AULA PRÁTICA ESPERMOGRAMA

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ESPERMOGRAMA
Orientações aula prática
COLETA 2 A 5 DIAS DE ABSTINÊNCIA
Opalescente - gelificado
liquefeito
Até 60 min 37˚ C
CITOLOGIA: 
Vitalidade
Concentração
Motilidade
Morfologia
COLETA
COLETA 2 A 5 DIAS DE ABSTINÊNCIA
Opalescente - gelificado
liquefeito
Até 60 min 37˚ C
Viscosidade
Viscosidade aumentada
Quebra do fio em até 2cm
Ideal:
Viscosidade diminuída- gotejando
Volume
pH
ANÁLISE MACROSCÓPICA:
liquefeito
2. Vitalidade
Ideal:
AVALIAÇÃO CITOLÓGICA 
ANÁLISE MICROSCÓPICA:
1. Motilidade
3. Concentração
4. Morfologia
A amostra (esperma) é sempre processada a fresco sem técnicas de concentração.
EXCETO: EM CASO DE AZOSPERMIA É REALIZADA A CENTRIFUGAÇÃO DO ESPERMA PARA CONFIRMA A AUSÊNCIA DE ESPERMATOZOIDES
1. Motilidade
Precisam ser os primeiro pois o tempo de ejaculado compromete a motilidade e a vitalidade
1 gota de semen entre lâmina e lamínula – 20X ou 40X
Cuidar para o material estar a 37ºC
Examinar 200 espermatozoides ou 5 campos
Grupo A (progressão linear rápida) é considerado o melhor por ter a maior chance de fertilizar o óvulo. 
Velocidade ≥ 20µM/segundo (equivale a ½ do lado de um quadrante pequeno do quadrante central/segundo)
Grupo B (progressão linear lenta) é também considerado bom e deve estar em uma proporção que somado ao tipo A, totalize 32% segundo parâmetros atuais, menos rigorosos que os 50% de A+B exigidos anteriormente. 
De 5 a 20µM/ segundo
Grupo C (motilidade não progressiva) tem menor chance de fertilização mas, ainda assim, tem chance. São considerados “espermatozóides móveis” o somatório dos grupos A, B e C que antes deveriam totalizar 60% e hoje somente 40%. 
Grupo D é totalmente imóvel e incapaz de fertilizar o óvulo.
A / B
C
https://youtu.be/UtTwVUwu_2g
Veja o vídeo pelo link abaixo:
Obseve os tipos de motilidade
Vivos – membrana íntegra: L - cabeça branca ou rosa claro
Mortos (membrana lesada): D1 e D2 - Cabeça rosa escuro ou vermelha, 
	Vitalidade (OMS 2010)
	≥ 58 % de sptz vivos
Fundamento: as células mortas apresentam membranas lesadas que permitem a penetração dos corantes
Preparo da amostra – imediatamente após liquefação
100µL de sêmen + 100µL de eosina 1% (homogeneização 30 seg.) + 200µL de nigrosina 10% (homogeneização 45 seg.)
Fazer esfregaço, reservar até secar e ler em 100X
Contar 200 células por lâmina, identificando vivas (não coradas) e mortas (coradas).
2. Vitalidade
Fundamento: as células mortas apresentam membranas lesadas que permitem a penetração dos corantes
Fazer 2 lâminas
Complementar da vitalidade
Realizado quando não é indicado a coloração – p.e FIV
Os sptz são expostos a solução hipotônica (citrato de sódio e frutose) e os vivos estarão com a cauda edemaciada
OMS 2010 ≥ 58% DE EDEMACIADOS
TESTE HIPOSMÓTICO
3. Concentração
No momento de avaliar a motilidade, observar quantos espermatozoides por campo para direcionar a diluição da amostra
Após preparo da amostra (diluir ou não)
Preparar a câmara de neubauer
CONTAGEM GLOBAL DOS ESPERMATOZÓIDES
 a) EXAME A FRESCO: Durante a contagem global, pode-se observar as células normais e anormais. 
Diluição 1:20: Diluir com liquido diluidor . 
Usar 0,4 ml de líquido diluidor e uma pipeta de hemoglobina do líquido seminal.
 CONTAGEM: É feita na câmara de Neubauer no reticulo usado para a contagem de eritrócitos. 
Conta-se 5 grupos de quadrados que correspondem a 80 quadrinhos 5x16 = 80. 
80 quadrinhos correspondem a 1/5 de 0,1mm³ de líquido (400 quadrinhos) multiplica-se por 5. Como a diluição foi a 1:20 e o resultado é expresso em nº de células por cm³ ou mL, multiplica-se por 20.000. 
 
