água Milli-Q fresca todos os dias e não 
deixar água parada no frasco, na bomba ou na coluna por vários dias. 
 
 
 
IMPORTANTE: Verificar se as membranas do sistema milli-Q estão dentro do 
prazo de validade e de acordo com a especificação desejada (Resistividade 18 
megaohm e Teor de orgânico < 20 ppb). O sistema Milli-Q deve ser submetido a 
manutenções preventivas assim como o HPLC. Os maiores problemas observados 
em separações cromatográficas, principalmente falta de sensibilidade e ruído na 
linha de base do cromatograma são causados pela água. 
 
 
Pode-se usar, ao invés de água do tipo Milli-Q, água grau HPLC, o que não é muito 
comum devido ao seu alto custo. 
 
 
Todos os solventes orgânicos usados como fase móvel, devem ser grau HPLC. A pureza 
do solvente é crítica para a análise, pois evita problemas de ruído de linha de base e falta de 
sensibilidade, além de preservar o tempo de vida da coluna e das peças do equipamento 
(pistões, selos, check valves, etc). 
 
 
 
DICA: Comprar solventes de marca estabelecida no mercado. 
 
 
NOTA: A princípio, não há necessidade de filtrar solventes grau HPLC. Porém, 
alguns laboratórios adotam a rotina de filtrar os solventes da fase móvel, mesmo 
sendo grau HPLC. Neste caso, utiliza-se um sistema de filtração a vácuo com 
membrana (Figura 7). 
 
 
 
 11 
 
 
 
 
 
membrana 
Figura 7: Sistema de filtração de solvente à vácuo e membrana de filtração, que deve ser 
escolhida de acordo com o solvente (hidrofílico ou hidrofóbico). 
 
 
 
3. DESGASEIFICADOR: 
 
A fase móvel deve ser desgaseificada antes de entrar na bomba. A função da desgaseificação 
é eliminar pequenas bolhas de ar. A grande maioria dos equipamentos têm um 
desgaseificador automático, que funciona através de membranas (Figura 8). 
 
 
 
 
Figura 8: Exemplo de um desgaseificador automático. 
 12 
Se o equipamento não tiver um desgaseificador automático, pode-se sonicar a fase móvel 
em banho de ultrassom por 5 a 10 minutos antes de levá-la para o equipamento. Pode-se 
também usar um sistema de borbulhamento contínuo de gás hélio. 
 
 
 
4. BOMBA: 
 
A bomba leva a fase móvel atravésde todo o sistema, passando pelo injetor, coluna e 
detector até ser descartada em um frasco coletor, normalmente chamado de descarte. 
Durante a análise a bomba estará sempre ligada. 
 
 
 
DICA: Colocar o frasco de descarte dentro de uma bandeja, pois em caso de 
vazamento, o líquido não vai ser espalhado pelo chão. 
 
 
IMPORTANTE; O solvente do descarte deve ser etiquetado e encaminhado para 
o respectivo tratamento de resíduo. Cada solvente tem um tratamento e existem 
empresas especializadas para isso. 
 
 
 
 
Toda bomba de HPLC deve ser capaz de 
produzir fluxo constante e reprodutível e ser 
resistente a fase móvel utilizada, muitas vezes 
ácida ou básica, além de aguentar as altas 
pressões decorrentes da análise. 
 
 
 
 
O fluxo da bomba, ou seja, o fluxo da fase móvel, ou ainda, o fluxo da análise depende do 
tamanho da partícula e do diâmetro interno da coluna que está sendo utilizada. O fluxo é 
determinado na etapa de desenvolvimento do método, sendo um parâmetro importante, 
que deve ser anotado no POP (Procedimento Operacional Padrão) do método, pois 
variação no fluxo causa deslocamento no tempo de retenção dos analitos. 
 
