Livro-Texto -Unidade I biomedicina integrada

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Autora: Profa. Marília Tavares Coutinho da Costa Patrão
Colaboradores: Prof. Flávio Buratti Gonçalves
 Prof. Luiz Henrique Cruz de Mello
Biomedicina Integrada
Professora conteudista: Marília Tavares Coutinho da Costa Patrão
Doutora (2009) e mestra (2005) em ciências, com ênfase em Farmacologia, pela Universidade Federal de São 
Paulo (Unifesp) e licenciada em Química pelas Faculdades Oswaldo Cruz (2011). Graduada em 2002, pela Unifesp, em 
ciências biológicas – modalidade médica. É professora titular da Universidade Paulista (UNIP) desde 2010 nos cursos de 
Biomedicina, Enfermagem e Nutrição. Também ministrou Farmacologia para o curso de Medicina do Centro Universitário 
São Camilo (2010-2011). Atua como coordenadora-auxiliar do curso de Biomedicina da UNIP desde 2011. Na mesma 
instituição, foi membro do Comitê de Ética no período de 2011 a 2017 e, desde 2012, atua na Comissão de Qualificação 
e Avaliação de Cursos (CQA).
© Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou 
quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem 
permissão escrita da Universidade Paulista.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
P314b Patrão, Marília Tavares Coutinho da Costa.
Biomedicina Integrada / Marília Tavares Coutinho da Costa 
Patrão. – São Paulo: Editora Sol, 2023.
136 p., il.
Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e 
Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230.
1. Hematologia. 2. Microbiota. 3. Nanobiotecnologia. I. Título.
CDU 61
U517.09 – 23
Profa. Sandra Miessa
Reitora
Profa. Dra. Marilia Ancona Lopez
Vice-Reitora de Graduação
Profa. Dra. Marina Ancona Lopez Soligo
Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa
Profa. Dra. Claudia Meucci Andreatini
Vice-Reitora de Administração e Finanças
Prof. Dr. Paschoal Laercio Armonia
Vice-Reitor de Extensão
Prof. Fábio Romeu de Carvalho
Vice-Reitor de Planejamento
Profa. Melânia Dalla Torre
Vice-Reitora das Unidades Universitárias
Profa. Silvia Gomes Miessa
Vice-Reitora de Recursos Humanos e de Pessoal
Profa. Laura Ancona Lee
Vice-Reitora de Relações Internacionais
Prof. Marcus Vinícius Mathias
Vice-Reitor de Assuntos da Comunidade Universitária
UNIP EaD
Profa. Elisabete Brihy
Profa. M. Isabel Cristina Satie Yoshida Tonetto
Prof. M. Ivan Daliberto Frugoli
Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar
 Material Didático
 Comissão editorial: 
 Profa. Dra. Christiane Mazur Doi
 Profa. Dra. Ronilda Ribeiro
 Apoio:
 Profa. Cláudia Regina Baptista
 Profa. M. Deise Alcantara Carreiro
 Profa. Ana Paula Tôrres de Novaes Menezes
 Projeto gráfico:
 Prof. Alexandre Ponzetto
Revisão:
 Kleber Souza
 Aline Ricciardi
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BIOMEDICINA INTEGRADA
Biomedicina Integrada
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................9
INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................9
Unidade I
1 MALDI-TOF-MS (MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION 
TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY) .................................................................................................. 11
1.1 Métodos clássicos de identificação de microrganismos ...................................................... 12
1.2 Fundamentos da técnica de Maldi-Tof ........................................................................................ 16
1.2.1 Adição da amostra ao equipamento e irradiação ..................................................................... 18
1.2.2 Aceleração e passagem pelo tubo de voo .................................................................................... 19
1.2.3 Obtenção do espectro de massas ..................................................................................................... 19
1.2.4 Determinação da susceptibilidade a antimicrobianos por Maldi-Tof ............................... 20
1.3 O uso do Maldi-Tof na identificação de partículas virais .................................................... 21
1.4 Outros usos do Maldi-Tof ................................................................................................................. 22
2 NOVAS TECNOLOGIAS EM HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA ......................................................... 23
2.1 Rotina do setor de hematologia clínica ...................................................................................... 24
2.2 Avanços no setor de hematologia clínica .................................................................................. 26
2.2.1 Citometria de fluxo ................................................................................................................................ 26
2.2.2 Laboratório modular de hematologia ............................................................................................ 28
2.3 Novos parâmetros hematológicos ................................................................................................ 30
2.3.1 Contagem automatizada de granulócitos imaturos (IG) ........................................................ 30
2.3.2 Contagem de plaquetas reticuladas (IPF) ..................................................................................... 32
2.3.3 Conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos (RET-He) ........................................................... 33
2.4 Técnicas de biologia molecular aplicadas ao diagnóstico 
das hemoglobinopatias ............................................................................................................................. 34
3 MICROARRANJOS DE DNA (MICROARRAYS) ....................................................................................... 35
3.1 Fundamentos dos ensaios com microarranjos de DNA ........................................................ 36
3.1.1 Fabricação das sondas de DNA ......................................................................................................... 37
3.1.2 Processamento da amostra biológica ............................................................................................. 38
3.1.3 Hibridização do cDNA às sondas ...................................................................................................... 39
3.1.4 Análise e interpretação dos resultados .......................................................................................... 39
3.2 Tipos de microarranjos ....................................................................................................................... 40
3.3 Aplicação dos ensaios com microarranjos na pesquisa e no diagnóstico .................... 42
3.3.1 Uso dos microarranjos de DNA na pesquisa ................................................................................ 43
3.3.2 Uso dos microarranjos de DNA no diagnóstico .......................................................................... 44
Sumário
6
Unidade I
4 O SISTEMA CRISPR/CAS9 ............................................................................................................................. 46
4.1 Fundamentos do uso do sistema Crispr/Cas9 na edição do DNA .................................... 47
4.1.1 O sistema Crispr em bactérias ........................................................................................................... 47
4.1.2 Sistema Crispr/Cas9 aplicado à edição do DNA de células eucarióticas .......................... 51
4.2 Potenciais usos do sistema Crispr/Cas9 ...................................................................................... 53
4.3 Aspectos éticos relacionados ao uso do sistema Crispr/Cas9 como 
ferramenta de edição do DNA ................................................................................................................56
Unidade II
5 CIÊNCIAS ÔMICAS: EXOMA E METABOLOMA ...................................................................................... 66
5.1 Exoma ........................................................................................................................................................ 67
5.1.1 Estrutura básica do gene ..................................................................................................................... 67
5.1.2 Métodos de investigação do exoma e indicações do exame ................................................ 69
5.2 Metaboloma ........................................................................................................................................... 71
5.2.1 Vias metabólicas ...................................................................................................................................... 71
5.2.2 Métodos de investigação do metaboloma ................................................................................... 73
5.2.3 Aplicações da metabolômica ............................................................................................................. 75
6 MICROBIOMA ................................................................................................................................................... 76
6.1 Principais espécies de bactérias que colonizam o intestino humano 
e suas funções ............................................................................................................................................... 77
6.1.1 Desenvolvimento da microbiota humana .................................................................................... 78
6.1.2 Principais espécies de bactérias presentes na microbiota intestinal ................................. 78
6.1.3 Ácidos graxos de cadeia curta ........................................................................................................... 79
6.2 A disbiose e o desenvolvimento de doenças ............................................................................. 80
6.2.1 A microbiota e as doenças intestinais ............................................................................................ 81
6.2.2 A microbiota e as alergias ................................................................................................................... 81
6.2.3 A microbiota e a diabetes mellitus tipo 2 ..................................................................................... 83
6.2.4 A microbiota e o câncer ....................................................................................................................... 84
6.2.5 A microbiota e os transtornos do sistema nervoso central ................................................... 84
6.2.6 A microbiota e a Covid-19 .................................................................................................................. 88
6.2.7 Estratégias para correção da microbiota....................................................................................... 89
6.3 Métodos de estudo do microbioma humano ........................................................................... 91
6.3.1 Metagenoma ............................................................................................................................................ 92
6.3.2 Metatranscriptoma, metaproteoma e metaboloma ................................................................. 93
7 NANOBIOTECNOLOGIA .................................................................................................................................. 95
7.1 Processos de produção e tipos de nanomateriais ................................................................... 97
7.2 Aplicações da nanobiotecnologia ................................................................................................101
7.2.1 Nanocosméticos ....................................................................................................................................101
7.2.2 Nanomedicina ........................................................................................................................................102
7.2.3 Nanofármacos ........................................................................................................................................102
7.2.4 Nanotecnologia aplicada à microscopia .....................................................................................103
7.2.5 Nanopartículas de prata ....................................................................................................................104
7.3 Nanotoxicologia ..................................................................................................................................105
7
BIOMEDICINA INTEGRADA
8 IMUNOTERAPIA CONTRA O CÂNCER .....................................................................................................106
8.1 História da imunoterapia ................................................................................................................106
8.2 Resposta imune contra os tumores ............................................................................................108
8.3 Principais fármacos utilizados na imunoterapia contra o câncer ..................................112
8.3.1 Terapias baseadas em anticorpos ...................................................................................................112
8.3.2 Interleucina-2, interferons e outras citocinas .......................................................................... 114
8.3.3 Vacinas contra o câncer ..................................................................................................................... 114
8.3.4 Terapia de células CAR-T ....................................................................................................................115
8.3.5 Vírus oncolíticos ....................................................................................................................................117
8
9
APRESENTAÇÃO
A evolução das sociedades humanas sempre esteve intimamente ligada ao desenvolvimento de novas 
tecnologias. No mundo moderno, essas tecnologias são obtidas a partir da observação, identificação, 
pesquisa e explicação metódica e racional dos fenômenos e fatos, ou seja, a partir da ciência.
Entender o avanço da ciência é, portanto, essencial para compreendermos como utilizar diferentes 
ferramentas em prol da melhoria da qualidade de vida da população. Nesse contexto, a disciplina de 
Biomedicina Integrada tem como objetivo apresentar os principais avanços tecnológicos na área da saúde.
Ao longo do livro-texto, vamos apresentar novas técnicas laboratoriais utilizadas nos campos da 
biologia molecular, microbiologia, imunologia, farmacologia e hematologia.
Antes da exibição de cada técnica, será feita uma breve revisão dos conteúdos trabalhados durante 
o curso de Biomedicina. Em seguida, vamos discutir suas principais vantagens e desvantagens.
Esperamos que, a partir dos conhecimentos adquiridos com a leitura deste livro-texto, você se sinta 
motivado a buscar atualização contínua sobre os temas de relevância para sua atuação profissional.
Bons estudos!
INTRODUÇÃO
Este livro-texto é dividido em duas unidades. Em cada uma delas, são apresentados quatro temas 
principais, que versam sobre as mais recentes evoluções no campo das análises clínicas, da biologia 
molecular, das ciências ômicas, da nanobiotecnologia e do tratamento do câncer. Esses temas estão 
distribuídos da seguinte maneira:
Na unidade I, são abordados os assuntos relacionados ao diagnóstico clínico e molecular de 
diferentes patologias, além de uma nova técnica, ainda experimental, de edição do DNA, conforme 
detalhado a seguir.
• Tópico 1: avanços no diagnóstico microbiológico proporcionado pela técnica de Maldi-Tof.
• Tópico 2: novas técnicas associadas aos laboratórios de hematologia clínica e hemoterapia.
• Tópico 3: usodos microarranjos de DNA no diagnóstico de doenças genéticas e do câncer.
• Tópico 4: avaliação crítica do uso do sistema Crispr/Cas9 na edição do DNA.
Na unidade II, a aplicação prática de diferentes tecnologias é discutida. O uso das ciências ômicas, 
da nanobiotecnologia e da imunoterapia na promoção da saúde é a principal tônica.
10
• Tópico 5: importância da avaliação do metaboloma e do exoma para entendimento dos diferentes 
aspectos do processo saúde-doença.
• Tópico 6: importância do microbioma na manutenção da homeostase.
• Tópico 7: principais produtos da nanobiotecnologia e seu uso em diferentes áreas.
• Tópico 8: novos agentes utilizados no contexto da imunoterapia contra o câncer.
É importante complementar sua formação com a leitura de artigos científicos sobre o tema. Vários 
desses artigos são apresentados ao final do livro e estão disponíveis para download.
Vamos iniciar nossa jornada?
11
BIOMEDICINA INTEGRADA
1 MALDI-TOF-MS (MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION TIME-OF-FLIGHT 
MASS SPECTROMETRY)
O Maldi-Tof-MS, ou simplesmente Maldi-Tof, é uma técnica de análise proteômica que possibilita 
diferenciar as espécies de microrganismos contidas em uma amostra.
 Observação
Conforme Morales (2020), a tradução de matrix-assisted laser 
desorption/ionization time-of-flight mass espectrometry (Maldi-Tof-MS) 
para o português é ionização/dessorção a laser assistida por matriz 
acoplada à espectrometria de massa por tempo de voo.
Ele foi criado para reconhecer moléculas no âmbito da química, mas, a partir de 1975, também 
passou a ser utilizada para identificar diferentes espécies de bactérias no campo da pesquisa básica 
(ANHALT; FENESLAU, 1975).
Nos últimos anos, diversos protocolos foram padronizados para viabilizar seu uso na rotina do 
laboratório clínico de microbiologia. Nesse contexto, o Maldi-Tof mostrou ser uma ferramenta capaz de 
otimizar o diagnóstico de doenças causadas por microrganismos. Vamos entender qual a importância 
dessa técnica e por que ela veio revolucionar o diagnóstico das doenças infecciosas?
O setor de microbiologia do laboratório de análises clínicas baseia-se na identificação dos 
microrganismos contidos em amostras biológicas e na avaliação do seu perfil de susceptibilidade aos 
antibióticos. Em geral, os ensaios laboratoriais classicamente realizados são:
• A determinação do perfil metabólico do microrganismo, a partir do cultivo do material biológico 
infectado em diferentes meios seletivos e da realização de provas complementares.
• A identificação direta, ao microscópio, após colorações específicas, como, por exemplo, a coloração 
de Gram.
• O antibiograma, que é a análise do crescimento de colônias de microrganismos em meios de 
cultura na presença de antibióticos.
Unidade I
12
Unidade I
• Os ensaios moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que visam a identificação de 
genes que auxiliam na classificação do microrganismo, na determinação do seu perfil metabólico 
e na detecção dos mecanismos de resistência microbiana.
Tais técnicas são, no geral, efetivas, mas também trabalhosas e demoradas. Alguns protocolos 
demoram dias ou até semanas para serem finalizados! É nesse contexto que entendemos o porquê de o 
Maldi-Tof ter se mostrado uma ferramenta valiosa no diagnóstico das infecções bacterianas e fúngicas. 
Além de apresentar alta sensibilidade e especificidade, a técnica possibilita a diminuição das etapas 
experimentais, o que se traduz em resultados mais rápidos e confiáveis. Afinal, a partir do início do 
ensaio, os resultados são disponibilizados em minutos.
 Saiba mais
O primeiro caso do fungo Candida auris no Brasil foi identificado pela 
técnica de Maldi-Tof, em 2021. Entenda melhor por meio da seguinte leitura:
ALMEIDA JÚNIOR, J. N. et al. Emergence of Candida auris in Brazil in 
a Covid-19 Intensive Care Unit. Journal of Fungi, v. 7, n. 3, art. 220, 2021. 