REGRA PRATICA: Total de células nos 5 grupos de quadrados multiplicado por 1.000.000 (106)
Formalina
Renata perdomo (Rp) - 
Câmara de Neubauer – amostra diluída 1:20
 Área total de contagem: 0,2 mm2
 Profundidade: 0,1 mm
 Transformação mm3/mL: x 1000 
Nº de SPTZ = total de sptz x 1/p x D x 1/a x 1000
Nº de SPTZ = total de sptz x 10 x 20 x 5 x 1000
Nº de SPTZ/mL = total de sptz x 1.000.000 (106)
Nº de SPTZ/total = total de sptz contados x volume de sêmen
Contagem de SPTZ
	Concentração /mL (OMS 2010) 	≥ 15 milhões/mL
	Concentração / total (OMS 2010)	≥ 39 milhões
Volume: a x p (cada 1 dos 9 quadrado)
V: 0,1mm x 0,2 mm2
V= 0,1 mm3
Aumento de 400 X
Dividida em 25 quadrados, cada quadrado maior (dividio por linha tripla) tem 16 quadrados pequenos.
Contar apenas as cabeças dos espermatozóides. Fixar um L nos quadrados e contar os que estiverem com a cabeça em cima da linha do L e os de dentro do quadrado.
Contar 5 quadrados (um de cada canto e o do meio).
Cálculo da concentração:
Diluição 1:20= Nx5x20x10.000 = N X 106 / mL
Técnica 1 – OMS 2010
Número de quadrados contados
diluição
Conversão de 0,1mm3 para ml
Profundidade (0,1)X área contada (1mm2 )
14
São contados apenas os espermatozóides maduros, com cauda.
Procedimento: fazer duas diluições em um tubo de hemólise, homogeneizar e preencher a Câmara de Neubauer, contando nos 4 quadrantes laterais da câmara – nos 2 retículos.
1:20 - 20 ml de sêmen + 0,4 ml do líquido diluidor
Resultado da contagem multiplica por 50.000
1:200 - 20 ml de sêmen + 4,0 ml do líquido diluidor
Resultado da contagem multiplica por 500.000
Resultado final: média aritmética entre as duas contagens.
Se der >10% de variação entre os retículos, contar novamente
Tecnica 2 - usando quadrantes laterais
Incluem: células epiteliais, espermátides e leucócitos
Diluição 1:20 
Contar no quadrado central inteiro (25 quadrados)
Se > 1milhão/mL: fazer teste de Endtz
Determinação de neutrófilos e outros PMN (granulócitos)
O elevado número de células de defesa no ejaculado leva a uma diminuição da motilidade espermática e uma alteração na estrutura e função do espermatozóide, dificultando o processo de fertilização.
Contagem de células redondas
Lâmina e lamínula
100µL de sêmen + 100µL de solução de uso de peroxidase,
Agitar em agitador magnético 
Aguardar 8 minutos
Colocar 1 gota sobre a lâmina e cobrir com lamínula
Anotar a % de células peroxidase positivas (40X)
Coradas em rosa (peroxidase negativa)= células epiteiais, espermatócitos, monócitos, linfócitos e eosinófilos
Coradas em marrom (peroxidade positiva)= neutrófilos 
Técnica de Endtz – identifica leucócitos
Peroxidase negativa
Peroxidase positiva
Contagem global de leucócitos 
 Nº de Leuc. = total de Leuc. x 1/p x 1/a x D X 1000 (a=4)
 Nº de Leuc. = total de Leuc x 10 x 0,25 x 20 x 1000
 Nº de Leuc./mL = total de Leuc. X 50.000
 VN: até 1.000.000/mL ou 1000/mm3
 4. Contagem global de eritrócitos
 Nº de hm = total de hm x 1/p x 1/a x D x 1000 (a=0,2)
 Nº de hm = total de hm x 10 x 5 x 20 x 1000
 Nº de hm/mL = total de hm x 1.000.000
 VN: até 1.000.000/mL ou 1000/mm3
Citologia - outros
A contagem de leucócitos e hemácias é realizada nos 4 quadrantes laterais da Câmara de Neubauer, na ocasião da contagem de espermatozóides. 
Procedimento: o procedimento é o mesmo para contar leucócitos/hemácias em Hematologia. Na diluição 1:20, multiplica-se o resultado por 50. O valor é expresso em mm³. 
Valor Normal de Leucócitos: até 1.000/mm³ 
Valor Normal de Hemácias: até 1.000/mm³ 
Leucospermia: valor de leucócitos acima de 1.000/mm³ 
➢ Eosinofilia de até 25%: processos auto-imunes; 
➢ Neutrofilia: prostato-vesiculites agudas; 
➢ Linfócitos e Monócitos: processos crônicos; 
Eritrospermia (sem alteração da cor do sêmen) e Espermorragia (sêmen cor hemorrágica): processo infeccioso em atividade, neoplasias ou sinal precoce de hipertensão arterial sistêmica 
CONTAGEM GLOBAL DE LEUCÓCITOS E HEMÁCIAS
4. Morfologia
Preparação da lâmina:
Avalia alterações de cada parte do espermatozoide:
Cabeça
Peça intermediária
Cauda
Material:
Lâmina, extensora e sêmen in natura, coloração hematológica
4. Morfologia
Critérios de classificação
Morfologia espermática pelo critério da O.M.S. : o espermatozóide humano é classificado usando-se microscópio óptico, após coloração especial.Neste sistema os espermatozóides são classificados como 
normais (ovais), 
amorfos, 
bicéfalos, 
megalocéfalos, 
afilados, 
defeitos de peça intermediária, 
defeitos de cauda, etc. 
É um sistema que aceita pequenas irregularidades no espermatozóide. É um critério mais relaxado, mas não menos importante. Pode ajudar a identificar defeitos na espermatogênese, típicos de algumas doenças. Valor normal: 30%.
 