 13 
 
Um POP (Procedimento Operacional Padrão) é 
um arquivo com a descrição detalhada de um 
método ou um procedimento, que é gerado pelo 
analista que desenvolveu o método e seguido pelo 
analista da rotina. O anexo I mostra um modelo de 
POP contendo todos os parâmetros importantes 
em um método de HPLC com detector UV/DAD. 
Quando um outro detector for utilizado substituir 
pelas informações mais importantes desse detector. 
 
 
 
IMPORTANTE: Sempre que a fase móvel for reposta ou sempre que o filtro de 
sucção sair do líquido da fase móvel, a linha deverá ser purgada (ver item 9.4). Em 
um sistema HPLC nunca se deve entrar bolhas de ar. 
 
 
!!!!!! CUIDADO !!!!!!! Quando for utilizado TAMPÃO na fase móvel, SEMPRE 
tirar o tampão do sistema depois das análises, para não correr o risco do tampão 
precipitar sais nos cabeçotes da bomba, o que vai travar o seu sistema, ser 
necessário limpeza e até mesmo a troca de peças, que são, na maioria das vezes, 
muito caras e dependendo do fabricante, o tempo de importação dessas peças 
pode ser muito demorado, ou seja, não deixar solução tampão parada de um dia 
para o outro no seu equipamento. NUNCA tirar o tampão com solvente orgânico 
100% (p.e metanol ou acetonitrila), pois ao primeiro sinal do solvente orgânico o 
tampão automaticamente precipitará nas tubulações e na coluna. Para retirar o 
tampão, passar água pelo sistema, por pelo menos 15 min (esse tempo depende do 
comprimento e diâmetro interno da coluna, se for uma coluna de 30 cm deixar um 
tempo maior). Após retirar o tampão com a água, aí sim você poderá passar 
solvente orgânico 100 % para limpar as linhas e a coluna. 
 
 
 
5. INJETOR: 
 
O injetor pode ser manual ou automático. Em ambos os casos é utilizado uma válvula de 
injeção com posição load e inject e um loop de amostragem (Figura 9). Na posição load a 
amostra é carregada no loop, onde fica armazenada até o momento da injeção, quando a 
válvula é girada para a posição inject, conforme mostra a Figura 10. 
 
 14 
 
Figura 9: Válvula de injeção com 
 loop (ou alça) de amostragem. 
 
 
 
 
 
Figura 10: Funcionamento de uma válvula de injeção de 6 vias. Na posição load a válvula 
está na posição 1-6, nessa posição a amostra é injetada através de uma seringa e preenche o 
loop de amostragem, o excesso vai para o lixo. Quando a válvula é girada (manualmente 
ou automaticamente) a válvula muda para a posição 1-2 (inject), mudando o caminho da 
fase móvel, que agora pega a amostra no loop e a arrasta para a coluna. O cromatograma 
começa a ser registrado a partir do giro da válvula para a posição inject (start da análise) e o 
tempo de retenção dos compostos é o tempo que a amostra demora do start até chegar no 
detector. Perceba que na posição load a fase móvel vinda da bomba vai direto para a 
coluna, ou seja, a bomba nunca para de funcionar durante a análise, o fluxo é contínuo. 
 
 15 
CUIDADO: A ponta da seringa de injeção de HPLC é diferente da ponta da 
seringa de injeção de GC (cromatografia a gás), conforme mostra a Figura 11. 
Usar uma seringa de GC em HPLC pode danificar a váluva de injeção e causar 
vazamento. 
 
 
 
 
Figura 11: Diferença entre as seringas de injeção de HPLC e GC. 
 
 
O volume de injeção também é um parâmetro do método e deve ser anotado no POP 
(Procedimento Operacional Padrão). Normalmente em HPLC o volume de injeção varia 
entre 10 e 50 µL. 
 
 
DICA: É melhor injetar um volume menor de uma amostra mais concentrada 
do que um volume maior de uma amostra menos concentrada, para evitar 
alargamento indesejado da banda (pico cromatográfico). Quanto menor o 
volume de injeção, maior a resolução do pico. 
 
 
 
5.1. INJETOR MANUAL 
 
No caso do injetor manual, tanto o preenchimento da amostra no loop, quanto o giro da 
válvula para o start da análise são feitos manualmente, pelo analista. 
 
