Lista de Exercício HPLC metodos Instrumentais plse 2023_1 docx

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Universidade Federal do Rio Grande Do Norte
Departamento de Farmácia
Disciplina: Métodos Instrumentais de Análises aplicados a Produtos Farmacêuticos
LISTA DE EXERCÍCIO
Sobre a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, responda:
Discente: Italo Gleison Tarquinio da Silva
1. Sobre cromatografia líquida analise as seguintes afirmações como verdadeiras (V) ou falsas (F),
justificando as falsas:
( V ) A HPLC é uma técnica de ultra-microanálise, que de acordo com a substância e detector empregado é
capaz de quantificar massas de componentes inferiores a 10-8 g.
( V ) As colunas analíticas são destinadas apenas para fins de identificação e quantificação, não sendo
possível isolar os compostos de uma mistura.
( V ) Esse tipo de cromatografia foi inicialmente desenvolvida pelo russo Mikhail Tswett.
( F ) Altura equivalente a um prato teórico, H, compreende o comprimento da coluna no qual o equilíbrio
termodinâmico foi atingido entre a substância e a fase estacionária.
2. A figura a seguir esquematiza os elementos que compõem um cromatógrafo líquido de alta eficiência.
Com base nisto, identifique os componentes e descreva as etapas operacionais que levam a obtenção do
cromatograma.
R: D , G
Fonte:https://arquivo.pciconcursos.com.br/provas/25776677/063fb414ddeb/farmaceutico.pdf
3. Considere as seguintes condições cromatográficas em HPLC: coluna de sílica, eluente ACN:H2O (70:30,
v/v), fluxo de 1 ml/min, detecção a 217 nm. O cromatograma apresentou 3 picos: Pico 1 Tr = 2 min Pico 2
Tr = 5 min Pico 3 Tr = 7 min. Qual pico representa o composto de menor polaridade? Justifique sua
resposta.
R: Nas condições cromatográficas fornecidas, em HPLC, quando menor o tempo de retenção (Tr),
maior a polaridade do composto, desta forma, o pico 3 é o que apresenta menor polaridade.
4. Por que as fases estacionárias de sílica microporosa estão geralmente limitadas a operar na faixa de pH
entre 2 e 8?
R:As fases estacionárias de sílica microporosa são frequentemente limitadas a operar na
faixa de pH entre 2 e 8 devido a considerações relacionadas à estabilidade química da sílica
e à reatividade de grupos funcionais nas superfícies das partículas de sílica. Aqui estão
algumas das principais razões para essa faixa de pH limitada:
 Ataque Ácido da Sílica: A sílica, especialmente na forma de partículas microporosas
usadas como fase estacionária em HPLC, é suscetível ao ataque ácido em pHs baixos
(ácidos) e altos (básicos). Isso resulta na degradação da fase estacionária e na liberação de
partículas de sílica na coluna, o que pode obstruir a coluna e levar a resultados
imprecisos.
 Erosão da Sílica: Em pH ácido ou alcalino, a sílica pode sofrer erosão, levando à
degradação das partículas de sílica. Isso não apenas prejudica a integridade da fase
estacionária, mas também pode afetar a eficiência da separação.
 Compatibilidade Química: Muitos grupos funcionais usados em fases estacionárias de
sílica microporosa são sensíveis a condições extremas de pH. Em pHs muito ácidos ou
alcalinos, esses grupos funcionais podem ser danificados, resultando na perda de
seletividade e na deterioração da capacidade de separação.
 Variação na Carga da Superfície: A superfície da sílica pode se tornar altamente
carregada em pHs extremos, o que pode afetar a retenção e a eluição dos analitos, bem
como a seletividade da separação.
Para ampliar a faixa de pH de operação de colunas HPLC, é possível usar colunas modificadas
com grupos funcionais que sejam mais resistentes a condições ácidas ou alcalinas. Por exemplo,
colunas C18 podem ser modificadas para melhorar a estabilidade em faixas de pH mais amplas.
No entanto, mesmo com modificações, a maioria das colunas ainda apresenta limitações de pH, e
a seleção de colunas e condições de operação deve ser feita considerando a natureza das amostras
e das condições do analito.
É importante consultar as especificações e diretrizes fornecidas pelo fabricante da coluna para
garantir o uso adequado dentro da faixa de pH recomendada e evitar danos às colunas e
resultados imprecisos.
5. A cromatografia líquida de alta eficiência utiliza pressões elevadas para forçar a passagem de solventes
através das colunas cromatográficas. Diante disto, por que é necessária alta pressão na HPLC e quais
características as colunas analíticas devem possuir para suportar esta pressão?
R: A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) utiliza pressões elevadas para
forçar a passagem dos solventes através das colunas cromatográficas por várias razões, e as
colunas analíticas devem ser projetadas para suportar essas pressões. Aqui está o motivo da
necessidade de alta pressão na HPLC e as características que as colunas analíticas devem
possuir:
Necessidade de Alta Pressão na HPLC:
 Aumento da Eficiência da Separação: A alta pressão é necessária para empurrar a fase
móvel através da coluna cromatográfica a taxas adequadas, o que é essencial para
alcançar separações eficientes em um período de tempo razoável. A pressão é
proporcional à taxa de fluxo da fase móvel, e taxas mais altas de fluxo permitem análises
mais rápidas.
 Redução do Tempo de Análise: A alta pressão permite o uso de partículas de enchimento
menores na coluna, o que, por sua vez, melhora a eficiência da separação. Isso reduz o
tempo necessário para completar uma análise, tornando a HPLC uma técnica mais
rápida em comparação com a cromatografia líquida convencional.
 Aumento da Resolução: Pressões mais altas permitem o uso de colunas mais longas, o que
pode aumentar a resolução entre picos cromatográficos adjacentes, permitindo uma
melhor separação de componentes.
Características das Colunas Analíticas para Suportar Alta Pressão:
 Materiais de Construção Duráveis: As colunas analíticas devem ser construídas com
materiais de alta qualidade e durabilidade para suportar as pressões elevadas.