Disponível em: https://bit.ly/3cuMZKz. Acesso em: 18 nov. 2021.
Nas próximas páginas, vamos entender como funciona essa técnica relativamente nova e discutir 
suas potencialidades e perspectivas de uso. Para facilitar a leitura, o texto será dividido em quatro partes, 
conforme segue.
• Tópico 1.1: quais são as técnicas classicamente utilizadas no laboratório de microbiologia clínica 
para identificar bactérias e fungos.
• Tópico 1.2: uso do Maldi-Tof nas análises microbiológicas e conhecimento de suas etapas 
experimentais, para que possamos entender as vantagens dessa técnica em comparação aos 
métodos clássicos.
• Tópico 1.3: utilização na identificação de vírus, com ênfase na pesquisa das características 
funcionais do Sars-Cov-2, causador da Covid-19.
• Tópico 1.4: outros usos do Maldi-Tof, além da microbiologia clínica.
1.1 Métodos clássicos de identificação de microrganismos
Nós já sabemos que os métodos clássicos de identificação microbiana envolvem várias etapas e, 
portanto, são custosos e demorados. Isso ocorre porque um único ensaio não é suficiente para determinar o 
número de propriedades capazes de identificar a espécie de bactéria ou de fungo envolvido na infecção.
13
BIOMEDICINA INTEGRADA
Tudo começa com a coleta do material biológico infectado. Após essa etapa, o material é processado 
e observado ao microscópio óptico.
A análise da amostra ao microscópio muitas vezes envolve o tratamento com corantes específicos, que 
permitem diferenciar as características morfológicas das espécies envolvidas na infecção. A coloração de 
Gram, por exemplo, permite classificar as bactérias em Gram-positivas ou Gram-negativas. A coloração 
de PAS, por sua vez, é muito utilizada na identificação de fungos, pois cora os polissacarídeos de suas 
paredes celulares.
Se necessário, o material é então cultivado em meio apropriado, para que haja proliferação e 
crescimento dos microrganismos.
O cultivo envolve a seleção do meio de cultura, de acordo com a suspeita clínica e as características 
metabólicas do microrganismo que se espera encontrar na amostra. O material biológico pode ser 
adicionado a meio líquido ou sólido, neste último, observa-se, após o cultivo, algumas colônias, que são 
agregadas de milhões de clones de um mesmo microrganismo.
 Observação
As bactérias e alguns fungos proliferam por fissão binária. Durante esse 
processo, uma célula-mãe divide-se em duas células-filhas idênticas entre 
si e idênticas à célula que as originou. É assim que se formam os clones 
constituintes de uma colônia.
O ágar chocolate e o ágar Sabouraud Dextrose são meios que permitem crescimento, respectivamente, 
da maioria das bactérias e dos fungos. Por não serem seletivos, são utilizados no início da triagem.
Caso haja necessidade, o meio de cultura pode ser suplementado, a fim de fornecer os substratos 
necessários para a replicação in vitro do microrganismo ou de elucidar alguma característica metabólica. 
Esses meios são, portanto, seletivos. Isso é importante, pois a visualização ao microscópio, na maioria 
das vezes, não é suficiente para determinar a espécie de microrganismo responsável pela infecção.
Alguns exemplos de meios seletivos para bactérias são o ágar MacConkey, que permite o crescimento 
somente de bactérias Gram-negativas; o ágar eosina azul de metileno, que indica se uma bactéria 
Gram-negativa é fermentadora de lactose; e o ágar manitol salgado, que permite diferenciar se as 
espécies de estafilococos expressam ou não a enzima coagulase.
Com relação aos fungos, o meio enriquecido com ágar de infusão cérebro-coração e sangue de 
carneiro possibilita identificar as espécies dimórficas de crescimento lento; e a suplementação do meio 
com diferentes substâncias (fontes de carbono e de nitrogênio, carboidratos ou até mesmo lipídios) 
permitem analisar o perfil metabólico do fungo.
14
Unidade I
Figura 1 – Meio de cultura manitol salgado contendo diversas colônias de estafilococos. 
Cada uma delas é um conjunto de milhões de clones de uma mesma bactéria inicial
Disponível em: https://bit.ly/3oHa4zl. Acessoem: 18 nov. 2021.
Algumas provas bioquímicas também podem ser realizadas para elucidar as características metabólicas 
da bactéria de interesse. A prova da catalase, por exemplo, consiste em adicionar peróxido de hidrogênio 
a 3% sobre as bactérias isoladas de uma colônia. Caso haja formação de bolhas, significa que elas são 
positivas para a catalase. Esse teste permite identificar os estreptococos que não expressam a enzima 
catalase e separá-los de outros cocos Gram-positivos que o fazem, como, por exemplo, os estafilococos.
Além desses testes, que caracterizam o perfil fenotípico do microrganismo, é muito importante 
determinar seu perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos. Para isso, é realizado 
o antibiograma.
O antibiograma por difusão em ágar é o ensaio mais utilizado para determinar a sensibilidade das 
bactérias e dos fungos aos agentes antimicrobianos. A técnica consiste em cultivar o microrganismo de 
interesse em meio sólido, ao qual são adicionados pequenos discos de papel embebidos, cada um, em 
um antibiótico diferente.
 Observação
O termo antibiótico é usado para se referir aos antibacterianos (usados 
para combater bactérias) e aos antifúngicos (usados para combater fungos). 
A escolha depende da caracterização do microrganismo na amostra inicial.
15
BIOMEDICINA INTEGRADA
Se houver crescimento do microrganismo ao redor do disco, ele é considerado resistente ao 
antibiótico. Se, por outro lado, for observado um halo ao seu redor, o microrganismo é sensível. Quanto 
maior o halo maior a sensibilidade.
Figura 2 – Exemplo de antibiograma
Disponível em: https://bit.ly/3kOzABM. Acesso em: 11 nov. 2021.
Todos os métodos citados até agora (observação direta ao microscópio após coloração, cultivo 
em meios seletivos e não seletivos, provas bioquímicas e antibiograma) são considerados fenotípicos 
de tipagem, pois se baseiam na identificação das características morfológicas e funcionais dos 
microrganismos. Por esse motivo, os resultados obtidos dependem fortemente das condições ambientais 
e são aplicáveis apenas na tipagem de algumas espécies.
Os métodos genotípicos, por sua vez, baseiam-se na identificação de fragmentos dos genes dos 
microrganismos e na detecção de polimorfismos. Como resultado, é possível classificar as bactérias e os 
fungos não somente em espécies, mas em subespécies.
As abordagens mais importantes de tipagem molecular são a análise dos fragmentos de restrição do 
DNA genômico e as técnicas de tipagem baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR). Em qualquer 
uma delas, o que se obtém é um padrão de fragmentos de DNA específico para cada subespécie, o que 
permite sua identificação.
16
Unidade I
1.2 Fundamentos da técnica de Maldi-Tof
Boa parte das etapas anteriormente descritas pode ser descartada com o uso do Maldi-Tof. Ao submeter 
o microrganismo de interesse a essa metodologia, temos, ao final de um único ensaio, sua “impressão 
digital”, o que possibilita o estabelecimento do tratamento mais adequado.
Essa técnica também pode ser utilizada para determinar a susceptibilidade do microrganismo 
a alguns antibióticos, conforme será abordado ao longo do texto. No entanto, embora o Maldi-Tof 
constitua uma técnica excelente de identificação fenotípica dos microrganismos, seu uso não prescinde 
a realização da genotipagem, pois a análise de proteínas, ao contrário do estudo do genoma, também 
depende das condições ambientais às quais a cultura de microrganismos foi submetida.
O equipamento de Maldi-Tof é composto de uma matriz polimérica, uma fonte de laser e um tubo a 
vácuo acoplado a um espectrômetro de massa. A técnica permite a obtenção do espectro de massas das 
proteínas presentes na amostra analisada.
O espectrômetro de massas é um equipamento que possibilita identificar moléculas e compostos 
desconhecidos, quantificá-los e prever suas propriedades. Na espectrometria de massas, as moléculas são 
ionizadas, ou seja, convertidas em íons, e separadas a partir da passagem por um campo. As diferenças 
no padrão de migração das moléculas pelo campo, como consequência de valores de massa e de carga, 
são detectadas pelo equipamento.
Outras abordagens experimentais também são baseadas na detecção final de diferentes categorias 
de moléculas pelo espectrômetro de massa. No caso do Maldi-Tof, o principal alvo da detecção são 
as proteínas. 
A análise proteômica dos microrganismos por Maldi-Tof envolve as seguintes etapas:
• Isolamento da amostra biológica infectada.
• Cultivo dos microrganismos contidos na amostra biológica.
• Deposição do material cultivado em uma placa e adição de uma matriz polimérica.
• Irradiação do material com feixes de laser, o que faz com que as proteínas que compõem os 
microrganismos presentes nele sofram dessorção (vaporização) e ionização.
• Aceleração dos vapores e passagem por um tubo a vácuo, denominado tubo de voo, que separa 
as diferentes proteínas e as direciona para um detector.
• Determinação do tempo de voo de cada proteína, que corresponde ao tempo que cada uma delas 
demora para alcançar o detector.
17
BIOMEDICINA INTEGRADA
• Aquisição do espectro de massas, que é um registro constituído por uma série de picos. Esses picos 
são analisados por um software, que compara o padrão gerado com um banco de dados contendo 
o perfil proteico de outros microrganismos.
• Uma vez que cada microrganismo apresenta um conjunto de proteínas específico, o padrão de 
picos gerado pelo espectrômetro de massa também o é. Isso permite a correta identificação da 
espécie contida na amostra.
As etapas experimentais descritas são apresentadas nas figuras a seguir.
A) B)
C)
D)
Figura 3 – Etapas do Maldi-Tof: A) o material biológico é cultivado em meios de cultura apropriados; B) os cultivos são adicionados 
a uma placa que contém uma matriz polimérica; C) a placa é adicionada ao equipamento de Maldi-Tof, onde é processada e 
analisada; D) obtém-se o espectro de massas, que corresponde ao perfil proteico dos microrganismos cultivados no item (A)
Adaptada de: Patel (2019).
Resultado (espectro)
Componente Etapa
DetecçãoDetector
AceleraçãoLaser assistida
Separação; análise 
do tempo de voo
Tudo de voo
Dessorção/ionização por laser 
assistida em matriz (MALDI)
Amostra biológica 
adicionada à matriz
Figura 4 – Dentro do equipamento de Maldi-Tof ocorrem as etapas de dessorção/ionização, 
aceleração, separação e análise do tempo de voo e detecção
Adaptada de: https://bit.ly/3kRx25F. Acesso em: 11 nov. 2021.
18
Unidade I
A seguir, consta uma descrição de todas as etapas da técnica de Maldi-Tof, desde a adição do 
material biológico ao equipamento até a interpretação do espectro de massas.
1.2.1 Adição da amostra ao equipamento e irradiação
Em geral, o material coletado do paciente não é depositado diretamente no equipamento de 
Maldi-Tof. Antes é necessário cultivar os microrganismos em meio de cultura apropriado. Isso permite 
que o número de microrganismos presentes na amostra aumente exponencialmente, o que resulta em 
material suficiente para que o ensaio ocorra.
Dependendo do meio de cultura utilizado, prioriza-se o crescimento de bactérias, de fungos ou até 
mesmo de outras células – hoje, vários pesquisadores estudam o uso do Maldi-Tof para determinar o 
perfil proteico de células neoplásicas, por exemplo. Por ora, vamos focar na utilização do Maldi-Tof nos 
laboratórios de microbiologia clínica.
Após o cultivo, o conteúdo de uma colônia é transferido para uma placa de aço inoxidável com o 
auxílio de um palito. A ideia é que somente clones de uma mesma colônia sejam depositados nela.
Em seguida, a placa é coberta com uma matriz polimérica, responsável por aumentar a taxa de 
ionização das proteínas ou dos peptídeos presentes na amostra. Alguns exemplos de matrizes poliméricas 
são as compostas por ácido cafeico, ácido ferúlico, ou ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA).
No interior do equipamento, pulsos de laser de nitrogênio, cujo comprimento de onda encontra-seno espectro do ultravioleta, atingem a amostra e ocasionam uma rápida dessorção das proteínas 
presentes na superfície dos microrganismos. Em outras palavras, as proteínas são desprendidas da 
matriz e vaporizam. Ocorre também sua ionização, graças à doação de prótons (H+) pela matriz que foi 
atingida pelo laser.
Podemos entender como isso ocorre ao observar a estrutura da molécula de HCCA. Ao ser atingida 
pela radiação ultravioleta, ela libera íons H+ (prótons) de seus radicais hidroxila (-OH). Esses prótons 
ligam-se às proteínas da amostra, que se tornam ionizadas.
HO
N
OH
O
Figura 5 – Representação esquemática do ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico
Disponível em: https://bit.ly/3oDKKKt. Acesso em: 18 nov. 2021.
19
BIOMEDICINA INTEGRADA
1.2.2 Aceleração e passagem pelo tubo de voo
As proteínas dessorvidas (vaporizadas) e ionizadas seguem em direção ao analisador Tof (time of 
flight). Ele é constituído de um tubo metálico, denominado tubo de voo. Esse tubo é mantido a vácuo e 
submetido a um campo elétrico, que orienta as proteínas em direção ao detector.
Por ação do campo elétrico, as diferentes proteínas são separadas de acordo com sua relação massa/
carga (relação m/z) e chegam ao detector em tempos distintos.
 Observação
A relação massa/carga de uma proteína é a razão entre a massa 
molecular e o total de cargas elétricas.
1.2.3 Obtenção do espectro de massas
O espectro de massas é um gráfico bidimensional, cujo eixo x representa a razão m/z, e o eixo y, a 
proporção de íons, em relação ao íon mais intenso do espectro (íon base).
A figura a seguir mostra o espectro de massas da bactéria Escherichia coli.
12000
10
30
0
97
42
90
6683
2777
08
71
58
62
55
53
81
50
9648
72
43
6541
66
1100010000900080007000
m/z
6000500040003000
In
te
ns
id
ad
e
2000
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Figura 6 – Espectro de massas da Escherichia coli
Adaptada de: Yu et al. (2018).
Cada pico corresponde a uma proteína, e o conjunto apresentado delas é específico dessa bactéria. 
Na literatura, tal perfil é descrito como uma impressão digital do microrganismo.
Compare o espectro de massas da E. coli, exibido na figura anterior, com o espectro de massas de 
outra espécie de bactéria, a Shigella flexneri, apresentado a seguir. Podemos perceber claramente que o 
perfil de picos é diferente em ambos.
20
Unidade I
12000
10
30
0
97
42
90
66
83
27
77
08
71
58
62
5553
81
50
96
48
72
43
65
41
66
1100010000900080007000
m/z
6000500040003000
In
te
ns
id
ad
e
2000
14
12
10
8
6
4
2
0
Figura 7 – Espectro de massas da Shigella flexneri
Adaptada de: Yu et al. (2018).
A maioria dos espectros de massas não é de interpretação fácil sem informações adicionais e, portanto, 
é necessário comparar o gráfico obtido no ensaio de Maldi-Tof com uma base de dados que contém 
os espectros dos diferentes microrganismos. Alguns de seus exemplos são o Biotyper software (Bruker 
Daltonics) e o Spectral Archive and Microbial Identification System (SARAMIS – AnagnosTec GmbH).