A limpeza da seringa de injeção e a limpeza do loop após a injeção da amostra também 
deve ser feita manualmente pelo analista. 
 
 16 
CUIDADO: Esquecer de fazer a limpeza entre as injeções ou usar solvente de 
lavagem inadequado pode causar problemas de contaminação entre uma amostra e 
outra, o que é chamado de carry over (quando resquícios da amostra anterior se 
soma à amostra posterior, o que pode ser um problema para análises quantitativas, 
pois altera a área do pico). A escolha da composição do solvente de lavagem deve 
ser estabelecida no desenvolvimento do método e depende do tipo de amostra que 
se está analisando. 
 
 
 
5.2. INJETOR AUTOMÁTICO 
 
No caso de injetor automático, a amostra é colocada em um vial que é levado ao rack do 
injetor, que pode ter a temperatura controlada ou não. A sequência de injeção é estipulada 
via software. A Figura 12 apresenta alguns tipos de vials. Normalmente utiliza-se vidro 
amber (mais escuro) para amostras que degradam com a luz, se não for ocaso pode-se usar 
vidro transparente, ambos são fechados com uma tampa contendo um septo (que pode ser 
substituído futuramente por outro septo). 
 
Quando a concentração da amostra é muito baixa e ela precisa ser ressuspendida em um 
volume pequeno existe a opção de colocar inserts dentro do vial, que normalmente tem 
um formato de cone e também é de vidro. 
 
 
 
 
 
 
Figura 12: Exemplos de vials e inserts usados em injetores automáticos. 
Os vials com as amostras são colocados no rack do injetor, que pode 
ser retangular ou redondo. 
 
 17 
Os vials com as amostras são colocados no rack do injetor automático (Figura 13), onde 
permanecerão até o momento da injeção, determinada pela sequência de injeção 
programada pelo analista no software. 
 
 
IMPORTANTE: Anotar o nome da amostra no vial e a posição onde esse vial 
foi colocado no rack. 
 
 
 
 
 
Figura 13: Exemplos de injetores automáticos. Os vials com as amostras são colocados no 
rack do injetor, que pode ser retangular ou redondo. 
 
 
Assim como no injetor manual, no injetor automático também é necessário limpar o loop 
e a seringa de injeção entre uma análise e outra. O solvente de lavagem do injetor 
automático deve ser colocado em um frasco semelhante ao frasco da fase móvel, com uma 
linha e filtro de sucção, que também deve ser purgada para eliminação de bolhas (ver item 
9.4). 
 
 
IMPORTANTE: Bolhas na seringa de injeção pode causar falta de 
reprodutibilidade entre análises, o que é crítico para análises quantitativas. 
 
 
A escolha da composição do solvente de lavagem deve ser estabelecida no desenvolvimento 
do método, pois depende do tipo de amostra que se está analisando. 
 
Injetores automáticos podem ter controle de temperatura para preservar a amostra, 
normalmente a temperaturas baixas (p.e 4 oC), especialmente útil para amostras biológicas 
(plasma, urina, etc.). 
 18 
6. PREPARO DA AMOSTRA PARA INJEÇÃO 
 
É muito importante quea amostra injetada no HPLC seja uma solução cristalina, sem 
partículas suspensas. Assim, é necessário filtrar a amostra. Normalmente utiliza-se um 
filtro em disco, conforme mostrado na Figura 14. O filtro pode ser de 0,22 µm ou 0,45 
µm mesh. 
 
 
 
 
Figura 14: Exemplo de filtração da amostra. (A) uma amostra de café centrifugada. (B) O 
sobrenadante da centrifugação é adicionado em uma seringa com o filtro acoplado na 
ponta. (C) pressiona-se o êmbolo da seringa resultando na filtração da amostra, que pode 
ser feita diretamente no vial que vai para o HPLC. (D) á esquerda a amostra filtrada 
(límpida e cristalina), à direita a amostra antes da filtração (turva). 
 