Geralmente, as colunas HPLC são feitas de aço inoxidável ou materiais poliméricos
resistentes a pressão.
 Resistência à Compressão: As partículas de enchimento na coluna devem ser
compactadas uniformemente e resistentes à compressão, evitando deformações sob
pressão. Isso é importante para manter a integridade da coluna.
 Baixa Desnaturação: As colunas devem ser projetadas para evitar a desnaturação de
amostras sensíveis, como proteínas, em altas pressões e com o uso de solventes orgânicos.
 Empacotamento Homogêneo: O empacotamento das partículas de enchimento deve ser
homogêneo e uniforme ao longo da coluna para garantir uma separação eficaz e
reproduzível.
 Tamanho de Partícula Adequado: A escolha do tamanho de partícula adequado é
importante. Partículas menores proporcionam maior eficiência de separação, mas exigem
maiores pressões para operar. Colunas de tamanho de partícula menor normalmente
requerem sistemas HPLC de alta pressão.
 Compatibilidade Química: As colunas devem ser compatíveis com os solventes e amostras
usadas na análise. Materiais de embalagem devem resistir à corrosão química e à
interação com as amostras.
 Pressão Máxima Especificada: Cada coluna tem uma pressão máxima especificada que
não deve ser excedida. É importante operar dentro dos limites de pressão recomendados
pelo fabricante para evitar danos à coluna e garantir resultados confiáveis.
Em resumo, a necessidade de alta pressão na HPLC é devido à busca por separações mais
eficientes, menor tempo de análise e maior resolução. As colunas analíticas devem ser projetadas
com materiais resistentes e características específicas para suportar essas pressões, garantindo
um desempenho confiável e uma vida útil prolongada.
6. Por que a força eluente aumenta quando o solvente se torna menos polar na cromatografia de fase reversa,
enquanto a força eluente aumenta quando o solvente se torna mais polar na cromatografia de fase normal?
R: O bombeamento isocrático e o bombeamento por gradiente são duas abordagens
diferentes usadas na cromatografia líquida, incluindo a Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência(HPLC), para a eluição de analitos na coluna cromatográfica. Cada uma dessas
abordagens tem suas próprias características e aplicações específicas. Vamos descrever as
diferenças entre o bombeamento isocrático e por gradiente:
Bombeamento Isocrático:
 Composição da Fase Móvel Constante: No bombeamento isocrático, a fase móvel, que é a
mistura de solventes que transporta a amostra através da coluna, mantém uma
composição constante durante todo o processo de separação.
 Aplicações: O bombeamento isocrático é frequentemente utilizado em análises onde a
separação dos analitos pode ser alcançada com uma única composição da fase móvel. Isso
é comum quando os analitos têm características semelhantes e não requerem uma
variação da composição da fase móvel para serem resolvidos.
 Simplicidade: O bombeamento isocrático é mais simples de configurar e operar, pois não
requer mudanças na composição da fase móvel durante a análise.
 Tempo de Análise: Em algumas situações, o bombeamento isocrático pode resultar em
tempos de análise mais curtos, pois não há necessidade de rampas de gradiente.
Bombeamento por Gradiente:
 Composição da Fase Móvel Variável: No bombeamento por gradiente, a composição da
fase móvel é alterada ao longo do tempo de análise. Isso envolve uma transição controlada
de uma fase móvel mais fraca para uma mais forte, ou vice-versa, durante a análise.
 Aplicações: O bombeamento por gradiente é usado em situações em que os analitos são
difíceis de separar com uma única composição da fase móvel. Permite uma resolução mais
eficaz de picos cromatográficos e é frequentemente utilizado em análises complexas onde
os analitos têm características diferentes.
 Melhoria na Resolução: O bombeamento por gradiente é particularmente útil para
melhorar a resolução de picos cromatográficos, separando analitos que de outra forma se
eluiriam muito próximos um do outro.
 Flexibilidade: O bombeamento por gradiente oferece flexibilidade na otimização das
condições cromatográficas, permitindo a adaptação do gradiente de acordo com as
necessidades da análise.
 Tempo de Análise: Em geral, o bombeamento por gradiente pode resultar em tempos de
análise mais longos, devido à necessidade de realizar rampas de gradiente controladas.
Em resumo, o bombeamento isocrático é adequado para análises mais simples, onde os analitos
podem ser separados eficazmente com uma única composição da fase móvel. Por outro lado, o
bombeamento por gradiente é preferido em análises mais complexas, onde a variação controlada
da composição da fase móvel é necessária para uma separação eficaz dos analitos. A escolha
entre essas abordagens depende da natureza dos analitos e dos objetivos da análise.
7. Descreva as diferenças entre o bombeamento isocrático e por gradiente.
8. O detector emite um sinal elétrico o qual é registrado, que fornece informações de concentração ou a
massa dos compostos da amostra que eluem ao longo da coluna cromatográfica. Descreva as propriedades,
de maior relevância, que os detectores devem possuir.
R: Os detectores em cromatografia são componentes essenciais que convertem as interações entre
os analitos e a fase estacionária em sinais elétricos que podem ser registrados e quantificados.
Para desempenhar eficazmente essa função, os detectores devem possuir várias propriedades
importantes, incluindo:
 Sensibilidade: Os detectores devem ser capazes de detectar e quantificar analitos em
concentrações muito baixas. A sensibilidade é crucial para a detecção de componentes de
amostras com baixa concentração, como em análises de traços.
 Linearidade: A resposta do detector deve ser proporcional à concentração do analito. Isso
significa que a curva de calibração deve ser linear, o que permite uma quantificação
precisa em uma faixa de concentração ampla.
 Seletividade: Os detectores devem ser seletivos para os analitos de interesse, evitando
interferências de outros componentes da amostra. A seletividade é essencial para garantir
resultados precisos e específicos.
 Faixa de Detecção: Os detectores devem ser capazes de detectar uma ampla faixa de
concentrações, desde concentrações traço até concentrações mais elevadas. Isso garante
que o detector seja útil para várias aplicações.
