Relatório de aula prática Micologia

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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA
Área das Ciências da Vida e da Saúde
Ciências Biológicas - Joaçaba/SC
Componente Curricular: Micologia e Ficologia
Docente: Marcelina Mezzomo Debiasi
Ana Carolina Guberte
Otavio Luís Dallolmo
Relatório de Aula Prática Micologia
Joaçaba/SC
2023
1. INTRODUÇÃO
O reino Fungi é representado por mais de 100.000 espécies e é o segundo grupo com
maior diversidade de espécies, só ficando atrás do filo Arthropoda, além disso são descritas
em média 3.000 novas espécies a cada ano.
Santos (2015) define os fungos como:
… organismos eucarióticos, heterotróficos com nutrição absortiva e
reserva energética de glicogênio. A estrutura somática pode ser
leveduriforme ou filamentosa e haplóide ou dicariótica na maior parte
do seu ciclo de vida. Os filamentos são conhecidos como hifas e são
rodeadas por paredes celulares de quitina. Geralmente reproduzem-se
assexuada e sexuadamente, principalmente por esporos.
Os fungos são decompositores primários de matéria orgânica e reciclam seus
nutrientes assim como bactérias heterotróficas o fazem, isso torna esses seres indispensáveis
para o desenvolvimento dos ecossistemas, pois deixam disponíveis no meio os nutrientes para
serem aproveitados pelas plantas, por exemplo, decompondo a lignina devolvem para o solo
compostos nitrogenados, porém este processo libera também o dióxido de carbono para a
atmosfera (SANTOS, 2015).
Na indústria os fungos são amplamente utilizados em diversos setores, como produção
de fármacos, nos alimentos, na produção de biocombustíveis, nas plantações, etc. O gênero
Penicillium é amplamente empregado na área médica, pois a partir dele é produzida a
penicilina. Além disso, outro medicamento importante é a ciclosporina, obtida do fungo
Tolypocladium inflatum que funciona como um agente imunossupressor que reduz a
probabilidade de rejeição no transplante de órgãos.
Os fungos também desempenham um importante papel na produção de
biocombustíveis, como o Trichoderma reesei, utilizado para a produção de etanol, bem como
na indústria alimentícia onde vários fungos estão presentes em nossa alimentação e outros são
utilizados em diversos preparos, como os cogumelos e as leveduras.
O processo de panificação envolve o uso da levedura conhecida como Saccharomyces
cerevisiae, que realiza a fermentação. Essa levedura também é utilizada no processo de
fermentação de cereais convertendo-os em álcool, já na produção de queijos como por
exemplo o Roquefort e Camembert, é necessária a adição de Penicillium rocheforti e
Penicillium camemberti, respectivamente (RAMOS).
O reino Fungi é um grupo diverso e complexo de organismos representado por cinco
filos. O filo Chytridiomycota é composto por indivíduos predominantemente aquáticos que
possuem células flageladas. Além destes, os Zygomycota se distinguem de outros grupos de
fungos devido às suas hifas cenocíticas, que não são monofiléticas; os Glomeromycota
exibem comportamento micorrízico mutualístico e se envolvem em relações simbióticas com
mais de 90% das espécies de plantas; os Ascomycota possuem hifas septadas e estruturas
reprodutivas típicas conhecidas como ascos e os Basidiomycota, também possuem hifas
septadas e estruturas reprodutivas típicas chamadas basídios, estes representam mais de 95%
das espécies de fungos conhecidas (SANTOS, 2015).
Tendo isso em vista, o presente trabalho tem como objetivo principal identificar em
nível de filo ou família, fungos comumente encontrados em amostras presentes em nosso dia
a dia, para tanto, as amostras foram acondicionadas em meios de cultura e analisadas a partir
do preparo de lâminas observadas em microscópio.
2. METODOLOGIA
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram coletadas amostras com presença de
fungos, são essas, folhas, galhos de árvore, solo e laranja das quais foram extraídos parte do
fungo presente e transferidos para placas com meios de cultura variados que foram
armazenados em uma estufa a aproximadamente 35ºC por uma semana e então o produto
desse cultivo foi transferido para lâminas para serem observadas em microscópio a fim de
identificar as espécies presentes. Portanto, esse trabalho caracteriza-se como uma pesquisa
observacional de forma que os resultados são abordados de forma descritiva.