 
 19 
 
Se o preparo da amostra for feito por SPE (extração 
em fase sólida) não é necessário filtrar a amostra 
conforme mostrado acima, pois a SPE é em si uma 
filtração onde a amostra sai cristalina. 
 
 
 
 
 
7. COLUNA CROMATOGRÁFICA: 
 
A coluna cromatográfica é o coração do sistema, onde ocorre a separação dos compostos da 
amostra. 
 
A coluna pode estar dentro de um forno com controle de temperatura, o que é bastante 
indicado, pois a temperatura pode afetar o tempo de retenção dos compostos. 
 
CUIDADO: A coluna tem uma direção de fluxo, determinada no processo de 
empacotamento da fase estacionária dentro do tubo da coluna. A direção do fluxo 
da fase móvel, ou seja, por onde entra e por onde sai a fase móvel, sempre vem 
marcada com uma seta (flow) (Figura 15) 
 
 
 
Figura 15: A direção do fluxo da fase móvel vem marcada na coluna com uma seta (flow). 
Na entrada da coluna conecta-se a tubulação da saída do injetor e na saída da coluna 
conecta-se a tubulação que vai para a entrada do detector. 
 
 20 
 IMPORTANTE: A fase estacionária de uma coluna de HPLC sempre é 
empacotada dentro do tubo junto com um líquido. A coluna vem do fabricante 
com as extremidades fechadas, normalmente com conectores de peek (Figura 15). 
A coluna sempre deve ficar fechada para que a fase estacionária não seque. Se a fase 
estacionária secar a coluna pode morrer. 
 
DICA: Quando você instalar a coluna no equipamento, colocar os conectores que 
fecham as extremidades da coluna dentro da caixa da coluna, pois é muito comum 
que eles se percam. 
 
 
Para saber em qual solvente a coluna foi empacotada basta ler a ficha de informação da 
coluna, também chamada de “bula”, que normalmente vem na caixa junto com a coluna. 
A “bula” também traz informações de como ativar a coluna para o seu uso pela primeira 
vez. É bastante recomendado que você leia essas informações antes de começar a trabalhar 
com qualquer coluna. Se a coluna não trouxer a bula, essas informações devem constar no 
site do fabricante. 
 
A escolha da coluna é determinada na etapa de desenvolvimento do método. A coluna 
mais usada em HPLC é a coluna de fase reversa C18. 
 
É muito comum a utilização de uma pré-coluna antes da coluna cromatográfica. A pré-
coluna serve como um filtro que ajuda a preservar e aumentar o tempo de vida da coluna. 
Normalmente, a pré-coluna tem a mesma fase estacionária que a coluna, em um pequeno 
disco (Figura 16). 
 
 
 
 
Figura 16: Exemplos de pré-coluna. 
 21 
 IMPORTANTE: Anotar em seu caderno de laboratório, ou no POP do método, 
qual a fase estacionária da coluna e da pré-coluna, o tamanho da partícula, o nome 
do fabricante, o lote e a data de instalação. Alguns laboratórios adotam a rotina de 
contabilizar o número de injeções realizadas na coluna. 
 
 
CUIDADO: Sempre que a coluna for trocada o método deve ser revalidado, pois 
uma outra coluna, mesmo que da mesma fase, do mesmo fabricante e de um 
mesmo lote, vai apresentar variações no tempo de retenção dos compostos. Por isso, 
toda troca de coluna tem que ser reportada e o método revalidado. 
 
 
8. DETECTORES: 
 
8.1. UV e DAD 
 
Vários tipos de detectores podem ser usados em HPLC, como por exemplo ultravioleta 
(UV), diode array (DAD), fluorescência (FL), eletroquímico (EC), índice de refração (IR), 
espectrômetro de massas (MS), entre outros. Cada detector tem suas características, modos 
de utilização e cuidados específicos. 
 
O maior problema que se pode ter com o detector UV ou DAD é a presença de bolhas na 
célula de detecção, o que pode causar falta de sensibilidade, desaparecimento de picos e 
problemas de linha de base. 
 