 Estabilidade: Os detectores devem ser estáveis ao longo do tempo, com pouca variação na
resposta ao longo de análises repetidas. A estabilidade é importante para a precisão e a
reprodutibilidade dos resultados.
 Rapidez de Resposta: Os detectores devem ser capazes de fornecer resultados em tempo
hábil, especialmente em aplicações em tempo real e controle de processos.
 Ampla Faixa de Comprimento de Onda: Para detectores baseados em espectrofotometria,
como UV/Vis e detectores de fluorescência, é importante ter uma ampla faixa de
comprimento de onda para cobrir diferentes analitos.
 Facilidade de Operação e Manutenção: Detectores devem ser de fácil operação e
manutenção, com ajustes e calibrações acessíveis, o que é importante para evitar erros
operacionais e garantir a confiabilidade do equipamento.
 Compatibilidade com a Fase Móvel: Os detectores devem ser compatíveis com os
solventes e a fase móvel utilizados na cromatografia. Isso é especialmente importante em
cromatografia líquida, onde a fase móvel pode variar.
 Baixo Ruído de Fundo: Detectores devem gerar um sinal de baixo ruído de fundo, o que é
fundamental para melhorar a relação sinal/ruído e, portanto, a sensibilidade da detecção.
 Versatilidade: Alguns detectores podem ser utilizados em diferentes técnicas
cromatográficas, o que é uma característica desejável para laboratórios que realizam
várias análises.
 Registro de Dados e Interface de Computador: Detectores modernos geralmente têm
capacidade de registrar dados eletronicamente e são compatíveis com sistemas de
computador, facilitando o armazenamento, a análise e o gerenciamento dos resultados.
Em resumo, as propriedades acima são fundamentais para garantir que os detectores em
cromatografia forneçam resultados precisos e confiáveis, atendendo às necessidades específicas
de uma análise cromatográfica. A escolha do detector depende das características dos analitos,
do tipo de cromatografia e das especificidades da aplicação.
9. Aponte as diferenças, destacando as principais aplicações dos detectores empregados em HPLC:
Detectores de absorbância no UV/Vis; Fluorescência; Índice de Refração; Eletroquímicos.
R: Os detectores usados na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) são
componentes críticos que permitem a detecção e quantificação dos analitos separados na
coluna cromatográfica. Cada tipo de detector tem suas próprias características, vantagens e
desvantagens, bem como aplicações específicas. Vamos destacar as principais diferenças e
aplicações dos detectores comuns empregados em HPLC:
 Detectores de Absorbância no UV/Vis:
● Princípio de Funcionamento: Esses detectores medem a absorção de luz pelos
analitos em uma faixa de comprimento de onda no espectro ultravioleta (UV) ou
visível (Vis).
● Principais Aplicações: São amplamente utilizados na análise de compostos
orgânicos e inorgânicos. São eficazes na detecção de moléculas que absorvem luz
na faixa do UV/Vis. Aplicações comuns incluem análises farmacêuticas, ambientais
e de alimentos.
 Detectores de Fluorescência:
● Princípio de Funcionamento: Detectores de fluorescência medem a luz emitida por
analitos que foram excitados por luz de comprimento de onda específico. Os
analitos emitem fluorescência a comprimentos de onda diferentes do comprimento
de excitação.
● Principais Aplicações: São altamente sensíveis e seletivos, sendo úteis na detecção
de compostos que possuem propriedades de fluorescência. São frequentemente
utilizados na análise de compostos orgânicos, como compostos aromáticos,
flavonoides, e em aplicações bioquímicas e biomédicas, como análise de proteínas e
DNA.
 Detectores de Índice de Refração:
● Princípio de Funcionamento: Detectores de índice de refraçãomedem a variação
do índice de refração causada pela passagem dos analitos na fase móvel. Qualquer
mudança no índice de refração é detectada como um sinal cromatográfico.
● Principais Aplicações: São úteis na análise de amostras que não absorvem luz no
UV/Vis e não emitem fluorescência. São frequentemente utilizados na análise de
açúcares, polissacarídeos, lipídios, compostos orgânicos menos absorventes e
também em análises de polímeros.
 Detectores Eletroquímicos:
● Princípio de Funcionamento: Detectores eletroquímicos monitoram a corrente
elétrica resultante da oxidação ou redução dos analitos em um eletrodo. O sinal é
diretamente proporcional à concentração do analito.
● Principais Aplicações: São usados na detecção de compostos eletroativos, como
compostos orgânicos com grupos funcionais redutores ou oxidantes. São comuns
em análises de compostos eletroativos em aplicações farmacêuticas, ambientais,
eletroquímica analítica, entre outros.
Cada tipo de detector em HPLC tem suas próprias vantagens e desvantagens, e a escolha do
detector depende das propriedades dos analitos e das necessidades analíticas específicas de uma
determinada aplicação. A combinação de diferentes detectores também é comum para obter
informações complementares sobre os analitos.
10. Qual coluna é mais eficiente: aquela com uma altura do prato igual a 0,1 mm ou 1 mm? Justifique sua
resposta.
R:A eficiência de uma coluna cromatográfica é frequentemente avaliada pela altura do
prato (H) ou o número de pratos teóricos (N). A relação entre a altura do prato e a
eficiência da coluna é a seguinte: quanto menor a altura do prato, maior a eficiência da
coluna.
Portanto, em seu cenário, uma coluna com uma altura do prato igual a 0,1 mm é mais eficiente
do que uma coluna com uma altura do prato igual a 1 mm. Isso significa que a coluna com uma
altura do prato menor é capaz de fornecer uma melhor resolução e separação entre os
componentes da amostra. Ela permite a passagem de analitos pela fase estacionária mais
lentamente e, portanto, oferece uma melhor capacidade de separação. No entanto, vale ressaltar
que, em geral, colunas com alturas de prato menores podem exigir uma pressão mais alta para
operar e podem ser mais sensíveis a pequenas variações nas condições cromatográficas, então a
escolha da coluna depende das necessidades específicas de sua análise.