2.1. PREPARO DE MEIOS DE CULTURAS
Para a realização desse experimento, foi selecionado 3 tipos diferentes de meio de
cultura para auxiliar no isolamento dos fungos, pois em geral, os fungos demandam de
nutrientes semelhantes, porém seu crescimento pode ser favorecido ou limitado dependendo
das condições e competição com outros microrganismos como as bactérias.
Todos os meios de culturas foram preparados da seguinte maneira, após diluição
deixou-se o ágar em repouso por quinze minutos para embebição e então para dissolução
completa foi aquecido, posteriormente o preparo foi esterilizado em autoclave por quinze
minutos a 121 ºC e se necessário ajustado o pH para 7,0. Finalmente os meios foram
plaqueados em quantidade suficiente para gerar 5 placas de cada meio para todos os grupos,
cada grupo obteve seus próprios resultados, totalizando 3 relatórios.
Fotografia 01: Diluição do meio de cultura
Fonte: Os autores.
2.1.1. Batata dextrose ágar (Potato dextrose agar, BDA)
O meio de cultura preparado com Batata dextrose ágar (BDA) foi utilizado como meio
para amostras de solo e do galho de árvore, esse meio é mais generalista, pois, segundo o
Prolab é rico em açúcares simples advindos da batata, portanto diferentes microrganismos
podem ser cultivados, além disso, conforme informado pelo mesmo autor, o BDA é muito
utilizado em no mundo da produção de alimentos com a finalidade de facilitar a contagem de
fungos e leveduras.
Esse produto é vendido no mercado já preparado em pó, dessa forma, para que seja
transformado em um meio de cultura para plaqueamento é necessário fazer uma diluição
conforme indicada no rótulo do mesmo. Para isso, utilizamos a diluição de 39 gramas de ágar
BDA para ter 1 litro de meio líquido gelatinoso (Fotografia 02).
Fotografia 02: Meio de cultura BDA diluído para 1L
Fonte: Os autores.
2.1.2. Ágar Sabouraud glicosado (Sabouraud glycose agar)
O Laborclin (2019) afirma que o Ágar Sabouraud Glicosado é, atualmente utilizado
para o isolamento de fungos sem especificidade quanto a este grupo de organismos, além
disso, no que dispõe da composição do ágar, o autor expõe que as peptonas presentes são
compostos nitrogenados excelentes para o desenvolvimento de fungos. A dextrose é fonte de
energia e sua elevada concentração propicia a proliferação de fungos e limita o
desenvolvimento de bactérias, além disso o pH baixo é bom para fungos e também limita o
crescimento de bactérias, bem como o composto cloranfenicol, um antibiótico que limita o
desenvolvimento de fungos patogênicos ao mesmo passo que inibe bactérias gram positivas.
Para esse meio foram preparados 500mL de solução com 32,5 gramas de Sabouraud
glicosado (Fotografia 03), separados em placas de petri que receberam amostras de fungos
provindos de uma folha escura, uma folha de laranjeira e de uma laranja.
Fotografia 03: Meio de cultura ágar sabouraud glicosado
Fonte: Os autores
2.1.3. Extrato de malte ágar (Malt extract agar, MEA)
Para preparar esse meio foi necessário pesar 15 gramas de malte não torrado e 15
gramas de Ágar para 500mL de solução. Esse extrato de malte com ágar, segundo a Prolab é
indicado para o cultivo de leveduras e bolores, a Sinergia Química complementa que um meio
ácido favorece a proliferação de fungos e tem ação bactericida. Neste meio foram aplicadas
amostras de folha de laranjeira, galho de árvore e laranja.
2.2. ISOLAMENTO DE FUNGOS
2.2.1. Isolamento direto
O isolamento direto de fungos foi realizado após higienização da bancada e aceso o
bico de Bunsen, então, a alça de repicagem foi flambada e resfriada, tocando levemente o
meio de cultura. Assim, com ajuda da alça, é destacado o bolor da laranja e distribuído pelomeio de cultura na placa. Desta forma a placa pode ser fechada e selada com plástico filme,
identificada e deixada na estufa por 7 dias (CAROLLO, 2016).