Não há necessidade de nenhum preparo especial para o detector UV ou DAD, somente 
ligar as lâmpadas antes da análise. O equipamento indica quando a lâmpada está pronta 
para o uso. 
 
Os detectores UV e DAD são compatíveis com eluição gradiente e não destroem a amostra. 
Assim, é possível acoplar a saída do UV ou DAD a um outro detector, como por exemplo 
um espectrômetro de massas (MS). 
 
 
 
 
 
 22 
8.2. MS 
 
Equipamentos de HPLC acoplados a espectrometria de massas, também chamados de 
LC/MS estão se tornando cada vez mais populares em laboratórios de controle de 
qualidade e diagnóstico. 
 
É importante ressaltar que a espectrometria de massas é uma técnica à parte, ou seja, ela 
não necessita estar acoplada à cromatografia. É também uma técnica muito complexa pois 
existem várias formas de ionização e vários tipos de analisadores de massas (de baixa e alta 
resolução). 
 
Quando acoplada à cromatografia líquida é necessário uma série de cuidados especiais, 
começando pela fase móvel, que deve ser necessariamente de cromatografia de fase reversa 
(com água na sua composição) e volátil, incluindo tampões, fases ácidas ou básicas. Os 
ácidos voláteis mais usados são o ácido acético, ácido fórmico e ácido trifluoroacético. A 
base volátil mais utilizada é hidróxido de amônio e o tampão é o acetato de amônio. 
 
 
 
CUIDADO: Quando um HPLC que já opera com detector UV é acoplado ao 
MS, o método deve ser revisto e adaptado para a espectrometria de massas. Por 
exemplo, se um método de UV usa como fase móvel tampão fosfato (o que é 
muito comum para resolver problemas de assimetria de pico) quando adaptado 
para MS o tampão deve ser trocado por acetato de amônio (volátil), pois o tampão 
fosfato não é volátil e precipita na fonte de ionização, causando muitos problemas 
e até mesmo perda de peças. 
 
 
 
Outro fator importante é o fluxo da fase móvel, que deve ser entre 0,2 e 0,5 mL/min. 
Assim, se for usado uma coluna típica de HPLC com diâmetro interno de 4,6 mmID que 
opera com fluxo entre 1,0 e 1,5 mL/min, o fluxo deve ser dividido com um splitter 
(divisor de fluxo). 
 
 
 
DICA: Comprar colunas compatíveis com MS, com diâmetro interno de 
2,1 mm ID, que operam com fluxo de 0,2 mL/min sem necessidade de splitter. 
 
 
 
 
 
 
 23 
9. PREPARAÇÃO DO SISTEMA PARA ANÁLISE: 
 
9.1. LIGAR O EQUIPAMENT0 
 
Ligar o equipamento segundo a recomendação do fabricante. Alguns equipamentos 
apresentam uma ordem para ligar os módulos (bomba, injetor, forno, detector, 
controladora, etc). Assim, verificar no manual do equipamento, ou direto com o fabricante 
qual se existe uma ordem para ligar e desligar o equipamento. 
 
 
9.2. ABRIR O SOFTWARE E O MÉTODO 
 
Ligar o computador e abrir o software. O software varia de fabricante para fabricante. 
Você precisará receber um treinamento de software, o que não será muito difícil se você 
entender como a técnica funciona e quais são os parâmetros importantes no método (ver 
Anexo I). 
 
 
9.3. PREPARO DA FASE MÓVEL 
 
Preparar a fase móvel de acordo com o método e colocá-la no(s) frasco(s), cada qual em 
sua linha (A, B, C ou D). Cuidado para não trocar as linhas. 
 
 
9.4. PURGA DAS LINHAS DA BOMBA E DO INJETOR 
 
Purgar todas as linhas da fase móvel. A purga pode ser manual ou automática (realizada via 
software). 
 