 Saiba mais
Leia mais a respeito da técnica de Maldi-Tof em:
PASTERNAK, J. Novas metodologias de identificação de microrganismos: 
MALDI-TOF. Einstein, v. 10, n. 1, p. 118-119, 2012. 
Disponível em: https://bit.ly/3oWH7PR. Acesso em: 18 nov. 2021.
1.2.4 Determinação da susceptibilidade a antimicrobianos por Maldi-Tof
Várias adaptações do Maldi-Tof têm sido propostas para a detecção rápida da resistência bacteriana 
aos antibióticos. As principais delas envolvem a avaliação da atividade da enzima betalactamase, 
responsável por inativar os antibióticos betalactâmicos; a análise dos biomarcadores associados aos 
mecanismos de resistência; e a comparação dos perfis proteicos de bactérias incubadas ou não com 
diferentes antibióticos.
Os ensaios realizados até o momento permitiram a determinação do perfil de susceptibilidade de 
bactérias de interesse clínico – por exemplo, enterobactérias, bactérias Gram-negativas não fermentadoras, 
cocos Gram-positivos, bactérias anaeróbias e micobactérias – o que demonstra o potencial da técnica. 
Como os resultados são obtidos muito mais rapidamente do que com a realização do antibiograma, o 
tratamento pode ser estabelecido de maneira precoce e mais efetiva.
21
BIOMEDICINA INTEGRADA
Um exemplo do uso do Maldi-Tof para esse fim é a determinação da atividade da betalactamase. 
O gene que codifica essa enzima está contido em plasmídeos que podem ser transmitidos de uma 
bactéria a outra. Quando expressa, a enzima é responsável pela quebra do anel lactâmico de uma série 
de antibióticos, como, por exemplo, as penicilinas.
Nos ensaios de Maldi-Tof, o alvo da identificação não é a betalactamase, mas o produto da ação dessa 
enzima sobre os antibióticos betalactâmicos. Para isso, adiciona-se o antibiótico à cultura de bactérias 
que se deseja testar e, após o período de incubação, a amostra é centrifugada e o sobrenadante, livre 
de bactérias, é depositado no equipamento de Maldi-Tof. A presença de um único pico no espectro de 
massas indica que o antibiótico não foi degradado, já a ocorrência de dois picos significa que houve 
quebra do anel lactâmico e que, portanto, as bactérias são resistentes.
Antibiótico 
betalactâmico + 
bactérias
Incubação (1,5-3 h, 37 ºC)
Análise do sobrenadante no 
equipamento de Maldi-Tof
Produtos da hidrólise 
do antibiótico pela 
betalactamase
Antibiótico 
betalactâmico 
intacto
Bactéria 
resistente
Bactéria 
suscetível
Centrifugação
Figura 8 – Identificação da resistência aos betalactâmicos pela técnica de Maldi-Tof
Adaptada de: Florio et al. (2020).
1.3 O uso do Maldi-Tof na identificação de partículas virais
O perfil proteico dos vírus também pode ser determinado pela técnica de Maldi-Tof. Um exemplo é 
o desenvolvimento de ensaios para a identificação do Sars-Cov-2 (ILES et al., 2020; ROCCA et al., 2020; 
MAHMUD; GARRETT, 2020; TRAN et al., 2021).
A fim de executar esses ensaios, a secreção nasofaríngea ou a saliva dos pacientes infectados 
pelo vírus foi coletada e processada para a análise das glicoproteínas do envelope viral, incluindo os 
fragmentos da proteína spike (responsável pela entrada do vírus no organismo) e a avaliação da resposta 
imune associada à infecção (caracterizada pelo aumento da intensidade dos picos relacionados à cadeia 
leve das imunoglobulinas e à cadeia pesada da imunoglobulina A (IgA)).
22
Unidade I
A figura a seguir mostra a comparação entre os espectros de massas das amostras de pacientes 
positivos para a Covid-19, em preto; e de pacientes negativos, em vermelho.
3442
3488
3465
3500m/z
In
te
ns
id
ad
e
0
1
2
3
4
5
3372
Figura 9 – Espectro de massas de amostras de pacientes positivos (preto) 
e negativos (vermelho) para a Covid-19
Fonte: Rocca et al. (2020, p. 5).
1.4 Outros usos do Maldi-Tof
Além do uso na microbiologia clínica, a técnica de Maldi-Tof tem sido utilizada para avaliar a 
expressão de proteínas em outros tipos celulares. Por exemplo, é possível verificar os produtos de genes 
com polimorfismos; as consequências, em nível proteico, das modificações pós-transcricionais no RNA; 
e também a presença de imunoglobulinas específicas no soro do paciente.
Ademais, várias outras abordagens vêm sendo desenvolvidas para atender à necessidade de diagnóstico 
rápido e preciso para diversas doenças. Um exemplo é a técnica de Maldi-IMS, usada experimentalmente 
para detectar marcadores tumorais expressos em diferentes tipos de câncer (mama, próstata, intestino, 
ovário, boca, cérebro e linfomas). Uma vez que eles estão presentes somente nas células tumorais, sua 
detecção pela técnica de Maldi-Tof pode resultar no diagnóstico precoce do câncer.
No Maldi-IMS, a matriz polimérica é adicionada diretamente ao fragmento biopsiado, o que 
permite a correlação do espectro de massas obtido com a região do tecido que o expressa. Para isso, 
o tecido é seccionado em fatias com micrômetros de espessura, revestido com a matriz polimérica 
e submetido ao equipamento. A análise por espectrometriaé realizada em uma área predefinida, o 
que possibilita identificar e visualizar a distribuição das massas de compostos de interesse dentro 
do seu contexto morfológico.
23
BIOMEDICINA INTEGRADA
Na imagem a seguir, podemos observar que uma região específica do tecido é submetida ao laser, o 
que resulta no espectro de massas das células daquela área. Ao processar e corar a secção de tecido para 
visualização ao microscópio, é possível visualizar a região que corresponde ao espectro obtido.
Espectro de massas
Secção do tecido 
revestido pela matriz
Marcação com 
Hematoxilina e Eosina
Laser
MALDI-IMS
Figura 10 – Representação esquemática da técnica de Maldi-IMS
Adaptada de: Balluff et al. (2011).
 Observação
Com a popularização do Maldi-Tof, é importante que o biomédico que 
atua nas análises clínicas se atualize sobre essa técnica. Afinal, no futuro, a 
tendência é que ela seja incorporada na maioria dos laboratórios.
2 NOVAS TECNOLOGIAS EM HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA
A hematologia clínica e a hemoterapia são as áreas do conhecimento que se ocupam, respectivamente, 
do diagnóstico das doenças do sangue e do uso terapêutico do sangue e de seus derivados.
Muitos avanços surgiram nos últimos anos nas práticas realizadas nessas áreas. Técnicas não 
automatizadas, que requerem analistas experientes e bem treinados, vêm sendo substituídas por 
métodos automatizados e ensaios de biologia molecular, mais sensíveis e específicos. Além disso, novos 
parâmetros hematológicos têm auxiliado no diagnóstico de diferentes doenças.
Vamos, a partir de agora, relembrar como funcionam esses laboratórios e conhecer os principais 
avanços na área.
24
Unidade I
• Tópico 2.1: técnicas classicamente utilizadas nos laboratórios de hematologia clínica.
• Tópico 2.2: comparação entre as técnicas e os avanços que surgiram nos últimos anos.
• Tópico 2.3: novos parâmetros hematológicos e sua importância no diagnóstico de doenças.
• Tópico 2.4: abordagem das técnicas de biologia molecular aplicadas ao diagnóstico das 
hemoglobinopatias.
2.1 Rotina do setor de hematologia clínica
A hematologia laboratorial visa à análise pormenorizada dos componentes do sangue, a fim de 
detectar alterações na composição desse tecido. Entre as doenças que podem ser detectadas pelos 
procedimentos realizados no setor de hematologia, estão anemias, policitemia, leucemias, processos 
infecciosos, hemoglobinopatias, linfomas e mielofibrose.
O principal exame de rotina realizado no setor de hematologia clínica é o hemograma. Ele permite 
uma avaliação inicial das três linhagens celulares que compõem o sangue: a linhagem eritromieloide 
(hemácias e granulócitos), a linhagem linfoide (linfócitos) e a linhagem megacarioblástica (plaquetas).
Acompanhe, na figura a seguir, um laudo de hemograma e observe os principais parâmetros 
avaliados.
Figura 11 – Hemograma
25
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Saiba mais
A fim de revisar o significado dos parâmetros do hemograma, acesse:
NAOUM, P. C.; NAOUM, F. A. Interpretação laboratorial do hemograma. 
Academia de Ciência e Tecnologia, 2019. 
Disponível em: https://bit.ly/3cHw0Vn. Acesso em: 18 nov. 2021.
Em laboratórios com fluxo baixo de exames, é possível obter todos os parâmetros citados a partir 
de metodologia manual, ou seja, não automatizada. Para isso, são necessários uma centrífuga, um 
espectrofotômetro e um microscópio. Vamos entender para que esses equipamentos são empregados, 
com base na sua utilização, a fim de determinar as características da série vermelha.
• A centrífuga é utilizada para estimar o hematócrito, ou seja, a proporção relativa das hemácias na 
amostra de sangue.
• O espectrofotômetro é importante para dosar a hemoglobina, que dá ao sangue a coloração 
vermelha, além de ser a macromolécula responsável pelo transporte de oxigênio.
• O microscópio permite a contagem das hemácias e a observação das variações de tamanho e de 
coloração, as alterações morfológicas etc.
 Observação
O espectrofotômetro determina a concentração do analito em uma 
amostra a partir da avaliação da absorção da luz em um dado comprimento 
de onda desse analito.
A análise semiautomatizada refere-se à submissão da amostra de sangue a equipamentos que 
se encarregam de avaliar os parâmetros, sem a necessidade da intervenção direta do analista 
em todas as etapas. Ela é realizada por um contador hematológico, que permite a contagem e 
a determinação do diâmetro das células a partir da sua passagem por uma corrente elétrica. 
Diferentes intensidades de corrente elétrica, ou seja, impedâncias distintas, possibilitam diferenciar 
os tipos celulares do sangue.
26
Unidade I
Figura 12 – Contador hematológico
Disponível em: https://bit.ly/3x3apjy. Acesso em: 18 nov. 2021.
Além do hemograma, no setor de hematologia, são realizados coagulograma, tipagem sanguínea, 
provas de Coombs direto e indireto, contagem de reticulócitos, curva de resistência osmótica, prova de 
falcização e eletroforese de hemoglobina, entre outros protocolos.
2.2 Avanços no setor de hematologia clínica
O setor de hematologia tem se beneficiado, nas últimas décadas, de novas tecnologias, com alta 
sensibilidade e especificidade, para a análise automatizada do sangue.
Vamos, a partir de agora, conhecer melhor essas tecnologias.
2.2.1 Citometria de fluxo
A citometria de fluxo já constitui, atualmente, a principal metodologia de análise do sangue nos 
laboratórios de hematologia de grande porte. Existem modelos que, inclusive, têm acoplado o contador 
hematológico tradicional ao equipamento.
São inúmeras as vantagens do uso do citômetro de fluxo nas análises hematológicas. Além da 
contagem e da identificação das células, a técnica permite a identificação das moléculas em sua 
superfície, entre outros parâmetros. Por esse motivo, ele é considerado um equipamento de análise 
multiparamétrica.
27
BIOMEDICINA INTEGRADA
Os principais usos do citômetro de fluxo na hematologia são:
• A determinação de parâmetros hematológicos que constam do hemograma, principalmente em 
análises realizadas em laboratórios de grande porte.
• A contagem de reticulócitos.
• O diagnóstico das leucemias e da hemoglobinúria paroxística noturna.
• A definição do perfil funcional e do estágio de maturação dos diferentes subtipos de leucócitos.
• A identificação de subpopulações de células malignas no sangue.
• A avaliação dos linfócitos T CD4+ e CD8+ em sangue de indivíduos HIV positivos.
Na citometria de fluxo, um feixe de laser é direcionado à amostra, que se encontra em fluxo laminar 
em um meio líquido condutor de eletricidade. Cada partícula suspensa nesse meio – no caso, as células 
sanguíneas presentes na amostra – dispersa a luz de uma maneira diferente, ao ser atingida pelo laser. 
A luz dispersa é captada por detectores posicionados na linha do laser e perpendiculares a ele (forward 
scatter e side scatter, respectivamente), o que permite a avaliação de parâmetros físicos e químicos das 
células contidas na amostra.
Esses equipamentos também possuem detectores de fluorescência, o que possibilita a adição, à 
amostra, de fluorocromos ou de anticorpos monoclonais acoplados a fluoróforos para a avaliação de 
parâmetros específicos, importantes no diagnóstico de algumas condições. A imunofenotipagem, por 
exemplo, usa de anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente antígenos presentes em 
células neoplásicas ou em alguma subpopulação de leucócitos.
Amostra
Laser
Fluido 
envoltório
Fotomultiplicadores
Digitalização
Detectores
FL1
FL2
FSC
SSC
FL3
Figura 13 – Representação esquemática de um citômetro de fluxo
Fonte: Martins e Gagliani (2008, p. 8).
28
Unidade I
Após a passagem pelos detectores, obtém-se um gráfico no qual cada ponto corresponde a uma 
célula, posicionada de acordo com sua complexidade (representada pelo valor do side scatter, ou SSC, 
no eixo y) e com seu tamanho (representado pelo forward scatter, ou FSC, no eixo x).
255
25
5
0
0
SS
C-
H
FSC-H
Figura 14 – Gráfico citometriade fluxo de amostra de sangue. 
Cada subpopulação de células encontra-se em uma posição
Disponível em: https://bit.ly/3DL1ZzK. Acesso em: 18 nov. 2021.
 Observação
Nos ensaios de citometria de fluxo, o principal parâmetro que determina 
a complexidade das células é a presença de grânulos citoplasmáticos 
(granulosidade).
2.2.2 Laboratório modular de hematologia
O laboratório modular de hematologia (modular laboratory hematology) é uma plataforma que 
permite a análise de diversos parâmetros hematológicos e a avaliação do esfregaço sanguíneo, de 
maneira totalmente automatizada.
Essa plataforma integra as etapas pré-analítica, analítica e pós-analítica, com o objetivo de aumentar 
a precisão dos resultados. A figura a seguir representa a organização básica de uma dessas plataformas.
29
BIOMEDICINA INTEGRADA
Enfermarias de hospitais Laboratórios remotos
1. Estação pré-analítica
2. Analisador modular
3. Processador automático de lâminas
4. Analisador de imagens
1 2 22 4
3
Figura 15 – Representação esquemática da plataforma modular de hematologia
Fonte: Lippi e Plebani (2018, p. 3).
A análise é iniciada com o posicionamento das amostras de sangue, em tubos contendo EDTA, na 
estação pré-analítica. Em comparação com os métodos não automatizados ou semiautomatizados, o 
volume de sangue necessário é significativamente menor, o que gera economia de material de coleta e 
traz maior conforto para o paciente.