2.2.2. Isolamento de fungos indireto
O procedimento utilizado para a cultura de fungos por isolamento indireto consistiu
em uma amostra fresca e viável para que fosse possível observar o crescimento de micélios. O
tecido vegetal foi lavado e posteriormente desinfetado superficialmente em uma solução de
álcool 70% por 30 segundos e após colocado em uma solução de NaOCl a 0,5% por 1 minuto,
para assim, ser cortado com lâmina flambada em pequenos pedaços nos locais das lesões.
Os pedaços do tecido foram então secos em papel filtro autoclavado e transferidos para
placas com meio de cultura. As placas foram fechadas e seladas com plástico filme,
identificadas e colocadas na estufa para crescimento por 7 dias (MELLO, 2011).
2.2.3. Amostra de solo
Tendo em vista o crescimento de fungos presentes no solo, foi separado 10 gramas da
amostra de solo, depois de ser peneirado e diluído em 90 mL de água esterilizada,
adicionou-se também 2 antibióticos para eliminar as bactérias gram positivas e gram
negativas buscando evitar seu crescimento (Fotografia 04).
Após, foi realizado uma série de diluições 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000 (Fotografia
05). Para tanto, foi necessário colocar cerca de 1000 μL de cada diluição na superfície do
meio, cada placa de Petri representa uma diluição diferente. Assim, fechou-se as placas e
selou-se com plástico filme, identificamos com a respectiva diluição e as placas foram
incubadas na estufa por 7 dias (MELLO, 2011).
Fotografia 04: Amostra de solo peneirada, solubilizada recebendo os antibióticos
Fonte: Os autores.
Fotografia 05: Série de diluições
Fonte: Os autores.
2.3. MICROSCOPIA
Para a visualização das estruturas dos fungos foram preparadas lâminas de
microscopia de duas formas distintas, onde alguns fluidos de montagem foram empregados na
preparação, estes possuem componentes ou substâncias que conferem propriedades
específicas, como colorir esporos e outras estruturas do patógeno e/ou células e estruturas do
tecido do hospedeiro, permitindo melhor clareza na visualização ao microscópio, fixar a peça
ou estrutura a ser observada, impedir o dessecamento da preparação e preservar sua
integridade estrutural (STADNIK).
2.3.1. Preparo de lâmina
Utilizou-se, o preparo de uma lâmina por fragmentação de corpos frutíferos, que
consiste em colocar uma gota de ácido lático sobre uma lâmina, depois, com auxílio de uma
alça de repicagem, remover uma pequena porção de material a ser examinado e depositar
sobre a gota. Em seguida adicionar uma gota de álcool 92% e finalizar com uma lamínula.
Procedendo-se a observação em microscópio (STADNIK).
2.3.2. Técnica da fita adesiva
Essa técnica consiste em estender sobre a superfície da placa um pedaço de fita
adesiva transparente (é necessária uma leve pressão para que o fungo cole na fita), em seguida
a fita é removida cuidadosamente e aderida à lâmina sobre o corante Azul de
Lactofenol-algodão e então pode-se conduzir a observação no microscópio óptico
(STADNIK). Esse método é adequado para fungos cujos esporos não são gerados dentro dos
corpos frutíferos.
Dessa forma, o corante Azul de Lactofenol-algodão foi preparado conforme as normas
da ANVISA que determina os reagentes e suas respectivas quantidades:
Composição:
- Ácido lático - 20g
- Cristais de fenol - 20g (necessário fundir em banho maria antes de juntar aos demais
reagentes)
- Glicerina - 20g
- Azul algodão* - 0,05g
- Água destilada - 20ml
- Misturar os reagentes, homogeneizar e após 24 horas filtrar.
Usamos, ainda, como outra alternativa a esse corante, o azul de metileno.
3. RESULTADOS
Com as lâminas prontas, visualizamos uma por uma no microscópio e identificamos os
fungos observados em aumentos de 100x e 400x. Obtivemos, assim, os seguintes resultados:
Fotografia 06: Fungo do filo zygomycota, apresenta hifas cenocíticas. Na foto aparecem hifas
e esporos.
Fotografia 07: Fungo do gênero Aspergillus sp.. A foto apresenta hifas, esporos e estrutura
reprodutiva.
Fotografia 08: Fungo do filo Ascomycota. A foto apresenta hifas e estrutura reprodutiva
jovem.
Fotografia 09: Fungo do filo Zygomycota/Basidiomycota. A foto apresenta um micélio.