 
IMPORTANTE: Quando a purga for manual é necessário abrir a válvula da 
purga e dar o comando na bomba para o início da purga. Você só deve parar a 
purga quando não for observado nenhum sinal de bolhas nas tubulações. As bolhas 
são visíveis e o analista deve monitorá-las durante a purga. Após a purga, énecessário fechar a válvula, senão a fase móvel não entra no sistema e não há 
separação cromatográfica. 
 
 
 
 24 
No caso de injetor automático, é necessário purgar também o solvente de limpeza do 
injetor. Normalmente, a purga é feita via software e não há necessidade de abrir nenhuma 
válvula. 
 
No caso de injetor manual, limpar o loop de amostragem manualmente com solvente de 
limpeza adequado, através de uma seringa, conforme mencionado no item 5.1. 
 
 
 
9.5. INSTALAÇÃO E CONDICIONAMENTO DA COLUNA 
 
 
- Verificar a direção do fluxo da coluna (vem anotado com uma seta) 
 
- Ligar a bomba com fluxo baixo (por exemplo 0,1 ou 0,2 mL/min) 
 
- Instalar a coluna colocando a tubulação da fase móvel que vem da saída do injetor na 
entrada na coluna (ou pré-coluna se for o caso), de acordo com o sentido do fluxo. 
 
 
DICA: acoplar primeiro a entrada da coluna mantendo a saída da coluna 
aberta. Quando o líquido sair pela extremidade aberta, conectar a tubulação 
na saída da coluna. Se houver pequenas bolhas na coluna elas sairão usando 
esse procedimento. 
 
 
- Aumentar o fluxo da bomba gradativamente até o fluxo da análise estipulado no 
desenvolvimento do método. Observar a pressão, ela vai variar até que todo o corpo da 
coluna fique com a composição da fase móvel desejada, quando isso acontecer a pressão 
estabilizará. Deixar a coluna condicionar pelo tempo requerido (o tempo de 
condicionamento varia de acordo com as especificações da coluna), o que varia entre 15 
e 25 minutos. 
 
 
IMPORTANTE: O monitoramento da pressão é muito importante, pois a 
pressão revela se existe algo errado com o sistema, como por exemplo um 
vazamento, um entupimento. Todo HPLC tem um medidor de pressão. 
Quando estipulada uma fase móvel e a coluna estiver condicionada, a pressão 
deve ser estável, sem grandes variações. Se a pressão não estabilizar, NÃO 
comece a análise, procure pelo problema. 
 
 
 
 
 25 
 
 
Quando a coluna for nova, ou seja, estiver sendo 
usada pela primeira vez, antes de condicioná-la 
com a fase móvel do método, é necessário ativar a 
fase estacionária. Se for uma coluna de fase reversa, 
a ativação da coluna pode ser feita passando-se 
100 % de solvente orgânico, por 15 a 20 min. É 
sempre indicado que você procure essa informação 
com o fabricante da coluna, seja na bula da coluna 
ou no site do fabricante. 
 
 
 
 
 
9.6. DETECTOR 
 
Para o detector de UV ou DAD basta esperar a lâmpada estabilizar no comprimento de 
onda estipulado no método. 
 
Para o detector MS, basta esperar o aquecimento da fonte de ionização e ligar o gás de 
nebulização. 
 
O software avisa quando o detector está pronto para análise. 
 
 
9.7. INJEÇÃO DA AMOSTRA 
 
Fazer a injeção da amostra, manualmente ou via injetor automático. No caso de injetor 
automático uma sequência de injeção é estabelecida no software. Nesse caso, não se 
esqueça de anotar o número do vial onde está a amostra e identificar a amostra no vial. 
 
 
A partir do momento que a válvula de injeção é girada e a amostra parte em direção à 
coluna, o cromatograma começa a ser adquirido. A aquisição do cromatograma para 
automaticamente quando for atingido o tempo final da análise, estipulado na etapa de 
desenvolvimento do método. 
 
