PCR e diversos

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Biologia Molecular 
MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 
O ambiente de manipulação tem que ser 
DNA-free, para evitar contaminações com 
outros materiais genéticos. O risco é de 
contaminar a amostra, não o pesquisador. 
É necessário haver cuidado com pele, suor, 
saliva, pó de luva, etc. Por isso, as áreas de um 
laboratório são divididas em 3: 
Área 1 -> sala pré PCR: é a área mais limpa, 
onde ocorre a hidratação dos primers e a 
junção dos reagentes em um único tubo. 
Também tem controle de ar que sai. É onde 
esta o estoque dos materiais necessários para 
PCR (água, primers, DNTPs, cloreto de 
magnésio, Taq e tampão). É necessário cuidar 
para evitar o contato com produtos do PCR, 
DNA, inibidores e compostos. 
Área 2 -> sala do preparo das amostras: é a 
sala onde as amostras de RNA e DNA são 
preparadas e extraídas. É uma sala com mais 
controle, pois é necessário evitar 
contaminações. O controle do ar aqui passa 
por um filtro. É necessário ter cuidado com 
contato com a contaminação do material, e 
inibidores de reação e compostos que 
degradam ácidos nucleicos. 
Área 3 -> é a área pós-PCR, é a área onde 
ocorre a eletroforese no gel de agarose (em 
PCR convencional), onde o ar também é 
filtrado. É necessário cuidar com o isolamento 
para impedir a contaminação com os produtos 
do PCR. 
O uso de EPI’s é obrigatório, porém se cuidar 
com o pó da luva, uma vez que esse é 
contaminante. É necessário cuidar com a 
escolha, identificação, transporte e 
armazenamento da amostra. 
Alguns cuidados gerais como uso de ponteiras 
limpas, reagentes e buffers, água ultra-pura, 
além da limpeza de materiais e bancada. Para 
higienização, é necessário autoclavar, ou expor 
a luz UV. 
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 
Para extração do DNA, é necessário que 
ocorra: Lise celular, desnaturação da proteína, 
precipitação, recuperação e eluição. Antes da 
lise, normalmente se centrifuga a amostra 
para separação de proteínas ou material que 
não sera usado. 
LISE CELULAR -> é a primeira etapa, onde 
ocorre o rompimento da membrana celular 
com o uso de dodecil sulfato de sódio, 
lisozima ou triton, que degradam a membrana 
até o rompimento. 
DESNATURAÇÃO PROTEICA -> é usada 
principalmente para limpar a amostra das 
proteínas que degradam material genético, 
além de organelas e restos celulares. Se usa 
proteinases, fenol, clorofórmio, NaCl2. 
PRECIPITAÇÃO DO DNA -> é quando o DNA é 
separado em solução, normalmente usando 
etanol absoluto ou 70%, ou isopropanol. 
Quando o etanol age, o DNA precipita. 
 
RECUPERAÇÃO E ELUIÇÃO-> é onde se 
purifica e armazena o DNA extraído. Para isso, 
se usa tampão TE ou água destilada, onde o 
DNA fica a -20°C e o RNA a -80°C. 
 
Os métodos mais comuns são fenol 
clorofórmio, chelex, extração em fase solida. 
TRIZOL 
O trizol é uma solução eficaz para extração, 
que rompe as membranas e proteínas, 
liberando o acido nucleico para isolamento e 
purificação. 
 
Na fase aquosa, é onde ficam as moléculas 
polares como o DNA. Na intermediaria, se 
encontra o DNA. Na orgânica, por fim, se 
encontra o fenol e o clorofórmio, junto com 
proteínas, lipídios e açucares. 
 
 
FENOL-CLOROFÓRMIO 
O método do fenol-clorofórmio se usa de 
componentes orgânicos para separação do 
DNA. Os NA tem carga negativa, então se 
solubilizam em ambientes aquosos, enquanto 
as proteínas são solúveis em solutos orgânicos. 
 
O fenol é colocado na solução e centrifugado, 
onde ocorre a separação. O fenol desnatura as 
proteínas, o clorofórmio também, e estabiliza 
a interface da célula, e o álcool isoamilico 
previne as espumas e retem proteínas. 
Quando ocorre a separação, o DNA é coletado 
e precipitado com etanol. O excesso de sal é 
lavado, e se armazena DNA normalmente. 
 