Fotografia 10: Rhizopus spp.. Na foto aparecem estrutura reprodutiva e esporos.
Fotografia 11: Aspergillus spp. muito parecido com o A. niger, na foto aparecem estrutura
reprodutiva e esporos.
Foto 12: Penicillium spp.. Na foto aparecem estrutura reprodutiva e esporos.
4. CONCLUSÃO
A partir deste trabalho desenvolvemos habilidades multidisciplinares que envolveram
técnicas básicas de laboratório e microscopia, além de identificar fungos compreendendo suas
estruturas e ciclo de vida. Com isso, percebe-se um mundo microscópico bastante vasto e
complexo, do qual fazem parte muitos fungos comuns que aparecem em nosso dia-a-dia,
como os bolores, as leveduras, os cogumelos comestíveis e alguns causadores de infecções ou
alergias como algumas espécies do gênero Aspergillus.
Em virtude dessa diversidade do reino fungi é esperado que esses seres vivos possam
ser explorados economicamente em diversos setor, devido, principalmente, aos metabólitos
que eles produzem, portanto, vemos fungos sendo utilizados na fermentação de alimentos e
bebidas, no controle biológico de pragas e no setor de fármacos. Para se ter uma ideia, Zhang
et al. afirma que (2021) “A previous review by Reino et al. summarized 186 compounds
isolated from Trichoderma as well as their biological activities up to 2008.”1 e acrescenta uma
expectativa de novas descobertas no âmbito de medicamentos e agroquímicos.
Assim sendo, entende-se a importância de estudar esses organismos e o papel que
desempenham no meio ambiente, pois podem oferecer ao campo da biotecnologia uma forma
eficaz e talvez mais viável financeiramente de produzir insumos importantes para o bem-estar
da população, pois os fungos são facilmente produzidos em larga escala e não demandam de
demasiada manutenção.
1 Uma revisão anterior de Reino et al. resumiu 186 compostos isolados de Trichoderma bem como suas
atividades biológicas até 2008.
REFERÊNCIAS
ANVISA. MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO
RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Módulo 8: Detecção e Identificação dos
Fungos de Importância Médica. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília, DF. 2013.
CAROLLO, E. M.; FILHO, H. P. S.. Manual básico de técnicas fitopatológicas. Brasília,
DF, Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura BA, 2016. 1 e. 109 p.
LABORCLIN. AGAR SABOURAUD. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda. Pinhais,
PR. 2019.
MELLO, S. C. M. de; REIS, A.; TAVARES DA SILVA, J. B.. Manual de Curadores de
Germoplasma – Micro-organismos: Fungos Filamentosos. Brasília, DF, Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia, 2011, 25 p.
PROLAB. Agar Batata Dextrose - Potato Dextrose Agar. Materiais para laboratório. São
Paulo, SP. 2023. Disponível em:
<https://www.prolab.com.br/produtos/meios-de-cultura/agar-batata-dextrose/agar-batata-dextr
ose-potato-dextrose-agar/>. Acesso em: 08 set. 2023.
RAMOS, J. O Papel dos Fungos na Indústria. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes,
Centro de Ciências da Saúde, UFRJ. Rio de Janeiro. Disponível em:
<https://www.microbiologia.ufrj.br/portal/index.php/pt/destaques/novidades-sobre-a-micro/65
9-o-papel-dos-fungos-na-industria>. Acesso em: 06 set. 2023.
SANTOS, E. R. D. dos; Material Complementar ao Livro Sistemática Vegetal I: Fungos.
UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2015.
SINERGIA CIENTÍFICA. Ágar Extrato de Malte. Microbiologia, Meios de Cultura.
Campinas, SP. 2023. Disponível em:
<https://www.sinergiacientifica.com.br/produto/agar-extrato-de-malte/>. Acesso em: 08 set.
2023.
STADNIK. M. J.Microscopia e Preparações Microscópicas. Universidade Federal de Santa
Catarina - UFSC, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Fitotecnia.Florianópolis,
SC. 2012.
ZHANG, Jian-Long; TANG, Wen-Li; HUANG, Qing-Rong; et al. Trichoderma: A Treasure
House of Structurally Diverse Secondary Metabolites With Medicinal Importance. Frontiers
in Microbiology, v. 12, 2021. Disponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34367122/>.
Acesso em: 27 out. 2021.