 
 
 
 
 26 
 
 
Laboratórios que seguem normas como a ISO 
17025, normalmente requerem uma etapa 
adicional antes de rodar as amostras da rotina. Esse 
procedimento costuma ser chamado de QA/QC ou 
system suitability e consiste em uma etapa de 
checagem do sistema, para verificar se o 
equipamento está operando de acordo com as 
especificações esperadas. É checado a 
reprodutibilidade do injetor, da bomba, o número 
de pratos da coluna, assimetria e resolução de picos, 
entre outros. 
 
 
 
 
9.8. ANÁLISE DOS RESULTADOS E RELATÓRIOS 
 
Após a corrida das amostras, abre-se o resultado no software para interpretação dos 
resultados. 
 
O software gera relatórios da análise que podem ser formatados pelo analista. 
 
 
 
10. DESLIGANDO O EQUIPAMENTO 
 
Ao final das análises, é preciso limpar a coluna, sempre. A limpeza da coluna garante o seu 
tempo de vida, pois retira impurezas com potencial para adsorção irreversível. Se a fase 
móvel for composta por água (fase reversa) a coluna deve ser limpa solvente orgânico 
100 %. Na dúvida, consulte a bula da coluna ou o site do fabricante para saber qual o 
solvente recomendado para a limpeza da sua coluna. 
 
 
 
 !!!!!! DE NOVO !!!!!!! Quando for utilizado TAMPÃO na fase móvel, SEMPRE 
tirar o tampão do sistema depois das análises, para não correr o risco do tampão 
precipitar sais nos cabeçotes da bomba, o que vai travar o seu sistema, ser 
necessário limpeza e até mesmo a troca de peças, que são, na maioria das vezes, 
muito caras e dependendo do fabricante, o tempo de importação dessas peças 
pode ser muito demorado, ou seja, não deixar solução tampão parada de um dia 
 27 
para o outro no seu equipamento. NUNCA tirar o tampão com solvente orgânico 
100% (p.e metanol ou acetonitrila), pois ao primeiro sinal do solvente orgânico o 
tampão automaticamente precipitará nas tubulações e na coluna. Para retirar o 
tampão, passar água pelo sistema, por pelo menos 15 min (esse tempo depende do 
comprimento e diâmetro interno da coluna, se for uma coluna de 30 cm deixar um 
tempo maior). Após retirar o tampão com a água, aí sim você poderá passar 
solvente orgânico 100 % para limpar as linhas e a coluna. 
 
 
 
Não é necessário retirar a coluna do sistema todos os dias. Ela só precisa ser limpa todos os 
dias após as análises. 
 
Se o sistema for ficar desligado por três dias ou mais, purgar todas as linhas de fase móvel e 
a linha do injetor automático com 100 % de solvente orgânico. 
 
 
 
DICA: Isopropanol é um ótimo solvente de limpeza para as linhas e até mesmo 
para a coluna. Ele é miscível em todos os solventes, o que é um pré-requisito 
para a cromatografia líquida. 
 
 
 
DICA: De um dia para o outro, ao invés de desligar o equipamento, você pode 
limpar a coluna ao final da última análise e deixar o sistema com um fluxo baixo, 
por exemplo 0,05 mL/min, rodando a noite toda. Assim, no outro dia você não 
precisará purgar todas as linhas, basta aumentar o fluxo e condicionar a coluna. 
Se você usar esse procedimento 
 
 
 
 
11. VAZAMENTOS E ENTUPIMENTOS 
 
Os equipamentos de HPLC têm sensores de detecção de vazamentos em praticamente 
todos os módulos. Quando um vazamento é detectado o equipamento apita e as bombas 
são automaticamente desligadas. 
 
A maioria dos vazamentos são solucionados ajustando-se as conexões das tubulações. 
Quando não for possível solucionar é necessário chamar um técnico. 
 
Quando há um entupimento no sistema, a pressão ultrapassa o limite máximo (estipulado 
no software) e o equipamento apita parando imediatamente todas as bombas. 
 28 
12. MANUTENÇÃO PREVENTIVA 
 
Um equipamento de HPLC, assim como um carro, necessita de manutenções preventinas 
para trocas de peças consumíveis como selos, anilhas, cheque valves, etc. 
 