11. Os cromatogramas dos compostos A e B foram obtidos na mesma vazão em duas colunas de mesmo
comprimento com eluente MeOH: H2O (35:65, v/v), coluna RP-C18 . Assinale a alternativa correta.
a) A coluna 2 tem resolução maior.
b) O composto B tem coeficiente de partição maior.
c) As colunas apresentam fator de retenção (k) diferente.
d) A coluna 2 é mais eficiente.
12. Correlacione os métodos cromatográficos as proposições a seguir:
1. Cromatografia de troca iônica;
2. Cromatografia de partição;
3. Cromatografia de adsorção;
4. Cromatografia de exclusão molecular;
5. Cromatografia de afinidade.
( 1 ) Solutos de tamanho diferentes penetram com uma diferente extensão em ambientes vazios existentes na
fase estacionária. Os solutos maiores são elucidos primeiramente.
( 2 ) Fase estacionária sólida e uma fase móvel líquida ou gasosa. O soluto é adsorvido na superfície das
partículas sólidas.
( 4 ) Utiliza interações específicas entre um tipo de molécula do soluto e uma segunda molécula que se
encontra covalentemente ligada à fase estacionária.
( 3 ) Ânions ou cátions estão ligados covalentemente à fase estacionária sólida, que neste tipo de
cromatografia costuma ser uma resina.
( 5 ) A separação é baseada nos diferentes coeficientes de partição (solubilidade) dos componentes da mistura
entre dois solventes imiscíveis.
13. A separação cromatográfica de duas substâncias foi realizada utilizando-se fase estacionária RP-C18 e fase
móvel de composição constante ACN: Ácido acético a 2% (40:60, v/v). Nestas condições, a substância B
surge no cromatograma com Tr a 7,4 min e a substância A com Tr a 10,5 min. Com base na afirmativa,
assinale a alternativa correta.
a) O procedimento descrito caracteriza-se como cromatografia líquida de fase normal.
b) O aumento da proporção de ACN diminuirá a polaridade da fase móvel.
c) A separação foi realizada pelo método gradiente.
d) A substância A é menos polar que a substância B.
14. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é um dos métodos analíticos mais utilizados para
fins qualitativos e quantitativos. Quanto a esta técnica de cromatografia líquida, está INCORRETO afirmar
que:
a) A qualidade de coluna deve ser verificada quando houver variações de reprodutibilidade.
b) Uma pré-coluna com composição de fase estacionária distinta da coluna cromatográfica deve ser
instalada para aumentar a vida útil do sistema.
c) Os solventes em cromatografia líquida são injetados sob alta pressão.
d) Utilizando uma coluna de fase reversa, o analito mais polar elui primeiro que o analito menos
polar.
15. Um solvente ideal para ser empregado na fase móvel de uma análise em HPLC necessita ter os seguintes
requisitos, EXCETO:
a) Ter alto grau de pureza.
b) Não dissolver a fase estacionária.
c) Alta viscosidade.
d) Dissolver a fase móvel sem decompor os analitos.
e) Ser compatível com o detector.
16. A HPLC pode ser efetuada por eluição isocrática ou eluição gradiente. Com base nisto, assinale a
alternativa correta.
a) A separação por gradiente é capaz de diminuir a resolução e reproduzir picos menos simétricos.
b) A eluição por gradiente apresenta a desvantagem de aumentar o tempo de análise;
c) A separação por gradiente possui como desvantagens o aumento do custo, já que necessita de
bomba com misturador, e não é compatível com todos os detectores.
d) Dar-se o nome de eluição isocrática, quando a composição da fase móvel é alterada durante a eluição;
17. Os detectores modernos são capazes de operar em ampla faixa ou intervalos de concentração. Geralmente,
apresentam excelente sensibilidade, fornecem informações estruturais importantes sobre os analitos e
permitem fácil quantificação. A respeito dos detectores modernos, é correto afirmar.
a) Detectores por índice de refração são detectores específicos e apresentam maior seletividade se
comparados aos outros detectores empregados em cromatografia líquida.
b) Os detectores de fluorescência medem as mudanças da fluorescência no efluente das colunas quando
este for exposto a comprimentos de onda selecionados. A grande desvantagem está na sua baixa
sensibilidade.
c) UV-VIS apresentam a vantagem de ser universais, isto é, detectam qualquer composto que não seja a
fase móvel.
d) UV-VIS têm como princípio a utilização da luz absorvida. Esses detectores são baseados na
relação existente entre a intensidade do feixe de luz que incide na amostra e a intensidade do feixe
que emerge dela.
18. A cromatografia líquida de alta eficiência é uma importante técnica de separação. Conhecer suas
vantagens e limitações é de extrema relevância para profissionais de laboratórios químicos, farmacêuticos,
bioquímicos e outros. Assinale a alternativa que apresenta um importante diferencial deste sistema.
a) Necessidade de amostra volátil e termicamente estável.
b) A instrumentação é de fácil manipulação e não necessita mão de obra especializada.
c) Pode ser aplicada tanto para compostos orgânicos como inorgânicos.
d) As amostras podem ser líquidas, sólidas ou gasosas, iônicas ou covalentes, de baixa ou alta peso
molecular.
19. No cromatograma, a substância identificada pelo pico 1 (um) é tratada como uma substância que:
a) Está em maior concentração na amostra.
b) Está em menor concentração na amostra.
c) Há baixa interação com a fase estacionária.
d) Há baixa interação com a fase móvel.
20. Analise as proposições a respeito a seguir, justificando as falsas:
( v ) A cromatografia com fase estacionária de troca iônica é mais adequada para compostos polares.
( v ) A fase estacionária de exclusão molecular é sempre aplicada paraespécie de baixa massa molar.
( v ) Uma das vantagens da cromatografia líquida sobre a cromatografia gasosa é a possibilidade de
separar termicamente instáveis.