Morfologia espermática pelo critério estrito de Kruger: critério rigoroso de classificação, onde são contados 200 espermatozóides e aqueles potencialmente normais são mensurados com uma régua (micrômetro). Diversas medidas são realizadas em cada espermatozóide, que é classificado como normal (oval) ou anormal. Talvez seja o parâmetro mais importante de toda a análise seminal, e correlaciona-se com diversos testes de função espermática. É considerado normal quando a cabeça tem comprimento de 5 - 6µm. e espessura de 2,5 - 3,5µm, configuração oval, lisa, regular e com região acrossômica entre 40 - 70% da área da cabeça do espermatozóide. As cabeças fora do padrão são consideradas anormais. Não deve haver nenhum defeito no pescoço, peça intermediária ou cauda. Valor normal: 14%. Abaixo de 4% correlaciona-se com pior prognóstico e entre 5-13% - poderão ser realizados testes de função espermática, avaliados caso a caso.
 
4. Morfologia
microcéfalo
macrocéfalo
bífido
bicéfalo
amorfos
Alteração de peça intermediária
Morfologia
Algumas alterações na seta vermelha
Maioria normal
Lavf57.83.100
 
Espermatozóide oval normal 
dimensão 5.0 x 3.5 um Cabeça muito grande Cabeça arredondada 
 
Cabeça de formato alterado Cabeça irregular 
Espermatozóide com cabeça mais 
fina (alongada) 
 
Espermatzóide com forma de fita 
Espermatzóide com 
formato de pêra Região acrossômica grande 
 
Espermatozóide 
oval normal 
dimensão 5.0 x 
3.5 um 
Cabeça muito 
grande 
Cabeça 
arredondada