Recomenda-se que a manutenção preventiva seja feita uma vez por ano. Ela deve ser feita 
por um técnico treinado na fábrica. Assim como na instalação da máquina, após a 
manutenção preventiva, o técnico realiza todos os testes de especificação do equipamento. 
 
 
 
IMPORTANTE: A rede elétrica deve ser estável, sem picos de energia. Assim, 
recomenda-se que o equipamento esteja ligado em um no-break. 
 
 
 
IMPORTANTE: A sala onde está o equipamento deve ter temperatura 
controlada entre 18 e 23 oC e o sol não deve bater diretamente no equipamento. 
 
 
 
Como toda máquinda, um HPLC gosta de funcionar, se o equipamento ficar parado por 
muito tempo, pode ser que dê problema ao ligá-lo. Ficar parado não significa que não vai 
precisar trocar peças. Assim, ele pode e deve trabalhar dia e noite. 
 
 
 
 
13. PROBLEMAS ANALÍTICOS E SUAS POSSÍVEIS CAUSAS 
 
 
Ruído na linha de base: 
 
- Contaminantes da fase móvel. A água é a fonte mais comumde contaminação. 
- Bolhas no sistema. 
 
 
Tempo de retenção errado: 
 
- Bomba: vazamento 
- Erro de preparação da fase móvel 
- Coluna não condicionada 
 
 
 29 
 
 
O pico sumiu: 
 
- Injetor: vazamento, entupimento 
- Frasco (vial): acabou a amostra 
- Coluna: sobrecarregada (morreu) 
- Pré coluna: sebrecarregada 
- Bomba: vazamento 
- Amostra errada 
 
 
 
Rabeamento de pico (Assimetria): 
 
- Mistura de mecanismos de retenção entre o analito e a fase estacionária. 
- Analitos parcialmente ionizados. Controlar o pH com o tampão adequado. 
- Volume de injeção 
- Concentração da amostra e solvente de solubilização da amostra 
 
 
 
Picos duplicados ou irregulares: 
 
- Coluna: sobrecarregada ou faltando fase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 30 
ANEXO I – PRINCIPAIS PARÂMETROS DE UM MÉTODO DE HPLC/UV/DAD 
 
 
NOME DO MÉTODO: ________________________________________ 
AMOSTRA A SER ANALISADA: ________________________________ 
Coluna 
 
Fase estacionária: 
Especificação: cm x mmID x µm partícula 
Marca: 
Instalada em: 
Pré-coluna 
 
Fase estacionária: 
Especificação: cm x mmID x µm partícula 
Marca: 
Instalada em: 
Fase móvel 
 
Isocrática: 
ou 
Gradiente: 
 
 
 
 
 
Fluxo 
Temperatura do forno (se houver) 
Volume de injeção 
Solvente de lavagem do injetor 
Temperatura do injetor (se houver) 
Comprimento(s) de onda (UV) 
Faixa de comprimento de onda (DAD) 
 
 
Tempo de análise 
 
 
Pressão nas condições iniciais da análise: ____________________________________ 
 
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ANEXO II – CÁCULOS BÁSICOS 
 
 
Concentração = massa / volume 
 
 
 
Diluição: c1 x v1 = c2 x v2 
 
c1 = concentração da solução estoque 
v1 = volume que se pega da solução estoque para fazer a diluição 
c2= concentração final (solução diluída) 
v2= volume final (solução diluída) 
 
 
 
Unidades: 
 
1 mg/mL = 1000 µg/mL = 1000.000 ng/mL 
 
1 mg/L = 1 µg/mL = 1 ppm = 1000 ppb 
 
 
 
 
Fator de diluição: fator de multiplicação para determinação da concentração da 
amostra – leva em conta as diluições feitas do início ao fim da análise 
 
 
 
Soluções padrão: Devem ser feitas sempre em balão volumétrico calibrado