( v ) Na cromatografia por partição de fase normal, a fase estacionária é apolar e a fase móvel deve ser
polar,
21- A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas empregadas nas análises toxicológicas. Indique
a alternativa que NÃO se apresenta como vantagem na aquisição deste equipamento.
a) A boa sensibilidade
b) A versatilidade
c) A alta resolução
d) Os resultados qualitativos
e) O baixo custo de aquisição do equipamento
22) Entre as misturas de solventes relacionadas abaixo, qual é aquela que apresenta maior polaridade (em
relação à polariade da sílica)?
a) CH2Cl2: hexano (40:60)
b) MTBE: hexano (2:98)
c) isopropanol:hexano (5:95)
23) Enumere e justifique os problemas associados à presença e/ou formação de bolhas de ar em sistemas
cromatográficos de alta eficiência (CLAE). Que alternativas existem para minimizar estes problemas?
R: A presença e/ou formação de bolhas de ar em sistemas cromatográficos de alta eficiência
(CLAE) podem causar vários problemas que afetam a qualidade da análise cromatográfica.
Aqui estão alguns dos problemas associados à presença de bolhas de ar em CLAE e as
alternativas para minimizá-los:
Problemas associados à presença de bolhas de ar em CLAE:
 Distúrbio do Fluxo: Bolhas de ar no sistema podem interromper o fluxo uniforme da fase
móvel, causando variações na taxa de fluxo. Isso pode levar a picos irregulares, tempos de
retenção imprecisos e perda de resolução.
 Redução da Sensibilidade: Bolhas de ar podem reduzir a sensibilidade do detector, uma
vez que o ar não é um bom condutor de sinais em comparação com a fase móvel. Isso
pode resultar em picos de baixa intensidade.
 Perda de Precisão e Reprodutibilidade: A presença de bolhas pode afetar a precisão e a
reprodutibilidade dos resultados cromatográficos, já que as condições de separação
podem variar de injeção para injeção.
 Degradação da Resolução: Bolhas de ar podem interferir na separação dos componentes,
reduzindo a resolução entre os picos cromatográficos.
Alternativas para minimizar problemas relacionados a bolhas de ar:
 Gaseificação da Fase Móvel: Utilizar um sistema de gaseificação para remover
eficazmente o ar dissolvido na fase móvel. Isso ajuda a minimizar a formação de bolhas
durante a passagem pela coluna.
 Filtragem da Fase Móvel: Filtrar a fase móvel antes de utilizá-la para garantir que esteja
livre de partículas que possam atuar como sítios de nucleação para a formação de bolhas.
 Evitar Injeções de Amostras Gasosas: Evitar injeções de amostras que contenham gases
dissolvidos, pois a introdução de gases na coluna pode resultar na formação de bolhas.
 Desgaseificação In Situ: Alguns sistemas de CLAE incluem módulos de degaseificação in
situ que removem o ar da fase móvel imediatamente antes da injeção na coluna.
 Injeção de Amostra Adequada: Certificar-se de que a injeção da amostra seja feita
corretamente, evitando a entrada de ar na coluna.
 Purga do Sistema: Realizar uma purga do sistema com fase móvel para eliminar bolhas
de ar antes de iniciar uma análise.
 Uso de Detectores Sensíveis: Utilizar detectores sensíveis que possam detectar com
precisão picos de baixa intensidade, mesmo na presença de bolhas.
 Monitoramento Visual: Durante a execução da análise, monitorar visualmente a linha de
base cromatográfica para identificar a presença de bolhas e, se necessário, interromper a
análise e corrigir o problema.
 Redução de Pressão: Reduzir temporariamente a pressão do sistema cromatográfico para
permitir a liberação de bolhas da coluna ou do detector.
 Manutenção Preventiva: Realizar manutenção preventiva regularmente no sistema
CLAE, incluindo a verificação e a limpeza de linhas e conexões para evitar o acúmulo de
bolhas.
A minimização da formação e da presença de bolhas de ar é crucial para obter resultados
cromatográficos confiáveis e de alta qualidade em sistemas de CLAE. A escolha das alternativas
adequadas depende das características específicas do sistema e da aplicação.
24) Quais as principais características (vantagens e limitações) das técnicas cromatográficas CLAE. Quais são
os cuidados necessários para utilização correta de um cromatógrafo líquido de alta eficiência?
R: As técnicas cromatográficas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) têm uma
série de características, vantagens e limitações. Além disso, a utilização correta de um
cromatógrafo líquido de alta eficiência exige cuidados específicos. Aqui estão as principais
características, vantagens, limitações e cuidados necessários relacionados à CLAE:
Características da CLAE:
Vantagens:
 Alta Sensibilidade: A CLAE é capaz de detectar e quantificar analitos em concentrações
muito baixas, o que a torna adequada para análises de traços.
 Alta Resolução: A CLAE oferece alta resolução e capacidade de separação, permitindo a
separação eficaz de compostos em amostras complexas.
 Rapidez: A CLAE é uma técnica rápida, o que é benéfico em laboratórios onde a análise
precisa ser realizada de maneira eficiente.
 Ampla Faixa de Aplicação: Pode ser usada para uma variedade de compostos químicos,
desde pequenas moléculas até biomoléculas, como proteínas e ácidos nucleicos.
 Versatilidade de Detectores: Existem muitos tipos de detectores disponíveis, incluindo
UV-Vis, fluorescência, espectroscopia de massa, condutividade, entre outros, permitindo a
detecção de diferentes tipos de analitos.
 Precisão e Reprodutibilidade: Quando operada corretamente, a CLAE oferece resultados
precisos e reprodutíveis.
Limitações:
 Custo Inicial e Manutenção: Equipamentos de CLAE podem ser caros, e a manutenção
adequada é necessária para garantir o desempenho consistente.
 Requisitos de Treinamento: É necessário treinamento para operar o equipamento e
interpretar os resultados corretamente.
 Requisitos de Solventes: Alguns métodos de CLAE podem exigir o uso de solventes
orgânicos, que podem ser caros e requerem descarte adequado.
 Interferências: Alguns componentes das amostras podem interferir nos resultados,
exigindo pré-tratamento ou métodos de separação adicionais.
 Requer Condições Ambientais Controladas: Variações de temperatura, umidade e
pressão podem afetar o desempenho da CLAE, portanto, é importante operá-la em
condições controladas.