O sangue, então, percorre os analisadores, que são arranjados em série e, na maioria dos modelos, 
compostos de um citômetro de fluxo, um contador hematológico e um espectrofotômetro. O analisador 
Sysmex® XE-2100D, por exemplo, avalia oito parâmetros relacionados às hemácias, treze relacionados 
aos leucócitos e dois relacionados às plaquetas. A citometria de fluxo é utilizada na contagem total e 
diferencial dos leucócitos; o contador hematológico realiza a contagem de hemácias e de plaquetas a 
partir do método da impedância; e a dosagem da hemoglobina é executada no espectrofotômetro pelo 
método do lauril sulfato de sódio, que envolve a lise das hemácias e a formação de ciano-hemoglobina 
(MACIEL; COMAR; BELTRAME, 2014).
O processador automático de lâminas produz esfregaços para análise por um software que utiliza 
inteligência artificial. Após a coloração dos esfregaços, que ocorre também de maneira automatizada 
na plataforma, as imagens são digitalizadas e analisadas por redes neurais artificiais, que se baseiam em 
bancos de dados de elementos do sangue, para identificar as alterações, se presentes.
As imagens digitalizadas podem, ainda, ser transmitidas para outros laboratórios, caso se identifique 
a necessidade de análises adicionais. Elas apresentam alta definição e, portanto, é possível aumentá-las 
muitas vezes sem que haja prejuízo na resolução.
30
Unidade I
 Observação
Em microscopia, o termo resolução refere-se à menor distância na qual 
dois pontos podem ser visualizados como objetos distintos.
Embora esse tipo de analisador tenha sido elaborado originalmente para a análise dos leucócitos, ele 
também é eficaz na avaliação da morfologia das hemácias e, portanto, confirma os resultados obtidos 
anteriormente. Assim, ao final da análise, além dos laudos de cada equipamento que compõe o sistema 
modular, será possível visualizar imagens que se correlacionam com quadros de anisocitose, hipocromia, 
micro e macrocitose, esferocitose etc. Ademais, o software tem sensibilidade suficiente para diagnosticar 
casos de infecções parasitárias, como, por exemplo, a malária.
2.3 Novos parâmetros hematológicos
Com o advento das plataformas modulares automatizadas, tornou-se possível a avaliação de 
condições de urgência sem a necessidade de interferência na rotina laboratorial. Como resultado, foram 
desenvolvidos novos parâmetros: a contagem automatizada de granulócitos imaturos (IG), a contagem 
de plaquetas reticuladas (IPF) e o conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos (RET-He). Eles facilitam o 
diagnóstico da sepse, das trombocitopenias e das anemias, respectivamente.
Vamos, a partir de agora, conhecer esses parâmetros?
2.3.1 Contagem automatizada de granulócitos imaturos (IG)
A sepse é a presença de bactérias ou de seus produtos tóxicos no sangue, que resulta no surgimento 
de manifestações clínicas importantes e, por vezes, fatais.
Em casos de sepse, o diagnóstico precoce é essencial, pois, quanto mais rapidamente for diagnosticada 
a condição, melhor o prognóstico. Muitas vezes, a demora de algumas horas na detecção do quadro 
pode resultar em choque, em falência de órgãos ou até mesmo na morte do paciente.
Do ponto de vista clínico, ela é caracterizada pela ocorrência de pelo menos dois dos sintomas a seguir.
• Temperatura corporal maior que 38 °C ou menor que 36 °C.
• Frequência cardíaca maior que 90 batimentos por minuto.
• Frequência respiratória maior que 20 respirações por minuto ou pressão parcial de CO2 menor 
que 32 mmHg.
31
BIOMEDICINA INTEGRADA
• Contagem de leucócitos no sangue periférico maior que 12.000/mm³, menor que 4.000/mm³ ou, 
ainda, mais de 10% dos leucócitos constituídos de formas jovens, o que indica que a produção 
dessas células está aumentada na medula óssea.
Os neutrófilos são os principais leucócitos que se encontram aumentados, em um primeiro momento, 
frente a uma infecção bacteriana. Eles são granulócitos, pois apresentam granulações em seu citoplasma, 
e polimorfonucleares, uma vez que possuem núcleo lobulado, com diferentes formatos.
Neutrófilo Eosinófilo Basófilo
Figura 16 – Representação esquemática dos granulócitos/polimorfonucleares. Os neutrófilos estão 
envolvidos no combate às infecções bacterianas, os eosinófilos, às infecções parasitárias e às alergias; 
e os basófilos liberam histamina em reações de hipersensibilidade imediata
Adaptada de: https://bit.ly/3cvuS7i. Acesso em: 18 nov. 2021.
Além da ação dos neutrófilos, a resposta imunológica desencadeada pela infecção bacteriana que 
caracteriza a sepse resulta na produção de inúmeros mediadores, como, por exemplo, as interleucinas IL-1, 
IL-6, IL-8 e IL-10; o fator de necrose tumoral (TNF); e as proteínas de fase aguda PCR (proteína C reativa) 
e a procalcitonina.
A detecção desses mediadores, principalmente das IL-6, 8 e 10, tem sido usada no diagnóstico precoce 
da sepse. No entanto, o alto custo desse exame e a meia-vida curta das moléculas são obstáculos para 
o uso desses marcadores na rotina.
Com relação às proteínas de fase aguda, existem várias limitações para seu uso como indicador da 
sepse: os níveis séricos da proteína C reativa, por exemplo, aumentam durante infecções menores e 
podem permanecer elevados vários dias após a eliminação do foco infeccioso.
No curso de uma infecção, inclusive na sepse, ocorre desvio à esquerda, com aumento na contagem 
de granulócitos imaturos, em especial os neutrófilos.
Nesse contexto, o aparecimento de granulócitos imaturos no sangue periférico é um indicativo precoce 
do quadro de sepse, pois sinaliza que a medula óssea está produzindo mais células polimorfonucleares, 
principalmente, os neutrófilos, para combater a infecção.
32
Unidade I
Os granulócitos imaturos apresentam, como principal característica, menor grau de segmentação 
nuclear, o que permite sua detecção ao microscópio óptico (técnica mais demorada e sujeita a erros do 
analista) ou por contadores automatizados multiparamétricos com citômetro de fluxo acoplado.
A citometria de fluxo permite classificar os granulócitos de acordo com seu estágio de maturação 
(promielócitos, mielócitos, metamielócitos e bastonetes, em ordem crescente de maturação) e apresenta, 
como principais vantagens, a rapidez e a alta sensibilidade e especificidade.
O protocolo envolve a incubação da amostra de sangue com um fluoróforo, normalmente o Fluorocel, 
seguido da lise seletiva da membrana dos leucócitos maduros. Como resultado, apenas os granulócitos 
imaturos, em seus diferentes estágios de desenvolvimento, permanecem íntegros e são avaliados quantoa seu tamanho, conteúdo de DNA e RNA, formato do núcleo, presença de granulosidades, entre outros 
parâmetros, a partir da passagem pelo citômetro de fluxo.
2.3.2 Contagem de plaquetas reticuladas (IPF)
A trombocitopenia é uma condição caracterizada pela diminuição da contagem de plaquetas. Ela é 
resultado da produção insuficiente por parte da medula óssea (hipoprodução medular), da destruição 
acelerada das células (hiperdestruição periférica) ou do seu acúmulo no baço aumentado.
Independentemente da causa, quando o número de plaquetas por microlitro de sangue atinge a 
marca de 10.000 a 20.000, podem ocorrer hemorragias sem nenhuma lesão reconhecida. No entanto, 
conhecer a causa da trombocitopenia é importante para direcionar o tratamento.
O diagnóstico diferencial das trombocitopenias envolve a observação da morfologia da medula óssea.
• Trombocitopenia por hipoprodução medular: é notada aplasia da medula ou proliferação de 
células anormais.
• Quadro de hiperdestruição periférica: a produção de plaquetas é maior do que o normal, como 
modo de compensar as perdas, e ocorre liberação de formas imaturas para a circulação.
As formas imaturas são denominadas plaquetas reticuladas. Elas apresentam volume aumentado, 
são mais densas e carregam conteúdo residual de RNA em seu citoplasma, o que as tornam adequadas 
para a detecção por sistema automatizado. O aumento da proporção relativa dessas células no plasma 
é indicativo de hiperdestruição periférica, conforme citado anteriormente.
Sistemas automatizados multiparamétricos permitem a contagem das plaquetas pelo método da 
impedância. A classificação dessas células de acordo com seu estágio de maturação também pode ser 
realizada por citometria de fluxo, com a utilização de um fluoróforo que se liga especificamente às 
plaquetas reticuladas. Dessa maneira, é possível avaliar sua proporção em relação ao total de plaquetas, 
o que complementa, ou até substitui, o mielograma.
33
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Observação
Mielograma é a avaliação das células da medula óssea a partir da punção 
de um osso longo. Trata-se de um procedimento doloroso e, portanto, 
contraindicado em uma série de condições.
2.3.3 Conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos (RET-He)
A anemia é caracterizada pela diminuição da massa das hemácias e do seu conteúdo de hemoglobina. 
Como a hemoglobina é a macromolécula responsável pelo transporte de oxigênio dos pulmões para os 
tecidos, sua diminuição causa diferentes graus de hipóxia tecidual.
Existem várias causas distintas de anemias, sendo as principais: diminuição da produção de eritropoietina 
pelos rins, hemólise intravascular e deficiência de ferro, de ácido fólico e/ou de vitamina B12. Dependendo da 
causa, as hemácias apresentarão características morfológicas específicas, o que permite sua diferenciação 
ao microscópio.
• Na deficiência de eritropoietina, a contagem de hemácias está diminuída e, geralmente, a anemia 
é normocítica e normocrômica.
• Na deficiência de ferro, a anemia é microcítica e hipocrômica.
• Na deficiência de ácido fólico e/ou de vitamina B12, a anemia é macrocítica.
 Saiba mais
Confira os tipos de anemia e suas características em:
NAOUM, P. C. Anemias: classificação e diagnóstico diferencial. São 
Paulo: Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2015. Disponível em: https://
bit.ly/3HO6Oe5. Acesso em: 18 nov. 2021.
Nesse contexto, a avaliação da quantidade de hemoglobina contida nos reticulócitos, que são 
precursores das hemácias liberados na circulação sistêmica, possibilita a aferição indireta da quantidade 
de ferro disponível para a produção da hemoglobina nos últimos dois a quatro dias. Além disso, é 
possível avaliar a resposta da medula óssea frente à terapia de ferro intravenoso e/ou ao tratamento 
com eritropoetina recombinante humana.
A quantificação da hemoglobina contida nos reticulócitos é realizada a partir da medida do volume 
dessas células e da determinação da concentração de hemoglobina contida em seu interior. Os resultados 
são expressos como o valor médio da massa de hemoglobina em cada célula.
34
Unidade I
2.4 Técnicas de biologia molecular aplicadas ao diagnóstico das hemoglobinopatias
As hemoglobinopatias são um grupo de doenças, de origem genética, caracterizadas por alterações 
na estrutura da hemoglobina. As mais comuns são a anemia falciforme e as talassemias.
A hemoglobina é uma macromolécula constituída por quatro grupamentos heme, sendo que cada 
um deles apresenta um átomo de ferro (Fe2+) e dois pares de cadeias de globinas, com um par formado 
por cadeias do tipo alfa e o outro constituído por cadeias do tipo não alfa.
Combinações entre diferentes cadeias de globinas, cada uma codificada por um gene diferente, 
originam tipos distintos de hemoglobinas, que são produzidas ao longo do desenvolvimento humano 
desde o período embrionário até a vida adulta. As mutações nos genes que codificam essas globinas dão 
origem às diversas hemoglobinopatias.
O diagnóstico das hemoglobinopatias normalmente é feito pela eletroforese de hemoglobina e 
pela cromatografia em alta performance (HPLC, high performance liquid chromatography), esta última 
realizada a partir de amostra de sangue proveniente do teste de triagem neonatal.
Devem ser considerados os dados clínicos do paciente, o padrão de herança genética, a distribuição 
de casos na família, a idade do paciente, o tempo de estocagem e as condições de armazenamento da 
amostra. O hemograma complementa o diagnóstico, uma vez que permite a avaliação dos parâmetros 
hematimétricos, que podem estar alterados.
Os testes moleculares são uma alternativa rápida e eficaz para diagnosticar as alterações nos genes 
que codificam as cadeias de globina. Eles são baseados nos ensaios de reação em cadeia da polimerase 
(PCR, polymerase chain reaction) e em ensaios de RFLP (restriction fragment length polymorphism).
Os ensaios de PCR baseiam-se na amplificação de sequências específicas do gene de globina que 
podem conter a mutação relacionada com a doença que se deseja pesquisar.
 Observação
As hemácias não apresentam DNA e, portanto, o material genético 
analisado é originário dos leucócitos ou de outros tipos celulares.
As sequências amplificadas podem ser sequenciadas, a fim de verificar a presença de mutações, 
ou submetidas aos estudos de RFLP, que se baseiam na ação de endonucleases, que clivam regiões 
específicas do DNA.
Os ensaios de RFLP permitem observar se existem diferenças no padrão de bandas formadas após a 
digestão, o que indica que há mutações na sequência analisada.
35
BIOMEDICINA INTEGRADA
Como principais vantagens das técnicas moleculares, temos rapidez, elevados parâmetros de 
sensibilidade e especificidade, além da possibilidade de analisar os genes de todas as globinas.
 Saiba mais
A fim de verificar as etapas da reação em cadeia da polimerase, acesse:
OLIVEIRA, M. C. S. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de 
extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia 
da polimerase. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007. Disponível em: 
https://bit.ly/3FEpwTN. Acesso em: 18 nov. 2021.
 Observação
O biomédico que atua não apenas na hematologia, como em outras 
áreas, precisa ficar atento para as técnicas de biologia molecular que vêm, 
cada vez mais, sendo usadas no diagnóstico de doenças.
3 MICROARRANJOS DE DNA (MICROARRAYS)
Você conhece alguma técnica que possibilite a avaliação simultânea de vários loci de DNA 
de modo a proporcionar a verificação do perfil de polimorfismos nos genes de um indivíduo? Uma 
técnica que, além disso, permita checar o perfil de transcrição da célula a partir da avaliação dos RNAs 
mensageiros produzidos?
Você entende como esse tipo de avaliação é importante para determinarmos os genes envolvidos 
em diferentes patologias?
Essa técnica existe, e se chama microarranjos, ou microarrays, de DNA.
As instruções para a fabricação das proteínas pelas nossas células encontram-se nos genes que 
compõem o nosso DNA. Essesgenes não são idênticos em toda a população, eles podem apresentar 
mutações ao longo de suas sequências, o que resulta em diferentes consequências funcionais.
As mutações do DNA incluem os polimorfismos de nucleotídeo único; as inserções e deleções de 
nucleotídeos individuais ou de sequências de nucleotídeos; e a duplicação ou deleção de genes.
Uma das maneiras de detectar e estudar essas mutações é por meio da utilização dos microarranjos 
de DNA.
36
Unidade I
Os microarranjos de DNA, microarrays, ou chips de DNA, são um tipo de análise bidimensional que se 
baseia na adição do material genético em uma placa que contém vários pontos, cada um com uma sonda 
de DNA específica. Se, no material adicionado, houver uma sequência de nucleotídeos complementar à 
sequência de determinada sonda, é gerado um sinal fluorescente.