Uma das vantagens do fenol-clorofórmio é o 
isolamento em apenas uma etapa, porém é 
mais eficiente para RNA, além de ser toxico e 
dependente do pH, e mais trabalhoso. 
SALTING OUT 
Usa o pH baixo com um alto teor de sal para 
precipitação de proteínas, deixando o DNA em 
solução. O DNA é precipitado normalmente. 
 
CHELEX 
O chelex é uma resina de intercambio iônico 
que se liga a componentes celulares enquanto 
o DNA/RNA permanece em solução aquosa. 
 
É um método rápido e simples, de baixo 
custo. Mas se ficar estocado por longos 
períodos, ocorre degradação do NA, além da 
resina inibir a PCR em alguns casos. 
COLUNA DE SÍLICA 
Inicia com a lise, e centrifuga, para o DNA ir 
para sílica. Se faz a desnaturação, e 
novamente a centrifugação. O DNA vai ser 
precipitado com etanol, e colocado água ultra 
pura pra eluir o DNA. 
Até por o tampão e a água, o DNA ta na sílica, 
após isso, ele ta no líquido. 
CARTÕES FTA 
 
A extração pode ser inibida por sangue, urina, 
meios de cultura e etc. A amostra deve ser 
conservada em tampão, congelada a -20°C. O 
RNA deve ser conservado a -80°C, em água 
ultrapura. 
É usado espectofotometria para determinar a 
qualidade do DNA, onde se ve a detecção de 
contaminantes. 
O DNA extraído se analisa na eletroforese 
com uso de corantes. 
 
PCR CONVENCIONAL 
A PCR tem três ciclos: desnaturação, 
anelamento e extensão. 
DESNATURAÇÃO -> é onde ocorre a 
separação da dupla fita, geralmente a 95°C. 
 
ANELAMENTO -> reduz a temperatura para 
60°C, e os primers se anelam nas fitas 
simples para posteriormente fazer a extensão. 
 
EXTENSÃO -> eleva novamente a temperatura 
para 72°C, que é ideal para Taq Polimerase. A 
Taq sintetiza a nova cadeia de DNA. 
 
O ciclo se repete cerca de 40x. 
IPC -> no RNA, é necessário fazer um DNA 
complementar com a transcriptase reversa, 
pois a PCR só é feita com dupla fita. 
COMPONENTES DO MIX PCR 
DNA ALVO -> DNA que se quer pesquisar 
MIX -> o mix contém os primers, DNTPs, Taq 
polimerase, MgCl2 (cofator da Taq), água 
ultrapura e tampão da polimerase. 
Alguns primers podem se ligar em sequencias 
entre si, formando artefatos chamados de 
dímeros. 
O tampão é usado para manter o pH, 
estabilizar enzimas, prevenir degradação do 
DNA, ajustar as temperaturas. 
CONTROLES -> O controle positivo mostra 
que a enzima está ativa e o mix esta 
funcional 
O controle negativo mostra que o mix não 
está contaminado 
O controle interno demonstra que o PCR está 
correndo, e é importante para falsos positivos 
ou negativos. 
CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO -> É feito 
com controle físico, em separação das áreas, 
uso de EPIs, fluxo de ar, luz UV, para eliminar 
contaminantes e inibidores da PCR. 
ELETROFORESE 
Gel de agarose usado para correr as amostras, 
com carga elétrica, onde o DNA vai do cátodo 
para o ânodo. As moléculas se movem por 
tamanho, ou seja, as maiores ficam mais 
próximas do inicio. 
AMPLICON -> segmento de DNA que foi 
amplificado no PCR. 
 
 
 
O tampão de eletroforese é usado para criar 
um ambiente de migração das moléculas, com 
pH estável e controlado. 
Tampão de corrida influencia na migração e 
qualidade da eletroforese. 
A eletroforese tem um marcador de peso 
molecular, que serve como uma régua para 
ver os tamanhos das moléculas. 
O tampão de carregamento é misturado com 
as amostras antes de serem carregadas no 
gel, aumentando a densidade da amostra, 
adicionando cor e monitoramento. 
TRANSILUMADOR -> usado para visualizar o 
gel de agarose na eletroforese, pois o gel 
contém moléculas fluorescentes. O aparelho 
emite luz UV e faz com que as moléculas 
brilhem, para visualização.