Cuidados Necessários na Utilização de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência:
 Manutenção Regular: Realizar manutenção preventiva e calibração regularmente é
essencial para garantir o funcionamento adequado do equipamento.
 Escolha Adequada dos Parâmetros: Selecionar os parâmetros cromatográficos
apropriados, como a fase móvel, fase estacionária, taxa de fluxo e temperatura da coluna,
de acordo com a natureza da amostra.
 Preparação de Amostras: Preparar as amostras corretamente, garantindo que estejam
limpas, livres de partículas e na concentração apropriada.
 Sistema de Degaseificação: Utilizar um sistema de degaseificação para remover bolhas de
gás da fase móvel, o que ajuda a manter a precisão da análise.
 Boas Práticas de Laboratório: Seguir rigorosamente as boas práticas de laboratório
(BPL) para evitar contaminação cruzada, garantir a precisão dos resultados e manter a
segurança.
 Registro de Dados: Manter registros detalhados de todos os parâmetros do método
cromatográfico e dos resultados obtidos.
 Treinamento dos Operadores: Fornecer treinamento adequado aos operadores para
garantir que saibam como operar o equipamento e interpretar os resultados.
 Gerenciamento de Resíduos: Descartar solventes e resíduos de acordo com as
regulamentações ambientais e de segurança.
 Validação de Métodos: Validar os métodos de análise de acordo com as diretrizes
regulatórias aplicáveis, especialmente na indústria farmacêutica.
O uso correto da CLAE é fundamental para obter resultados confiáveis e de alta qualidade.
Portanto,é importante seguir as melhores práticas de operação e manutenção do equipamento.
25) Assinale a opção que se refere à característica que um método analítico tem de avaliar um dos componentes
de uma dada amostra sem sofrer a interferência dos demais componentes dessa matriz.
A) repetitividade
B) precisão
C) seletividade
D) linearidade
E) reprodutibilidade
26) Com relação à cromatografia líquida, assinale a opção correta.
a) Na chamada cromatografia com fase reversa, a fase estacionária é polar e a fase móvel é não polar.
b) Em alguns aspectos, a cromatografia líquida de alta eficiência é mais versátil do que a cromatografia
gasosa, por não estar limitada a amostras voláteis e termicamente estáveis.
c) A escolha de solventes na cromatografia líquida exerce um papel secundário, enquanto o controle
de temperatura é fundamental nas separações com o uso dessa técnica.
d) Essa técnica apresenta separações rápidas, porém de baixa resolução.
e) Apresenta medidas qualitativas precisas e medidas quantitativas não precisas.
27) Acerca da cromatografia líquida de exclusão por volume, assinale a opção correta.
a) Entre os seus principais usos, destaca-se a separação entre moléculas volumosas e moléculas menores.
b) As separações de espécies solúveis em água com solventes aquosos são denominadas cromatografia
com permeação em gel.
c) Nessa técnica, a separação ocorre pela interação molecular entre o soluto e a fase estacionária.
d) As fases estacionárias utilizadas nessa técnica são partículas à base de sílica.
e) Não é indicada para a separação de materiais poliméricos.
28) Uma amostra contém os quatro compostos a seguir. O composto que não poderá ser identificado por CLAE
com detecção por ultravioleta é:
a) I
b) II
c) III
d) IV
29) De acordo com a técnica de CLAE, é correto o uso de:
a) ultrassom para promover desgaseificação de solventes
b) bombas peristálticas para promoverem um fluxo pulsado e de baixa pressão
c) solventes com pureza analítica (P.A.) para impedir a contaminação da amostra
d) colunas mais longas do que as utilizadas na cromatografia gasosa para separar melhor as
substâncias
30. Indique a função de cada uma das partes que compõem um cromatógrafo líquido de alta eficiência ilustrados
na figura abaixo:
R: Bomba de HPLC: Responsável por fornecer a pressão necessária para a passagem da fase
móvel através da coluna cromatográfica.
 Injetor: Usado para introduzir a amostra líquida na coluna cromatográfica.
 Coluna cromatográfica: Onde ocorre a separação dos componentes da amostra com base
em suas características físico-químicas.
 Detector: Detecta e mede os componentes à medida que saem da coluna. Os tipos de
detectores podem variar, incluindo UV-Vis, fluorescência, espectroscopia de massa, entre
outros.
 Sistema de controle e software: Responsável por controlar os parâmetros do CLAE, como
a taxa de fluxo da fase móvel, a temperatura da coluna e a coleta de dados.
 Coletor de dados: Registra os dados gerados pelo detector, permitindo a análise e a
interpretação dos resultados.
 Fase móvel: Um solvente ou mistura de solventes que transporta a amostra através da
coluna cromatográfica.
 Fase estacionária: Um material dentro da coluna que interage seletivamente com os
componentes da amostra, permitindo a separação.
 Sistema de gaseificação: Remove bolhas de ar ou gases dissolvidos da fase móvel para
garantir uma operação estável e precisa.
 Filtro: Pode ser usado para remover partículas ou impurezas da fase móvel antes que ela
entre na coluna.
Esses são os principais componentes de um CLAE, e cada um desempenha um papel específico
na separação e análise dos componentes da amostra.
31. Qual a importância da CLAE para a indústria farmacêutica?
R:A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), também conhecida como HPLC
(High-Performance Liquid Chromatography), desempenha um papel crítico na indústria
farmacêutica devido à sua capacidade de separar, identificar e quantificar substâncias químicas
em amostras complexas de produtos farmacêuticos. A CLAE é uma técnica analítica versátil e
poderosa que oferece diversas vantagens e desempenha um papel fundamental na pesquisa,
desenvolvimento, produção e controle de qualidade na indústria farmacêutica.
 Análise de Qualidade: A CLAE é amplamente utilizada para a análise de
matérias-primas, produtos intermediários e produtos farmacêuticos finais. Ela permite a
detecção de impurezas, degradação de produtos e outros compostos indesejados que
podem afetar a qualidade e a segurança dos medicamentos.
 Identificação de Componentes: A CLAE é eficaz na identificação de componentes em
formulações farmacêuticas complexas, ajudando a confirmar a presença de ingredientes
ativos e auxiliares, bem como a avaliar a homogeneidade das formulações.