Por ser capaz de identificar a presença de mutações, principalmente aquelas que envolvem pequenos 
fragmentos do DNA, essa técnica é uma importante ferramenta na análise da farmacogenômica, no 
diagnóstico de doenças genéticas e até mesmo nas análises forenses.
Os ensaios com microarranjos de DNA permitem que várias sequências sejam analisadas ao mesmo 
tempo, o que possibilita a avaliação do perfil genético do indivíduo em relação a determinada condição – 
pode-se, por exemplo, verificar sequências gênicas importantes na resposta a um fármaco, ou ainda as 
mutações em genes relacionados a dado câncer.
Vamos, a partir de agora, aprender mais sobre essa metodologia, que vem sendo utilizada desde o 
final do século passado para diferentes objetivos.
• Tópico 3.1: fundamentos da técnica de microarranjos de DNA e descrição de suas etapas 
experimentais.
• Tópico 3.2: conhecimentos dos diferentes tipos de microarranjos disponíveis na atualidade.
• Tópico 3.3: discussão acerca das principais aplicações dessa técnica, tanto na pesquisa básica 
quanto no diagnóstico laboratorial de doenças.
3.1 Fundamentos dos ensaios com microarranjos de DNA
Um microarranjo de DNA nada mais é do que uma placa na qual são depositadas sondas de DNA 
de fita simples em diferentes pontos (spots). Cada uma delas contém vários spots, e cada spot possui 
milhares de sondas com sequências de DNA idênticas entre si.
A análise da expressão gênica por ensaios com microarranjos de DNA envolve as seguintes etapas:
• As sondas são fabricadas e adicionadas à placa, formando os microarranjos.
• A amostra biológica é coletada e seu mRNA é extraído e submetido à transcrição reversa.
• Ao cDNA resultante, é adicionado um fluoróforo.
• As moléculas de cDNA marcadas são adicionadas à placa com os microarranjos.
• Nos pontos onde houve hibridização do cDNA com a sonda, há geração de um sinal fluorescente.
• A placa é escaneada e processada por um software, o que permite determinar quais genes são 
diferencialmente expressos nas condições analisadas.
37
BIOMEDICINA INTEGRADA
Essas etapas estão representadas na figura a seguir.
Extração do mRNA
Transcrição reversa e adição 
de fluoróforo ao cDNA
Adição do cDNA à placa e 
hibridização com as sondas
Análise dos 
resultados
mRNA
cDNA
Transcriptase 
reversa
Microarranjo 
de DNA
Remoção de sondas 
não hibridizadas
Célula 
controle
Célula 
alterada
Figura 17 – Representação esquemática dos ensaios com microarranjos de DNA
Adaptada de: https://bit.ly/3HFOjbJ. Acesso em: 18 nov. 2021.
A seguir, consta a descrição de todas as etapas dos ensaios com microarranjos de DNA, desde 
o processamento do material biológico até a interpretação final dos resultados.
3.1.1 Fabricação das sondas de DNA
As sondas de DNA utilizadas nos microarranjos são sequências de DNA simples feitas de 
aproximadamente 25 a 80 nucleotídeos. Cada placa de microarranjos pode conter milhares de sondas 
diferentes, cada uma posicionada em um ponto (spot) específico.
Essas sondas são fragmentos de genes relacionados – ou que se desconfia que estejam relacionados – 
a alguma condição (câncer, doenças genéticas etc.). A ideia é avaliar se existe, na amostra a ser testada, 
material genético complementar.
Assim, o conjunto de sondas utilizadas depende do objetivo do ensaio. Por exemplo, sequências de 
genes marcadores de neoplasias malignas são usados no estudo de células de câncer; e sequências 
de um gene com diferentes combinações de polimorfismos, na investigação de uma doença genética.
38
Unidade I
3.1.2 Processamento da amostra biológica
Nosso DNA é constituído de vários genes, que são “lidos” por enzimas (RNA polimerases), capazes 
de produzir uma fita simples de RNA complementar à sequência lida. Esse RNA, após ser processado, 
passa a se chamar RNA mensageiro (mRNA) e vai para o citoplasma, a fim de fornecer aos ribossomos a 
informação necessária para que uma determinada proteína seja produzida.
Nos ensaios de microarranjos, o mRNA das células de interesse é extraído e submetido a uma reação 
denominada RT-PCR (reverse transcription – polymerase chain reaction), ou transcrição reversa. Ela é 
responsável por produzir uma cópia de DNA complementar à sequência do mRNA e, portanto, idêntica 
à sequência codificadora do gene de origem. Chamamos esse DNA complementar de cDNA.
A A
A A
T
T T
T
A A
A A
T
T T
T
A A
T
T
A A
T
T
A A
T
T
A A
T
T
A A
T
T
A A
T
T
U U
T T
A
A A
A
U U
T T
A
A A
A
U U
T T
A
A A
A
G G
G G
C
C C
C
G G
G G
C
C C
C
G G
G G
C
C C
C
C C
C C
G
G G
G
C C
C C
G
G G
G
C
C
G
G
G
5’
3’
3’
(1) (4)
(5)
(6)
3’ 3’
5’
5’
Transcriptase
reversa
Transcriptase
reversa
A A A
T
A
T
A
T
A
T
A
TT
U U UG G GC C C
5’
3’
(2) 3’
5’
A
T
A
T
A
T T
A
T
A
T
A
T
A
T
U
A
U
A
U
A
G
C
G
C
GC
G
C
G
C
G
5’
dNTPs
(3) 3’
5’
cDNA cDNA
Figura 18 – Etapas do RT-PCR: (1) isolamento do RNA molde; (2) adição de oligonucleotídeos iniciadores (primers) 
complementares ao RNA; (3) adição de nucleotídeos livres (dNTPs) e da transcriptase reversa, que se liga à região 
dupla fita referente à ligação do primer ao RNA; (4) a transcriptase reversa realiza a extensão da dupla fita a partir da 
incorporação dos nucleotídeos livres complementares à sequência de RNA; (5) a primeira fita de cDNA ainda é simples 
fita; (6) essa simples fita de cDNA servirá de molde para a obtenção de cDNA dupla fita
Adaptada de: https://bit.ly/3qNDyOK. Acesso em: 18 nov. 2021.
 Observação
Deve-se sintetizar o DNA complementar ao mRNA da amostra antes 
de realizar o ensaio, pois as moléculas de mRNA são muito instáveis e 
degradam rapidamente.
Portanto, nos ensaios com microarranjos de DNA, analisamos, indiretamente, o conjunto de mRNAs 
presentes na amostra biológica. Como cada molécula de mRNA carrega a instrução para a produção de 
uma proteína, essa é uma maneira de avaliar, indiretamente, a expressão proteica das células.
Quando o cDNA é produzido, ele é ligado a um fluoróforo, que é uma molécula que emite um sinal 
fluorescente no momento da sua ligação com a sonda.
39
BIOMEDICINA INTEGRADA
3.1.3 Hibridização do cDNA às sondas
Se adicionarmos o cDNA recém-produzido e marcado à placa com microarranjos, o que acontece? 
Nos pontos onde houver complementariedade entre a sonda e uma sequência de cDNA, ocorre o 
que chamamos de hibridização, que é marcada pela emissão de um sinal fluorescente.
Portanto, toda vez que houver emissão de fluorescência, nós saberemos que a sequência da sonda 
adicionada àquele ponto da placa estava no conjunto de mRNA da célula estudada. Além disso, quanto 
mais intensa for a fluorescência, mais cópias de mRNA com aquela sequência existiam na amostra original.
3.1.4 Análise e interpretação dos resultados
Após a etapa de hibridização, as placas são lavadas para que as moléculas que não se ligaram 
sejam eliminadas. Em seguida, uma imagem digitalizada da placa é analisada com o auxílio de um 
software específico.
Uma das aplicações clássicas da técnica de microarranjos de DNA é a comparação entre amostras 
de células neoplásicas e de célulascontrole (sem neoplasia). Para isso, é necessário usar sondas de 
cores diferentes em cada amostra – por exemplo, o cDNA correspondente às células neoplásicas, recebe 
fluoróforo vermelho, enquanto que o cDNA das células controle recebe fluoróforo verde. Quando o sinal 
em determinado spot for vermelho, significa que aquela sequência está presente somente nas células 
neoplásicas; quando o sinal for verde, a sequência está associada apenas às células controle; sinais 
amarelos querem dizer que a sequência está em ambos os grupos de células (controle e neoplásicas).
Figura 19 – Exemplo de uma placa de microarranjos de DNA. Cada ponto corresponde a um spot, que 
contém sondas com sequências específicas. Os pontos coloridos indicam que houve hibridização da 
sonda com sequências-alvo do DNA
Disponível em: https://bit.ly/30DiLCY. Acesso em: 18 nov. 2021.
40
Unidade I
 Saiba mais
O artigo a seguir fala sobre o uso dos microarranjos de DNA no 
diagnóstico do câncer, ele encontra-se disponível em:
COSTA, C. C. P. et al. Aplicação da hibridização genômica comparativa 
no diagnóstico e prognóstico das doenças oncológicas. Cereus, v. 12, n. 2. 
Disponível em: https://bit.ly/3FIKbpC. Acesso em: 18 nov. 2021.
3.2 Tipos de microarranjos
Existem diferentes configurações de microarranjos, o que torna a técnica muito versátil. Vamos, a 
partir de agora, conhecê-las.
Nos microarranjos de DNA, as sondas são sequências de DNA dupla fita ou simples fita. Elas podem 
ser impressas em uma superfície de vidro (microarranjo impresso), sintetizadas diretamente em uma 
superfície sólida (microarranjo de oligonucleotídeo sintetizado in situ), adicionadas a grânulos de sílica 
(microarranjo de alta densidade) ou depositados na placa por ação de um campo elétrico (microarranjo 
eletrônico). Todas essas técnicas são bidimensionais, ou seja, planares, por serem realizadas em uma placa. 
A técnica de microarranjos em suspensão, por sua vez, não é realizada em placa. Nela, as sondas são 
adicionadas em grânulos suspensos ou em um líquido, o que permite sua análise em citômetro de fluxo 
após a hibridização.
 Lembrete
Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e 
classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo.
Com relação ao material genético, embora a maioria dos ensaios utilize o cDNA sintetizado a partir 
do mRNA extraído da amostra de interesse, é possível também utilizar fragmentos amplificados, por 
PCR, diretamente dos genes. Esse tipo de estratégia é utilizado principalmente para detectar mutações 
ou polimorfismos.
Além dos microarranjos de DNA, existem ensaios de microarranjos que são baseados na detecção da 
interação entre proteínas ou de proteínas com o DNA.
Nos microarranjos de proteínas, as “sondas” são proteínas, peptídeos ou anticorpos depositados 
em pontos específicos de uma placa, à semelhança do procedimento realizado com as sondas de DNA. 
A interação entre as proteínas fixadas na placa e aquelas da amostra, às quais foram adicionados 
fluoróforos, resulta na emissão de um sinal fluorescente.
41
BIOMEDICINA INTEGRADA
Essa técnica possibilita o rastreamento simultâneo de uma grande quantidade de proteínas, e, 
consequentemente, resultados rápidos e abrangentes.
1. Adição de proteínas, anticorpos 
e/ou peptídeos à placa
2. Incubação com 
a amostra
(amostra)
3. Ligação específica
4. Visualização da 
fluorescência
Figura 20 – Representação esquemática de microarranjo de proteínas
Adaptada de: Neagu, Bostan e Constantin (2019).
Um exemplo desse tipo de ensaio é o estudo realizado por Jiang e colaboradores em 2020. Eles 
construíram um microarranjo contendo 18 das 28 proteínas presentes no envelope do Sars-Cov-2 e 
adicionaram o soro de pacientes já infectados com o vírus para determinar quais proteínas servem de 
antígenos para o estabelecimento de uma resposta imune humoral. Os resultados indicaram que todos 
os pacientes testados tinham anticorpos contra a proteína N e a proteína S1. Estudos assim auxiliam no 
desenvolvimento de vacinas e de testes diagnósticos para a Covid-19.
Há outro tipo de microarranjo que possibilita a análise da interação entre o DNA e as proteínas. 
Essa técnica chama-se chIP-on-chip e consiste na imunoprecipitação da cromatina (chIP, chromatin 
immunoprecipitation) e em microarranjos de DNA (chips de DNA). Ela permite a avaliação de proteínas 
que atuam no contexto da cromatina, como, por exemplo, as histonas, os fatores de transcrição, os 
fatores de regulação gênica etc.
Nos estudos de chIP-on-chip, o DNA genômico, contendo as proteínas associadas, é isolado, 
processado e submetido a uma placa com anticorpos que reconhecem especificamente a proteína que 
se deseja estudar, o que possibilita o isolamento da sequência de DNA associada a ela.
A sequência de DNA que se associa à proteína de interesse é então amplificada e adicionada de 
um fluoróforo. Em seguida, ela é submetida a uma placa de microarranjos com diferentes fragmentos 
de DNA. A presença de fluorescência indica a localização, na placa, dos fragmentos complementares 
ao DNA-alvo.
42
Unidade I
 Observação
Os ensaios realizados com anticorpos específicos adsorvidos em uma 
placa para detecção de proteínas específicas são denominados ensaios de 
elisa (enzyme-linked immunosorbent assay).
A técnica de chIP-on-chip auxilia na compreensão das proteínas que participam da regulação das 
funções do DNA em diferentes tipos celulares.
DNA genômico
Processamento 
do DNA 
genômico
Microarranjos 
de DNA
Imunoprecipitação
Anticorpo
POI POI
POI
PROT
PROT
POI
Figura 21 – Técnica de chIP-on-chip. As proteínas de interesse (POI, do inglês proteins of interest) 
estão indicadas pelas circunferências azuis
Adaptada de: https://bit.ly/3kS4Yz2. Acesso em: 18 nov. 2021.
3.3 Aplicação dos ensaios com microarranjos na pesquisa e no diagnóstico
Vamos, agora, explorar os principais usos dos ensaios com microarranjos de DNA na atualidade. Eles 
são muito utilizados no campo da pesquisa básica para se descobrir genes que estejam relacionados 
com o desenvolvimento de patologias e, como já discutido, avaliar a relação de mutações com 
diferentes doenças.
43
BIOMEDICINA INTEGRADA
Tais estudos permitiram o desenvolvimento de kits para o diagnóstico de várias condições de saúde 
e, hoje, o uso de microarranjos de DNA nas análises clínicas já é uma realidade.
 Observação
Antes do advento dos ensaios com microarranjos de DNA, não era 
possível analisar milhares de genes simultaneamente, o que tornava a 
avaliação do conjunto de genes envolvidos em uma doença custosa e 
extremamente demorada.
3.3.1 Uso dos microarranjos de DNA na pesquisa
Uma rápida busca no site PubMed, em julho de 2021, utilizando as palavras-chave “DNA microarrays” 
mostrou que 35.976 artigos foram depositados na base de dados nos últimos 10 anos!
 Observação
PubMed é um motor de busca de livre acesso à base de dados Medline de 
citações e resumos de artigos científicos na área biomédica. Ele é oferecido 
pela Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos da América.
Os ensaios de microarranjos de DNA foram utilizados como ferramenta para entender o papel de 
diferentes genes em diversas condições: nas desordens psiquiátricas; nas doenças cardiovasculares; 
em diferentes tipos de câncer; em algumas doenças infecciosas; nas alergias; na maturação dos 
sistemas orgânicos durante a embriogênese; entre outros.