 Quantificação Precisa: A CLAE permite a quantificação precisa dos componentes em
uma amostra, o que é essencial para garantir que os produtos farmacêuticos atendam às
especificações de dosagem e concentração necessárias para a eficácia terapêutica.
 Controle de Qualidade: A CLAE é usada extensivamente para o controle de qualidade,
tanto em laboratórios de pesquisa quanto em instalações de produção farmacêutica. Ela
ajuda a garantir que os produtos farmacêuticos atendam aos padrões de qualidade
estabelecidos por agências regulatórias.
 Desenvolvimento de Métodos Analíticos: A CLAE é empregada no desenvolvimento de
métodos analíticos para novos produtos farmacêuticos, bem como para a otimização de
métodos existentes. Isso é fundamental durante a fase de pesquisa e desenvolvimento de
medicamentos.
 Estudos de Estabilidade: A CLAE é usada para realizar estudos de estabilidade, que são
necessários para determinar a vida útil dos produtos farmacêuticos e garantir que eles
permaneçam seguros e eficazes ao longo do tempo.
 Conformidade Regulatória: Agências regulatórias, como a Food and Drug
Administration (FDA) nos Estados Unidos e a European Medicines Agency (EMA) na
Europa, exigem que a CLAE seja usada em muitos aspectos do desenvolvimento e
controle de qualidade de produtos farmacêuticos. O cumprimento dessas
regulamentações é fundamental para a aprovação e comercialização de medicamentos.
 Rastreabilidade e Documentação: A CLAE fornece dados altamente rastreáveis e
documentados, o que é essencial para a documentação de processos de fabricação e o
cumprimento das diretrizes regulatórias.
Em resumo, a CLAE é uma ferramenta essencial na indústria farmacêutica para garantir a
segurança, qualidade e eficácia dos produtos farmacêuticos. Ela desempenha um papel
fundamental em todas as fases, desde a pesquisa e desenvolvimento até a produção e controle de
qualidade, sendo crucial para o cumprimento das regulamentações e para a proteção da saúde
pública.
32. Considerando o cromatograma por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) abaixo apresentado
indique a ordem de eluição dos compostos.
33. O alargamento dos picos é algo rotineiro na cromatografia líquida, quais os termos que estão relacionados
com o alargamento? Defina-os com a equação matemática.
R: O alargamento dos picos em cromatografia líquida é um fenômeno comum e pode ser causado
por vários fatores. Existem termos específicos relacionados ao alargamento dos picos em
cromatografia que descrevem diferentes aspectos desse fenômeno. Os termos relacionados com o
alargamento dos picos incluem:
 Dispersão longitudinal: A dispersão longitudinal refere-se ao alargamento dos picos ao
longo do eixo de fluxo da coluna cromatográfica. Isso ocorre devido a vários fatores,
incluindo a difusão molecular, a velocidade do fluxo, o empacotamento da coluna, entre
outros.
 Dispersão de banda de injeção: Esse termo descreve o alargamento dos picos devido à
introdução da amostra na coluna. Pode ser causada por injeções não precisas, geometria
inadequada do injetor, soluções amostras mal preparadas, entre outros fatores.
 Dispersão de banda extra-coluna: Esse tipo de dispersãoocorre fora da coluna
cromatográfica e pode ser causado por tubulações, conexões, volumes mortos, detectores,
entre outros elementos do sistema cromatográfico.
 Dispersão total: A dispersão total é a soma das dispersões longitudinal, de banda de
injeção e extra-coluna. Ela representa o alargamento total de um pico cromatográfico e
afeta a resolução e a capacidade de separação da cromatografia.
 Tempo morto (t0): O tempo morto é o tempo necessário para que um composto não retido
pela coluna (ou seja, que elui imediatamente) passe pelo detector. O tempo morto é
influenciado pela dispersão e é importante na determinação dos tempos de retenção de
compostos retidos.
 Desvio padrão do pico (σ ou sigma): O desvio padrão do pico é uma medida estatística do
alargamento do pico cromatográfico. Ele é frequentemente utilizado para quantificar o
grau de alargamento e a largura do pico.
 Eficiência da coluna: A eficiência da coluna descreve a capacidade da coluna de separar
os analitos de forma eficaz. Ela está relacionada ao alargamento dos picos, uma vez que
picos mais estreitos resultam em uma melhor eficiência cromatográfica.
O controle e a minimização do alargamento dos picos são essenciais para obter análises
cromatográficas de alta qualidade, com resolução adequada. Isso pode ser alcançado por meio
do uso de colunas de alta qualidade, otimização das condições cromatográficas, injeções precisas
e manutenção adequada do sistema cromatográfico. A compreensão dos termos relacionados ao
alargamento dos picos é fundamental para resolver problemas e melhorar a qualidade das
análises cromatográficas.
34. A separação cromatográfica é regida principalmente pelos fenômenos de adsorção, partição e exclusão por
tamanho molecular, qual a diferença entre esses fenômenos?
R:
Adsorção:
● Na cromatografia de adsorção, a separação é baseada na afinidade dos
componentes da amostra pela fase estacionária.
● A fase estacionária é geralmente um sólido poroso ou uma superfície
quimicamente modificada em um suporte sólido.
● Os componentes da amostra interagem de maneira diferente com a fase
estacionária com base em suas afinidades químicas. Os componentes que têm
maior afinidade com a fase estacionária são retidos por mais tempo, enquanto os
menos afinados se movem mais rapidamente pela coluna cromatográfica.
● Isso resulta em uma separação dos componentes da amostra com base em suas
interações de adsorção.
 Partição:
● Na cromatografia de partição, a separação é baseada na distribuição diferencial
dos componentes entre duas fases imiscíveis.
● As duas fases são a fase móvel (um líquido ou um gás) e a fase estacionária (um
sólido ou um líquido imobilizado em um suporte sólido).
● Os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases de acordo com sua
solubilidade em ambas. Componentes mais solúveis na fase estacionária passam
mais tempo nela, resultando em uma separação dos componentes com base em
suas solubilidades relativas nas duas fases.