A técnica tem sido utilizada inclusive na investigação de aspectos relacionados à infecção pelo 
vírus Sars-Cov-2. Existem estudos, por exemplo, que relacionam os polimorfismos no gene CCR5, que 
codifica um receptor de citocina, com a severidade da doença (CANTALUPO et al., 2021); que identificam 
os genes relacionados com as manifestações clínicas durante a remissão da doença (DUBÉ et al., 
2021); e que avaliam a susceptibilidade genética associada à manifestação dos sintomas respiratórios 
(DU et al., 2021).
 Saiba mais
Os estudos citados anteriormente estão disponíveisno site PubMed. 
É possível consultá-los em:
Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/. Acesso em: 18 nov. 2021.
44
Unidade I
3.3.2 Uso dos microarranjos de DNA no diagnóstico
Os microarranjos de DNA já são uma realidade nas análises diagnósticas. Diversos laboratórios de 
biologia molecular oferecem os mais variados arranjos de sondas de DNA com o objetivo de verificar os 
determinantes genéticos relacionados com as mais variadas condições.
A seguir, vamos conhecer os principais ensaios de microarranjos de DNA disponíveis para 
fins diagnósticos.
A análise cromossômica inclui cerca de 200.000 polimorfismos de nucleotídeo único distribuídos 
por todo o genoma e permite a detecção de deleções e de inserções cromossômicas, da perda de 
heterozigosidade e de mosaicismos, o que possibilita que qualquer defeito no DNA do paciente seja 
identificado e classificado. O exame é indicado nos casos de autismo, múltiplas anomalias congênitas, 
atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, malformações fetais, perdas gestacionais etc.
As vantagens dos ensaios de microarranjos de DNA sobre as demais técnicas utilizadas na análise 
cromossômica são a abrangência e a rapidez. Por exemplo, a técnica de hibridização in situ fluorescente 
(FISH, fluorescence in situ hybridization) necessita do cultivo prévio das células da paciente, o que 
resulta em demora superior a uma semana para a liberação dos resultados, o que não acontece com o 
uso dos microarranjos de DNA.
Além disso, a sensibilidade e a especificidade dos ensaios com microarranjos de DNA é maior, o 
que faz da técnica a mais indicada para os casos em que os exames citogenéticos e/ou o cariótipo são 
inconclusivos, ou quando desejamos aprofundar os resultados obtidos com outras técnicas.
 Saiba mais
Atualmente, já são comercializados microarranjos de DNA para 
investigação de diferentes cromossomopatias, com sondas que detectam 
deleções, duplicações e translocações específicas nos cromossomos. 
Uma breve explicação sobre esses exames está disponível em:
GENOMIKA. Microarray: O exame mais eficiente para o diagnóstico das 
cromossomopatias. Recife: Genomika/Hospital Israelita Albert Einstein, 
[s.d.]. Disponível em: https://bit.ly/3xf7pAK. Acesso em: 18 nov. 2021.
Microarranjos de DNA mais específicos permitem a avaliação da predisposição genética 
a cardiopatias. Esses testes podem ser realizados em pacientes pré-sintomáticos para fins de 
aconselhamento genético. Existem exames específicos para a detecção de arritmias hereditárias, 
de aneurisma da aorta, da síndrome de Brugada etc.
45
BIOMEDICINA INTEGRADA
Painéis específicos estão disponíveis para a avaliação genômica de diferentes tipos de câncer, 
como, por exemplo, o colorretal, o gástrico, o prostático, o endometrial etc. Além disso, é possível 
realizar ensaios que vão determinar o risco hereditário de desenvolver câncer com base na análise de 
diversos marcadores.
A avaliação do perfil genético das células neoplásicas ajuda na escolha das melhores alternativas 
terapêuticas, pois existem mutações responsáveis por diminuir a resposta do tumor a alguns fármacos 
ou por aumentar a chance de metástases.
Antes do advento das técnicas moleculares, aquelas baseadas na verificação do genoma e do 
proteoma, as neoplasias malignas eram categorizadas de acordo com sua aparência ao microscópio, o 
que trazia informações muito limitadas, baseadas apenas na morfologia do tumor.
Atualmente, já é possível classificar células neoplásicas com base nas alterações do seu genoma a 
partir dos estudos com microarranjos de DNA, e também conforme o seu perfil proteico proteoma – que 
pode ser obtido, por exemplo, pela técnica de Maldi-Tof.
O diagnóstico molecular, que engloba essas técnicas, é responsável por determinar como os genes e 
as proteínas alteradas atuam nas células neoplásicas. A partir das análises, é possível determinar padrões 
de atividade em diferentes tipos de câncer, o que determinaria sua “assinatura molecular”. Acredita-se 
que, em breve, todos os tipos de câncer poderão ser detectados pelas técnicas de diagnóstico molecular.
Análise proteômica
Espectrômetro de massas
Análise genômica
Microarranjos de DNADNA
Biópsia de tecido ou 
amostra de sangue 
do paciente
Proteínas
Figura 22 – Diagnóstico molecular de neoplasias
Adaptada de: https://bit.ly/3Dy0XXS. Acesso em: 18 nov. 2021.
A análise de ancestralidade por ensaios com microarranjos de DNA tem sido oferecida para o público 
geral. Esses testes avaliam diferentes sequências gênicas presentes no DNA genômico e mitocondrial para 
determinar de que grupos populacionais o indivíduo é descendente, além de possibilitar a avaliação da 
relação de parentesco com outros indivíduos. Eles são realizados a partir de uma amostra de saliva, que é 
enviada pelos correios para o laboratório, e podem ser adquiridos sem a necessidade de pedido médico.
 Observação
46
Unidade I
Nós herdamos nossas mitocôndrias exclusivamente de nossas 
mães e, portanto, a análise do DNA mitocondrial permite avaliar a 
ascendência materna.
O sucesso de estratégias terapêuticas baseadas em fármacos também pode ser avaliado com o uso 
de microarranjos de DNA.
A presença de polimorfismos nos genes que codificam proteínas-alvo da ação de fármacos pode 
resultar em alteração do seu efeito no organismo, que pode ser tanto maior como menor do que o 
desejado. Uma vez que os microarranjos de DNA permitem a detecção de polimorfismos, essa técnica 
possibilita avaliar o perfil farmacogenético do indivíduo.
Nesse contexto, já existem microarranjos que avaliam o perfil dos genes que codificam proteínas 
envolvidas com a ação de antidepressivos, de anti-hipertensivos, de antineoplásicos etc.
 Observação
Cada vez mais é comum que o médico solicite o perfil farmacogenético 
dos pacientes que vão usar medicação em longo prazo. Além dos 
microarranjos de DNA, essa análise pode ser realizada a partir de ensaios 
de PCR (polymerase chain reaction) e RFLP (restriction fragment length 
polymorphism). Todas essas técnicas podem ser realizadas pelo biomédico 
com especialização em biologia molecular.
4 O SISTEMA CRISPR/CAS9
Imagine se existisse uma técnica capaz de corrigir mutações presentes nos genes e, assim, curar 
doenças antes incuráveis. Ela está em desenvolvimento, e é baseada no sistema Crispr/Cas9. Vamos 
aprender mais sobre ele?
O sistema Crispr/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Crispr associated 
protein 9) é uma ferramenta baseada no sistema de defesa das bactérias e das arqueas, contra a inserção 
de DNA exógeno em seu genoma.
 Observação
A tradução de clustered regularly interspaced short palindromic repeats/
Crispr associated 9 para o português é: “repetições palindrômicas curtas 
agrupadas e regularmente interespaçadas/proteína 9 associada ao Crispr”.
47
BIOMEDICINA INTEGRADA
Essa ferramenta realiza a edição do DNA. Por apresentar essa característica, ela tem sido adaptada 
para executar, ainda de maneira experimental, alterações gênicas em seres eucarióticos, como, por 
exemplo, a correção de mutações.
As doenças genéticas, as neoplasias malignas e as infecções por retrovírus são exemplos de doenças 
cuja patogenia envolve a alteração da sequência de fragmentos de DNA presente no núcleo das células. 
As consequências são as mais variadas, a depender do gene envolvido e do tipo de mutação associada. 
Seguem alguns exemplos.
• As betalassemias são um grupo de doenças hereditárias caracterizadas por mutações no gene HBB, 
que codifica a cadeia beta da hemoglobina. Como resultado, a síntese dessa proteína diminui, 
o que pode levar a um quadro de anemia profunda.
• Algumas neoplasias malignas são resultado de mutações em genes que participam da regulação 
do ciclo celular e do reparo do DNA, o que faz com que células anormais multipliquem de 
forma desordenada.
• A Aids é a manifestação clínica da infecção pelo HIV (human immunodeficiency virus), um 
retrovírus que insere seu material genético no genomados linfócitos CD4+.
Pelo fato de essas doenças envolverem alterações no código genético, seu tratamento, na maioria 
das vezes, não envolve a cura. Uma maneira de atingir a cura seria reparar o DNA alterado ou remover 
o DNA do retrovírus do genoma do hospedeiro.
É aqui que entra o sistema Crispr/Cas9. Ele é capaz de corrigir o DNA, o que pode resultar na cura 
hipotética dessas doenças.
Vamos aprender no que se baseia essa técnica e quais são seus potenciais usos?
• Tópico 4.1: fundamentos da técnica de Crispr/Cas9 e descrição de suas etapas experimentais.
• Tópico 4.2: usos do sistema Crispr/Cas9 na pesquisa e na terapêutica.
• Tópico 4.3: vamos discutir os aspectos éticos envolvidos no uso do sistema Crispr/Cas9.
4.1 Fundamentos do uso do sistema Crispr/Cas9 na edição do DNA
4.1.1 O sistema Crispr em bactérias
Originalmente, o sistema Crispr constitui uma espécie de imunidade adaptativa das bactérias 
e arqueas.
Uma das maiores ameaças para as bactérias são os vírus bacteriófagos. Eles invadem o interior 
desses organismos e liberam seu material genético que será incorporado ao genoma do hospedeiro para 
48
Unidade I
que possa ser transcrito e traduzido nas proteínas que vão compor mais partículas virais (ciclo lítico) 
ou permanecerem quiescentes e serem transmitidos para as células-filhas no processo de fissão binária 
bacteriana (ciclo lisogênico).
Portanto, a infecção por bacteriófagos altera o funcionamento das células bacterianas e pode 
significar sua morte, o que justifica a existência de um sistema de defesa especializado, representado 
pelo sistema Crispr.
Além de defender a bactéria desses vírus, o sistema Crispr impede a incorporação, no genoma 
bacteriano, de DNA plasmidial e de transposons, que são sequências de DNA móveis. Ou seja, ele defende 
o genoma bacteriano de quaisquer alterações oriundas da incorporação de DNA exógeno.
Ciclo lítico
Ciclo lisogênico
Figura 23 – Ciclos lítico e lisogênico de replicação viral. As bactérias são representadas em verde. 
Em preto, as partículas que compõem o vírus bacteriófago. O material genético do vírus e da bactéria 
são representados, respectivamente, pelos fragmentos vermelhos e pelos círculos pretos
Adaptada de: https://bit.ly/3csgk8n. Acesso em: 18 nov. 2021.
O sistema Crispr é constituído de sequências nucleotídicas específicas (sequências palindrômicas 
curtas, com tamanho de 20 a 40 nucleotídeos) e de nucleases Cas (Crispr-associated) que participam do 
reconhecimento e da clivagem do material genético viral incorporado ao genoma bacteriano.
49
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Observação
Sequências palindrômicas são aquelas que quando lidas em ambas as 
fitas de DNA antiparalelas, no sentido 5’ → 3’, trazem a mesma informação. 
Exemplo: 5’ GAATTC 3’, cuja fita complementar é 3’ CTTAAG 5’ ou, na ordem 
direta, 5’ GAATCC 3’.
Tais sequências palindrômicas estão presentes em locais do cromossomo bacteriano denominados 
loci Crispr. Entre elas, encontram-se fragmentos de DNA viral que já infectaram aquela espécie de 
bactéria em algum momento. Os protoespaçadores, como são chamados esses fragmentos de DNA 
viral, funcionam como uma “biblioteca” que guarda informações de todos os vírus que já entraram em 
contato com a célula bacteriana.
Os loci Crispr estão distribuídos por todo o genoma bacteriano e são constituídos por três 
elementos principais:
• As sequências palindrômicas entremeadas pelos fragmentos protoespaçadores de DNA viral.
• O operon Cas, que regula a transcrição de nucleases específicas associadas ao Crispr, denominadas 
Cas1, Cas2 e Cas9, e ainda a proteína Csn2.
• Uma sequência que codifica o “RNA transativador derivada do locus Crispr” (tracrRNA).
Em branco: sequências palindrômicas
Em tons de verde: DNA protoespaçadortracrRNA
Operon Cas Arranjos Crispr
Cas9 Cas1 Cas2 Csn2tracr
Figura 24 – locus Crispr e seus componentes
O funcionamento do sistema Crispr envolve três etapas principais:
• Adaptação: montagem da “biblioteca” de fragmentos de DNA exógeno.
• Expressão: elaboração do sistema Crispr-Cas, a partir de uma nova exposição a esse DNA.
• Interferência: reconhecimento e remoção do DNA exógeno pelo sistema Crispr-Cas.
Vamos aprender em detalhes cada uma dessas etapas?
50
Unidade I
A adaptação inicia-se quando o DNA exógeno (no nosso exemplo, o DNA do bacteriófago) entra na 
célula hospedeira pela primeira vez. Como resposta, o locus Crispr é ativado, o que culmina com a produção 
das nucleases Cas1 e Cas2, que se associam para cortar o DNA estranho em pequenos fragmentos de 
aproximadamente 20 nucleotídeos. Esses fragmentos, que chamamos de protoespaçadores, são inseridos 
entre as sequências palindrômicas que caracterizam os arranjos Crispr.
De maneira resumida, frente a uma infecção por bacteriófagos, as nucleases Cas1 e Cas2 associam-se 
para cortar sequências de DNA viral e entremeá-las às sequências palindrômicas. Ajudam, assim, a 
“montar a biblioteca viral” da célula bacteriana.
 Observação
Nucleases são enzimas capazes de reconhecer e clivar sequências 
nucleotídicas específicas.
Esses fragmentos de DNA estranho incorporados ao locus Crispr passam para as gerações futuras. 
Afinal, durante o processo de fissão binária, todo o DNA cromossômico da bactéria é replicado e 
transmitido às células-filhas. Isso garante que a bactéria consiga responder rapidamente a invasões 
subsequentes.
A expressão ocorre quando a célula é reinfectada pelo bacteriófago. Nesse momento, são transcritas 
as sequências dos protoespaçadores; a nuclease Cas9; e a sequência tracr. Após a transcrição, esses 
elementos formam um complexo. A seguir, vamos entender a função de cada um deles:
• Quando o locus Crispr é transcrito e processado, são gerados diversos fragmentos de RNA, cada um 
correspondente a um DNA protoespaçador. Esses RNAs são denominados Crispr RNAs (crRNAs).
• Os fragmentos de crRNA são associados à proteína Cas9 e servem como um “guia” para o 
reconhecimento do DNA do vírus que acabou de reinfectar a bactéria.
• Esse complexo recebe, ainda, a ajuda de uma segunda molécula de RNA, denominada RNA 
transativador (tracrRNA), que constitui o terceiro integrante do locus Crispr.