 Exclusão por tamanho molecular:
● Na cromatografia de exclusão por tamanho, a separação é baseada no tamanho
das moléculas da amostra.
● A fase estacionária consiste em uma matriz porosa, como um gel, que permite que
moléculas menores penetrem na matriz e, portanto, têm maior tempo de retenção,
enquanto moléculas maiores são excluídas da matriz e eluídas mais rapidamente.
● Essa técnica é usada principalmente para separar macromoléculas, como
proteínas, polímeros e oligonucleotídeos, com base em seus tamanhos moleculares.
Portanto, a principal diferença entre esses fenômenos está na base de suas separações. A
adsorção depende da afinidade química entre os componentes e a fase estacionária, a partição
depende da solubilidade relativa nas fases móvel e estacionária, e a exclusão por tamanho
molecular depende do tamanho das moléculas na amostra. Cada técnica cromatográfica é
escolhida com base nas propriedades dos componentes a serem separados e nas necessidades
analíticas específicas.
35. Defina as principais características que os detectores precisam ter.
R:
Detectores são componentes críticos em cromatografia e em várias técnicas analíticas. Suas
principais características podem variar dependendo da técnica analítica específica, mas existem
algumas características gerais que são desejáveis em detectores. Aqui estão as principais
características que os detectores precisam ter:
 Sensibilidade: Os detectores devem ser capazes de detectar e medir quantidades muito
pequenas de analitos, muitas vezes em concentrações de traço. A sensibilidade é
fundamental para a detecção de compostos em baixas concentrações.
 
 Linearidade: Os detectores devem exibir uma resposta linear, o que significa que a
intensidade do sinal gerado deve ser diretamente proporcional à concentração do analito.
Isso permite que os resultados sejam quantificados com precisão.
 
 Seletividade: Os detectores devem ser seletivos para o analito de interesse, evitando a
interferência de outros compostos na amostra. A seletividade é essencial para a precisão e
a especificidade da análise.
 Faixa de detecção: Os detectores devem ser capazes de detectar uma ampla faixa de
concentrações de analito, desde concentrações muito baixas até concentrações mais
elevadas. Isso permite que a técnica seja aplicada em uma variedade de aplicações.
 Estabilidade: Detectores devem ser estáveis ao longo do tempo, exibindo pouca variação
na resposta ao longo das análises. A estabilidade é importante para a repetibilidade e a
reprodutibilidade dos resultados.
 Rapidez de resposta: Detectores devem ser capazes de fornecer resultados em tempo
hábil, especialmente em aplicações em tempo real. A rapidez de resposta é crucial em
aplicações de monitoramento em tempo real e controle de processos.
 Robustez: Detectores devem ser resistentes a variações ambientais e de condições de
operação. Eles devem funcionar de maneira confiável sob uma variedade de condições,
como temperatura, pressão e umidade.
 Facilidade de uso: Detectores devem ser fáceis de operar e calibrar. A facilidade de uso é
importante para minimizar erros operacionais e para garantir uma análise eficiente.
 Baixo ruído de fundo: Detectores devem gerar um sinal de baixo ruído de fundo, o que é
fundamental para melhorar a relação sinal/ruído e, portanto, a sensibilidade da detecção.
 Versatilidade: Alguns detectores podem ser utilizados em várias técnicas analíticas. A
capacidade de adaptar detectores a diferentes aplicações é uma característica desejável.
 Facilidade de manutenção: Detectores devem ser projetados de forma a facilitar a
manutenção, calibração e limpeza quando necessário, a fim de garantir o desempenho
consistente ao longo do tempo.
A escolha do detector depende da técnica analítica e das características da amostra a ser
analisada. Diferentes técnicas, como cromatografia líquida, cromatografia gasosa,
espectroscopia, entre outras, podem exigir detectores específicos que atendam aos requisitos de
cada aplicação.
36.
A separação eficiente dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos pireno e criseno (ver estruturas acima) deve
ser feita por cromatografia líquida de alta eficiência, usando uma coluna de
(a) fase estacionária reversa
(b) fase estacionária de exclusão de tamanho
(c) fase estacionária de troca iônica
(d) coluna para osmose reversa
(e) tubo capilar aberto
37. Na Cromatografia há um método em que a fase estacionária não é polar, e a fase móvel é polar. Neste
método a ordem de eluição ocorre com os solutos polares sendo eluídos antes dos solutos não-polares. Trata-se
da:
a) cromatografia com fase reversa.
b) cromatografia líquido-líquido normal.
c) cromatografia de troca iônica.
d) cromatografia de exclusão por volume.
e) cromatografia em camada delgada.
38. Na Cromatografia Líquida de alta eficiência, pode-se utilizar, durante a eluição da fase móvel, um único
solvente ou uma mistura de solventes que permanece constante durante todo o processo. Trata-seda:
a) eluição isocrática
b) eluição por gradiente
c) eluição apolar
d) eluição polar
e) eluição saturada
39) A maior vantagem do desenvolvimento de um método para um estudo de bioequivalência por cromatografia
líquida acoplada a espectometria de massas ao invés da cromatografia líquida acoplada ao detector de
ultravioleta é:
(a) diferenciar estereoisômeros.
(b) os analitos não necessitam possuir cromóforo.
(c) não necessita de estudos de estabilidade na validação.
(d) não necessita de curva de calibração em cada corrida analítica.
(e) não necessita de controles de qualidade em cada corrida analítica.
40) O sucesso de uma análise cromatográfica depende, fundamentalmente, da coluna escolhida conforme a
natureza das substâncias que se deseja determinar. As colunas de fase reversa são as mais utilizadas na
separação por CLAE. Não é correto afirmar, sobre as colunas de fase reversa, que:
(a) são colunas de fase ligada.
(b) a retenção pode ser aumentada, reduzindo a polaridade da fase móvel.
(c) a polaridade da fase móvel utilizada é alta.
(d) a amostra mais polar, elui mais rapidamente.
(e) as do tipo C18, C8 e C2 são exemplos.