Durante a interferência, ocorre o reconhecimento e a fragmentação do DNA do vírus invasor pelo 
sistema Crispr-Cas montado na etapa anterior. Ela acontece conforme descrito a seguir:
• Se o DNA viral apresentar sequência complementar ao crRNA complexado à Cas9, significa que já 
houve infecção prévia pelo bacteriófago e, portanto, sua sequência de DNA está na “biblioteca”.
• Nesses casos, ocorre ligação entre o crRNA e a sequência correspondente no DNA viral, o que 
resulta na clivagem deste último pela Cas9, fato que “livra” a bactéria de uma nova infecção.
51
BIOMEDICINA INTEGRADA
• Para que ocorra a clivagem, é necessário que haja o reconhecimento de sequências de 2 a 5 nucleotídeos 
no DNA do hospedeiro. Elas são denominadas PAM (protospacer adjacent motif), e garantem que 
a nuclease Cas9 não corte o DNA da bactéria em sítios inespecíficos.
Cromossomo 
bacteriano
Integração do DNA 
protoespaçador
Aquisição do DNA 
protoespaçador
DNA do bacteriófago
Transcrição
Cas9
Cas9 Ligação do 
crRNA ao Cas9
Clivagem do DNA 
do bacteriófago
1. Incorporação do DNA do 
bacteriófago no locus Crispr
2. Defesa contra reinfecções 
pelo bacteriófago
Cas1 Cas2
Espaçador 1 Espaçador 2
Espaçador 3
Figura 25 – O sistema Crispr/Cas9 em bactérias. A etapa de adaptação está representada 
no item 1, e as etapas de expressão e de interferência, no item 2
Adaptada de: https://bit.ly/2Z45ORL. Acesso em: 18 nov. 2021.
Esse resumo, extremamente simplificado, ajuda a entender o uso do sistema Crispr/Cas9 na edição 
de genes de eucariotos.
Imagine que esse maquinário fosse adaptado para remover sequências de nosso DNA que contenham 
mutações. Poderíamos editar virtualmente qualquer gene, correto? Com o objetivo de entendermos 
como isso é possível, vamos, agora, aprender com mais detalhes como esse sistemafoi adaptado para o 
uso nas células eucarióticas.
4.1.2 Sistema Crispr/Cas9 aplicado à edição do DNA de células eucarióticas
Em 2012, as cientistas Emmanuelle Charpentier, do Instituto Max Planck de Biologia de Infecções, 
em Berlim, Alemanha, e Jennifer Doudna, da Universidade da Califórnia em Berkeley, nos Estados Unidos, 
adaptaram o sistema Crispr de Streptococcus pyogenes para a edição do DNA de células eucarióticas 
(JINEK et al., 2012). Por esse trabalho, ambas ganharam o Prêmio Nobel de Química, em 2020.
52
Unidade I
Esse feito abriu perspectivas animadoras para o tratamento das doenças genéticas, do câncer e 
das doenças virais e mostrou ser aplicável também no melhoramento genético de plantas, entre 
outras aplicações.
A adaptação desse sistema consistiu na fusão do crRNA e do tracrRNA para gerar uma única molécula 
denominada sgRNA (single guide RNA). Nele, o crRNA apresenta sequência complementar ao gene que 
se deseja editar, o que permite que ele forme uma dupla fita com o DNA genômico. Em seguida, ocorre 
a clivagem da sequência-alvo pela Cas9.
Depois da clivagem, o sistema de reparo do DNA é ativado, o que resulta em dois cenários diferentes, 
detalhados a seguir:
• Se um oligonucleotídeo (uma sequência curta de DNA simples fita), contendo a sequência 
correta do gene, for administrado com o sistema Crispr/Cas9, esse fragmento é incorporado 
ao local da clivagem, o que resulta na correção da sequência. Esse modelo chama-se HDR 
(homology-directed repair).
• Se nenhum oligonucleotídeo for administrado, ocorre inserção ou deleção de nucleotídeos 
de maneira aleatória, o que resulta na alteração da função do gene, inclusive no nocaute, ou 
silenciamento, deste. Esse modelo chama-se NHEJ (nonhomologous end joining).
De maneira simplificada, quando se deseja corrigir um gene, usa-se o modelo HDR e, quando se quer 
silenciá-lo, utiliza-se o NHEJ.
 Saiba mais
O texto a seguir é uma breve revisão acerca do uso dessa ferramenta, 
acesse-o em:
VASCONCELOS, M. J. V.; FIGUEIREDO, J. E. F. Tecnologia CRISPR-Cas para 
edição genômica. Sete Lagoas: Embrapa Milho e Sorgo, 2015. Disponível em: 
https://bit.ly/30PgHY3. Acesso em: 18 nov. 2021.
53
BIOMEDICINA INTEGRADA
Incorporação da sequência 
de oligonucleotídeos (HDR)
Sequência PAM
Cas9sgRNA
DNA genômico
Quebra do DNA na porção 
complemenetar ao sgDNA
Inserções/deleções aleatórias 
(NHEJ)
Figura 26 – Sistema Crispr/Cas9 adaptado para a edição do DNA de células eucarióticas
Adaptada de: Savić e Schwank (2015).
4.2 Potenciais usos do sistema Crispr/Cas9
O sistema Crispr/Cas9 pode ser utilizado como ferramenta experimental para diferentes finalidades. 
Suas aplicações envolvem o silenciamento gênico, a repressão ou a indução da expressão gênica, a 
modulação da atividade de proteínas, a introdução de genes exógenos para fins de produção da proteína 
in vitro etc. Seguem alguns exemplos:
• Na pesquisa básica, pode ser utilizado para nocautear genes e, assim, entender melhor sua função; 
ou ainda a fim de direcionar a célula para a produção de proteínas específicas, cujos genes são 
resultados da edição.
• Na medicina, pode vir a constituir uma modalidade de terapia gênica capaz de corrigir genes 
mutados relacionados a doenças genéticas; combater o câncer; curar infecções por retrovírus; ou 
até mesmo induzir a compatibilidade em transplantes de órgãos originalmente não compatíveis.
• Na agricultura, pode constituir uma tecnologia barata e relativamente simples para a criação 
de plantas transgênicas resistentes a pragas ou com características fenotípicas e nutricionais 
mais vantajosas.
• Na indústria, pode facilitar a produção de fármacos, de biocombustíveis e de biomateriais por 
células cujo DNA foi editado para a geração desses produtos.
54
Unidade I
Vamos, a partir de agora, conhecer alguns exemplos do uso da técnica.
Alguns dos primeiros estudos que visam ao uso do sistema Crispr/Cas9 foram realizados em embriões 
de animais de experimentação. Esses embriões são, preferencialmente, submetidos à técnica nos estágios 
mais precoces do desenvolvimento, quando todas as suas células ainda são indiferenciadas. Isso garante 
que todas as linhagens celulares derivadas dessas células-tronco apresentem, no futuro, as modificações 
induzidas no genoma. Além disso, o número reduzido de células facilita a incorporação do sistema 
Crispr/Cas9 em todas elas.
Um aspecto importante dessa estratégia é que inclusive as células da linhagem germinativa 
conterão a modificação gênica, o que oferece a possibilidade de eliminar uma doença genética em toda 
a descendência familiar.
O estudo de Wu et al. (2013) foi um dos primeiros a usar a estratégia Crispr/Cas9 para corrigir 
uma mutação. O alvo foi o gene Crygc, que causa catarata hereditária, de padrão dominante, 
em camundongos.
Nesse estudo, o zigoto (pré-embrião unicelular) desses animais recebeu injeção do mRNA do Cas9 e 
do sgRNA com a sequência do alelo dominante do gene Crygc. O zigoto foi capaz de produzir uma Cas9 
funcionante a partir do mRNA adicionado, e essa nuclease ligou-se ao sgRNA, como esperado.
Ao migrar para o núcleo, a sequência do sgRNA ligou-se à sequência gênica do alelo dominante 
do gene Crygc, o que resultou na clivagem do alelo pela Cas9. Consequentemente, o embrião passou a 
expressar o alelo recessivo, não ligado à condição.
Outras doenças genéticas que são potenciais alvos para o sistema Crispr/Cas9 são a distrofia muscular 
de Duchenne, ligada ao cromossomo X, e as beta-talassemias, de herança autossômica dominante.
No caso da distrofia muscular de Duchenne, além de injetar o mRNA da Cas9 e o sgRNA no embrião 
do animal de experimentação, administrou-se um oligonucleotídeo com a sequência gênica correta, 
não relacionada à condição.
Portanto, nesse caso, utilizou-se o modelo HDR, que prevê a incorporação do DNA simples fita ao 
local do DNA que sofreu a excisão, de maneira a corrigir a sequência do gene e fazê-lo funcional.
 Observação
Você sabe por que, nesse caso, o HDR é o mais indicado? Pelo fato de a 
distrofia muscular de Duchenne ser uma herança ligada ao cromossomo X. 
Como os homens apresentam somente um cromossomo X, não existe outro 
alelo que compense a perda de atividade do alelo silenciado, no caso da 
utilização do NHEJ.
55
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Lembrete
Vamos reforçar o entendimento das siglas HDR e NHEJ:
HDR: a sequência mutada é clivada e substituída por outra, que não 
contém a mutação.
NHEJ: a sequência mutada é clivada e não ocorre substituição. O gene 
fica nocauteado.
Os embriões utilizados no estudo estavam em um estágio mais avançado do desenvolvimento. Como 
resultado, a edição do genoma não alcançou todas as células musculares. No entanto, com o tempo, as 
células editadas passaram a predominar, o que gerou a ausência de manifestações clínicas relacionadas 
à distrofia.
Um dos estudos mais conhecidos foi realizado em embriões humanos por Liang et al. (2015), eles 
usaram o sistema Crispr para modificar o gene da hemoglobina beta em zigotos triploides (e, portanto, 
inviáveis) portadores da beta-talassemia.
Embora o experimento tenha sido bem-sucedido no que diz respeito à modificação do gene-alvo, 
os pesquisadores observaram que a ferramenta causou a alteração de sítios inespecíficos do genoma, 
com consequências imprevisíveis, fato que levantou a discussão sobre os aspectos éticos da realização 
da edição do DNA em embriões humanos.
Em 2017, um outro estudo teve sucesso em remover o gene MYBPC3, responsável por causar 
cardiomiopatia hipertrófica das células de embriões humanos (MA et al. 2017). Nesse caso, os 
experimentos foram realizados com embriões viáveis que, no entanto, não foram transferidos para o 
útero materno.
Menos polêmico é o uso do sistema Crispr/Cas9 na edição de células somáticas, realizada após 
o nascimento do animal. Aqui, a principal dificuldade é garantir que os RNAs serão injetados nas 
células-alvo, e não em células que não necessitam de correção. Exemplos de doençastratadas pela 
técnica em animais são a tirosinemia tipo I, a hepatite do tipo B e a infecção pelos vírus HIV e HPV 
(human papillomavirus).
 Observação
O HIV e o HPV são retrovírus, cuja ação envolve a incorporação do 
material genético viral no genoma das células hospedeiras. O objetivo 
da técnica é remover o DNA viral dos cromossomos humanos e, assim, 
promover a cura.
56
Unidade I
Os ensaios em células somáticas podem ser realizados in vivo a partir da injeção próxima ao grupo 
de células cujo genoma se deseja editar, ou ex vivo, que envolve o isolamento das células de interesse, 
seu cultivo em laboratório, a incorporação do sistema Crispr/Cas9 in vitro e, depois de finalizados os 
ensaios, a reinserção das células com o genoma editado no organismo de origem.
O procedimento ex vivo apresenta como principais vantagens a possibilidade de ser realizado em 
células-tronco e a garantia de que o sistema será expresso somente nas células de interesse. A técnica 
tem sido testada como potencial tratamento das beta-talassemias, da distrofia muscular de Duchenne 
e da infecção pelo HIV, entre outras doenças.
Superbactérias, resistentes à maioria dos antibióticos, também podem ser combatidas utilizando-se 
o sistema Crispr/Cas9. Além disso, a técnica tem potencial para ser utilizada, no futuro, para o controle 
de células tumorais, a partir da alteração de genes que controlam a velocidade da sua proliferação ou 
ainda da inserção de genes capazes de causar sua morte.
Podemos pensar no uso do sistema Crispr/Cas9 até mesmo como ferramenta para analisar o 
vírus Sars-Cov-2.
Um estudo realizado em 2020 usou o Crispr/Cas9 para editar o DNA de células em cultura, de modo 
a fazê-las expressar a ECA2 (enzima conversora da angiotensina 2), considerada a porta de entrada do 
Sars-Cov-2 no organismo humano. Em seguida, pseudovírus foram utilizados para verificar a interação 
entre eles e a ECA2 e, assim, entender melhor a patogenia do vírus responsável pela Covid-19 
(YANG et al., 2020).
4.3 Aspectos éticos relacionados ao uso do sistema Crispr/Cas9 como ferramenta de 
edição do DNA
O uso da técnica Crispr/Cas9 traz diversas questões éticas, uma vez que é possível editar o genoma 
de qualquer indivíduo. Entre os aspectos levantados, encontram-se os listados a seguir:
• A edição do genoma de células germinativas e de embriões pode eliminar o risco de desenvolvimento 
de doenças genéticas, mas também pode ser utilizada para selecionar outras características que 
os pais achem desejáveis, o que pode culminar em práticas eugenistas.
• Não se conhecem os riscos em médio e longo prazos da edição do genoma de embriões. Portanto, 
ainda não é possível avaliar se os benefícios da técnica superam seus riscos. Um exemplo de risco 
potencial é a geração de mutações fora do alvo desejado.
• A edição do DNA que atinge as células germinativas será herdada pelas próximas gerações, com 
efeitos imprevisíveis sobre elas.
• A edição do genoma de plantas pode levar à perda da biodiversidade e gerar problemas ambientais, 
assim como já observado em relação a outros organismos geneticamente modificados.
57
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Saiba mais
A discussão sobre os aspectos éticos envolvidos na edição do DNA pelo 
Crispr/Cas9 é encontrada em:
CLEMENTE, G. T. Modulação gênica em embriões humanos. Actualidad 
Jurídica Iberoamericana, n. 9, p. 202-223, 2018. 
Disponível em: https://bit.ly/2Z4nvAy. Acesso em: 18 nov. 2021.
No Brasil, os experimentos de engenharia genética são regulamentados pela Lei de Biossegurança, 
de 24 de março de 2005 (BRASIL, 2005). No que diz respeito aos experimentos realizados em embriões 
humanos, que constituem, sem dúvida alguma, a discussão mais importante do ponto de vista ética, ela 
determina o que segue.
Art. 5° É permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utilização de 
células-tronco embrionárias obtidas de embriões humanos produzidos por 
fertilização in vitro e não utilizados no respectivo procedimento, atendidas 
as seguintes condições:
I – sejam embriões inviáveis; ou
II – sejam embriões congelados há 3 (três) anos ou mais, na data da publicação 
desta Lei, ou que, já congelados na data da publicação desta Lei, depois de 
completarem 3 (três) anos, contados a partir da data de congelamento.
§ 1° Em qualquer caso, é necessário o consentimento dos genitores.
§ 2° Instituições de pesquisa e serviços de saúde que realizem pesquisa 
ou terapia com células-tronco embrionárias humanas deverão submeter 
seus projetos à apreciação e aprovação dos respectivos comitês de 
ética em pesquisa.
§ 3° É vedada a comercialização do material biológico a que se refere este 
artigo e sua prática implica o crime tipificado no art. 15 da Lei n. 9.434, de 
4 de fevereiro de 1997.
Art. 6° Ficam proibidos:
I – a implementação de projeto relativo a OGM sem a manutenção de 
registro de seu acompanhamento individual;
58
Unidade I
II – a engenharia genética em organismo vivo ou o manejo in vitro de ADN/ARN 
natural ou recombinante, realizado em desacordo com as normas previstas 
nesta Lei;
III – a engenharia genética em célula germinal humana, zigoto humano 
e embrião humano;
IV – a clonagem humana.
Portanto, a edição do DNA de embriões humanos no Brasil permanece proibida perante a lei. 
No entanto, células retiradas de embriões inviáveis ou em processo de descarte podem ser utilizadas 
para fins de pesquisa.
 Observação
Antes de realizar pesquisas com material biológico, de animais ou de 
seres humanos, é necessário submeter o projeto a um Comitê de Ética em 
Pesquisa. Esses comitês são constituídos de equipes multidisciplinares, 
que incluem biomédicos, outros profissionais da saúde e até mesmo 
membros da comunidade.
59
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Resumo
Apresentamos as seguintes técnicas: Maldi-Tof, microarranjos de DNA 
e Crispr/Cas9. Também foram discutidas as novas tecnologias na área da 
hematologia e hemoterapia.
Vimos que o Maldi-Tof-MS é uma técnica de análise proteômica que 
possibilita diferenciar as espécies de microrganismos contidas em uma 
amostra. Ela permite, ao final de um único ensaio, que é realizado em 
poucos minutos, a “impressão digital” do microrganismo, o que possibilita 
sua identificação e o estabelecimento do tratamento mais adequado.
O equipamento de Maldi-Tof é composto de uma matriz polimérica, de 
uma fonte de laser e de um tubo a vácuo acoplado a um espectrômetro de 
massa. A partir dela, é possível realizar a obtenção do espectro de massas 
das proteínas presentes na amostra analisada. Como cada microrganismo 
apresenta um conjunto específico, o padrão de picos gerado pelo 
espectrômetro de massa também o é, o que permite a correta identificação 
da espécie contida na amostra.
Observamos que muitos avanços surgiram nos últimos anos nas áreas 
de hematologia clínica e de hemoterapia. Técnicas não automatizadas, que 
requerem analistas experientes e bem treinados, vêm sendo substituídas 
por técnicas de biologia molecular e métodos automatizados, como, por 
exemplo, o laboratório modular de hematologia, que agrega diferentes 
plataformas (contador hematológico, citômetro de fluxo, espectrofotômetro 
e analisador de imagens) e possibilita maior sensibilidade, especificidade e 
rapidez na análise das amostras.
A automação laboratorial permitiu, inclusive, o surgimento de novos 
parâmetros hematológicos: a contagem automatizada de granulócitos 
imaturos (IG), a contagem de plaquetas reticuladas (IPF) e o conteúdo de 
hemoglobina dos reticulócitos (RET-He), que facilitam o diagnóstico da 
sepse, das trombocitopenias e das anemias, respectivamente.
Demonstramos que os microarranjos de DNA, microarrays ou chips 
de DNA são um tipo de análise bidimensional que se baseia na adição do 
material genético em uma placa que contém vários pontos, cada um com 
uma sonda de DNA específica. Se, no material adicionado, houver uma 
sequência de nucleotídeos complementar àquela de determinada sonda, é 
gerado um sinal fluorescente. Trata-se de uma importanteferramenta na 
60
Unidade I
análise da farmacogenômica, no diagnóstico de doenças genéticas e até 
mesmo nas análises forenses.
Entendemos que os ensaios com microarranjos de DNA fazem com 
que várias sequências sejam analisadas ao mesmo tempo, o que possibilita 
a avaliação do perfil genético do indivíduo em relação à determinada 
condição – pode-se, por exemplo, avaliar sequências gênicas importantes 
na resposta a um fármaco, ou ainda as mutações em genes relacionados 
a um dado câncer.
Por fim, exibimos o sistema Crispr/Cas9, que é uma ferramenta baseada 
no sistema de defesa das bactérias e das arqueas contra a inserção de DNA 
exógeno em seu genoma. Ela tem sido adaptada para realizar, ainda de 
maneira experimental, alterações gênicas em seres eucarióticos, como, por 
exemplo, a correção de mutações.
Suas possíveis aplicações são o nocaute de genes; o direcionamento da 
produção de proteínas exógenas pelas células editadas; a correção de genes 
mutados e, assim, a cura das doenças genéticas e retrovirais; a criação de 
plantas transgênicas; a produção de biocombustíveis e de biofármacos etc.
61
BIOMEDICINA INTEGRADA
 Exercícios
Questão 1. Leia o texto a seguir.
Com a mudança na taxonomia de microrganismos resultante do desenvolvimento das técnicas de 
biologia molecular e o aumento de infecções oportunistas causadas por microrganismos anteriormente 
considerados não patogênicos, a microbiologia tradicional, baseada em aspectos fenotípicos, tem se 
tornado cada vez mais complexa. A necessidade de provas adicionais encarece e torna mais demorada a 
identificação de novas espécies, bem como das espécies já conhecidas. Ao mesmo tempo, as técnicas de 
biologia molecular, ótimas para pesquisa, não têm a mesma utilidade em laboratórios clínicos, devido, 
principalmente, ao alto custo.
Fonte: BARBOSA, M. P. Vantagens e desvantagens de MALDI-TOF MS em relação aos métodos microbiológicos tradicionais. São José 
do Rio Preto: Academia de Ciência & Tecnologia, Especialização em Microbiologia Clínica, 2015. Disponível em: https://bit.ly/3qNteGv. 
Acesso em: 18 nov. 2021.
No contexto destacado, têm surgido metodologias, como o Maldi-Tof, que apresentam mais 
vantagens na identificação de microrganismos patogênicos do que os procedimentos clássicos. Sobre 
essas vantagens, são exibidas as afirmativas a seguir.
I – O Maldi-Tof reduz o tempo de identificação tanto de bactérias quanto de fungos, mantendo alta 
sensibilidade e especificidade na identificação.
II – Há situações em que a identificação tradicional poder ser mais rápida, como nos casos de S. 
aureus e C. albicans, pois já existem testes rápidos no mercado, mas, na maioria das vezes, o Maldi-Tof 
antecipa a identificação dos microrganismos em pelo menos 1 dia.
III – Outro ponto positivo do Maldi-Tof é a redução dos custos para laboratórios de grande porte, 
pois ele proporciona economia com meios de cultura e reativos, já que usa os mesmos reagentes para a 
identificação de todos os microrganismos.
Assinale a alternativa correta.
A) Apenas a afirmativa I é correta.
B) Apenas a afirmativa II é correta.
C) Apenas as afirmativas II e III são corretas.
D) Todas as afirmativas são corretas.
E) Nenhuma afirmativa é correta.
Resposta correta: alternativa D.
62
Unidade I
Análise das afirmativas
I – Afirmativa correta.
Justificativa: de fato, como a metodologia não usa o crescimento de colônias em meios de cultura para 
posterior identificação, o tempo de análise é muito reduzido, sendo necessários apenas uma amostra e o 
equipamento para análise. O resultado é apresentado na forma de um gráfico que representa a distribuição 
das proteínas do microrganismo de acordo com sua massa. Essa informação é comparada com espectros 
de amostras de referência em um banco de dados e uma lista das espécies mais relacionadas é gerada, 
cada uma com um valor, indicando o grau de confiabilidade da identificação. Dependendo do grau, a 
amostra é identificada até o nível de gênero ou espécie. Foram feitos estudos comparando o Maldi-Tof 
com métodos fenotípicos tradicionais, e constatou-se que ele tem especificidade tão alta ou superior, com 
taxas de identificação correta geralmente superiores a 95%. Tal resultado pode ser explicado pelo fato 
de que a maioria das moléculas detectadas corresponde a proteínas ribossomais, que são altamente 
conservadas e pouco suscetíveis a alterações decorrentes de variação das condições ambientais.
II – Afirmativa correta.
Justificativa: devido à alta especificidade dos resultados e curto tempo de análise, as identificações são 
mesmo muito rápidas. Contudo, em alguns casos, o Maldi-Tof apresenta dificuldade de identificação de tipos 
com perfis de proteínas muito parecidos, como E. coli e Shigella sp. ou S. pneumoniae e alguns S. viridans. Nesses 
casos, há testes rápidos específicos que conseguem confirmar o microrganismo quase que instantaneamente. 
Por exemplo, E. coli pode ser facilmente diferenciada de Shigella sp. por um teste rápido de indol.
III – Afirmativa correta.
Justificativa: a redução de custos é outra vantagem do Maldi-Tof. Embora precise de um investimento 
inicial maior para a aquisição dos equipamentos, as rotinas utilizam poucos insumos e produtos. Ele utiliza 
os mesmos reagentes para a identificação de todos os microrganismos, ao contrário de metodologias 
tradicionais, que necessitam de uma ampla gama de meios de cultura e reagentes para a identificação.
63
BIOMEDICINA INTEGRADA
Questão 2. Leia o texto a seguir.
Cada ponto possui múltiplas cópias de um DNA de fita simples (ssDNA, do inglês single-stranded 
DNA) específico, denominado de sonda, usado para testar a presença de DNAs específicos em uma 
amostra. Nessa técnica, uma solução de ssDNAs marcados com um corante fluorescente era usada em 
um experimento de hibridização com moléculas fixadas na lâmina, nos pontos em que há sequências 
complementares. Em seguida, o resultado era digitalizado para se determinarem os pontos hibridizados. 
Cada ponto em que a sonda se associou ao alvo emitirá um sinal fluorescente, conforme o número de 
moléculas de ssDNA hibridizadas.
Fonte: SILVA-JUNIOR, A. C.; BELARMINO, L. C.; BENKO-ISEPPON, A. M. DNA microarray plataform: prospection 
technological and scientific demand. Revista Geintec (Gestão Inovação e Tecnologias), v. 8, n. 2, 
p. 4369-4380, 2018. Disponível em: https://bit.ly/3oDuwkF. Acesso em: 18 nov. 2021.
O texto faz alusão a uma técnica muito importante para a biologia molecular e a biomedicina como 
um todo. Com base nas características apresentadas, assinale a alternativa correta.
A) Microarranjos de DNA: trata-se de um conjunto de técnicas para experimentos em biologia 
molecular com o objetivo de analisar polimorfismos e níveis de expressão de transcritos que 
são usados para a análise da expressão gênica em larga escala, com aplicações nas áreas de 
agronomia, medicina veterinária, saúde humana e farmacologia forense, entre outras.
B) Maldi-Tof: realizada pela comparação da “impressão digital” gerada pelo espectro de massa 
dos peptídeos de um microrganismo desconhecido com os padrões contidos na base de dados 
ou combinando as massas de biomarcadores de organismos desconhecidos com a base de 
dados proteoma.
C) DNA recombinante: conjunto de técnicas com ampla aplicação, por meio das quais são produzidas 
mudanças genéticas em microrganismos, melhorando aspectos bioquímicos e fisiológicos.
D) PCR ou reação em cadeia da polimerase: técnica in vitro que permite a amplificação de 
sequências específicas de DNA ou RNA, sendo este último realizado a partir da síntese de ácido 
cRNA (complementar).
E) Crispr/CAS9: técnica que permite a edição de genomas para provocar mutações ou corrigir falhas 
detectadas em pontos específicos da cadeia de DNA.
Resposta correta: alternativa A.
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Unidade I
Análise das alternativas
A) Alternativa correta.
Justificativa: todas as etapas descritas no texto do enunciado combinam perfeitamente com a 
técnica de microarranjosde DNA. Dois trechos em que fica evidente essa relação são: “[...] denominado 
de sonda, usado para testar a presença de DNAs específicos em uma amostra [...]” e “cada ponto onde a 
sonda se associou ao alvo emitirá um sinal fluorescente [...]”.
B) Alternativa incorreta.
Justificativa: não se trata da técnica do Maldi-Tof, porque ela não inclui os passos citados no 
trecho do enunciado. A realização do Maldi-Tof faz o exame de um material biológico, que geralmente 
corresponde a algum patógeno (por exemplo, bactéria ou fungo) e que é colocado em uma matriz 
sólida polimérica para ser irradiado por raios laser de nitrogênio. Com isso, a amostra sofre vaporização 
e ionização de suas moléculas, e esses vapores são aspirados e direcionados a um detector que mede o 
tempo da chegada do material ao dispositivo.
C) Alternativa incorreta.
Justificativa: não se trata da técnica do DNA recombinante, porque ela não inclui os passos citados 
no trecho do enunciado. De acordo com essa técnica, para a produção do vetor de expressão gênica, 
necessita-se do uso de enzimas de restrição, que rompem a dupla fita do DNA circular bacteriano, 
inserindo o gene e a DNA ligase, catalisadora das ligações fosfodiéster. A transformação bacteriana 
acontece quando se introduz esse vetor no seu material gênico, sendo que, após a incorporação dos 
genes, a característica adquirida pelas bactérias torna-se permanente e hereditária. Elas, pelo processo 
de reprodução assexuada, geram novas células com as modificações gênicas previamente alteradas, 
resultando em células portadoras de vetores com a sequência codificadora da proteína desejada e o 
marcador de resistência.
D) Alternativa incorreta.
Justificativa: não se trata da técnica do PCR, porque ela não inclui os passos citados no trecho do 
enunciado. O PCR (ou polymerase chain reaction) é uma técnica com alta especificidade e aplicabilidade. 
Ela tem a capacidade de amplificar exponencialmente cópias de DNA a partir de pouca quantidade de 
material original (amostra). Pode ser usada em estudos de DNA obtidos de material fixado em formol ou 
em parafina, permitindo o seu uso como técnica auxiliar no diagnóstico de rotina. No PCR convencional, 
são acrescentadas às amostras originais as sequências iniciadoras complementares (primers), 
desoxirribonucleotídeos e enzima DNA-polimerase termorresistente. Em seguida, por meio da variação 
cíclica de temperaturas, ocorre a desnaturação das fitas do DNA original, o anelamento de primers 
com suas regiões específicas de cada fita e a replicação do fragmento pela enzima DNA-polimerase. 
A repetição desse ciclo por um número de vezes tem como resultado milhares de cópias da sequência 
gênica de interesse.
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BIOMEDICINA INTEGRADA
E) Alternativa incorreta.
Justificativa: não se trata da técnica Crispr/CAS9, porque ela não inclui os passos citados no trecho 
do enunciado. A técnica Crispr/CAS9 direciona a endonuclease CAS9, usando um RNA guia, para a 
quebra do DNA em um ponto específico. A partir daí, o processo de edição do genoma ocorre pela 
participação do sistema natural de reparo celular, usando, inicialmente, a ligação de extremidade não 
homóloga e a recombinação homóloga. Trata-se de uma técnica que tem sido amplamente utilizada por 
ser uma poderosa ferramenta de biologia molecular, já que pode ser adaptada para gerar mutações em 
um sítio específico de qualquer genoma, além de substituição gênica, entre outras aplicações.