Controle microbiológico de medicamentos estéreis

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Controle microbiológico de medicamentos estéreis
Prof. Magno Maciel Magalhães
Descrição
Métodos de esterilização de medicamentos e produtos para a saúde,
contextualização das chamadas “salas limpas”, locais onde eles são
produzidos, e testes laboratoriais para comprovação de sua esterilidade.
Propósito
A compreensão sobre os métodos de esterilização aplicáveis à
produção de medicamentos estéreis, as características desejáveis das
salas limpas, onde eles são produzidos, e os testes laboratoriais
utilizados para verificar se eles se encontram realmente estéreis, é
essencial para atuação do farmacêutico em todas as etapas da
produção de um medicamento, assim como em seu controle de
qualidade.
Objetivos
Módulo 1
Métodos de esterilização e validação de
processos
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Distinguir os diferentes métodos de esterilização aplicados na
produção de medicamentos estéreis.
Módulo 2
Salas e zonas limpas e indicadores biológicos
Identificar as características fundamentais das salas limpas onde os
medicamentos estéreis são produzidos.
Módulo 3
Pirogênios e teste de esterilidade
Distinguir os principais testes laboratoriais aplicados aos
medicamentos estéreis.
Introdução
Existem algumas condições que precisam ser cumpridas quando
se pensa em produção de medicamentos estéreis e outros
produtos para a saúde que tenham essa característica como
requisito obrigatório (agulhas e seringas, por exemplo). Uma
delas é a esterilização, tanto dos materiais utilizados na
produção quanto do produto, de modo a evitar que o produto
cause alguma contaminação no usuário.
Por isso, nesse conteúdo abordaremos a importância da
construção de salas e zonas limpas em indústrias, e atentaremos
para alguns conceitos e características desses espaços.
Veremos quais os principais métodos utilizados na esterelização
de produtos e matérias-primas, e como garantir que o processo
está funcionando da maneira correta. Por fim, apresentaremos

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alguns dos testes laboratoriais que precisam ser realizados em
produtos estéreis para comprovar que se encontram livres de
microrganismos e, desta maneira, evitar a contaminação do
usuário.
1 - Métodos de esterilização e validação de processos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de distinguir os diferentes métodos de esterilização
aplicados na produção de medicamentos estéreis.
Esterilidade e esterilização
Antes de falar sobre o processo de esterilização, precisamos entender o
que é esterilidade.
Esterilidade é uma condição de um produto ou substância que, após
passar por um processo de esterilização, encontra-se ausente de
microrganismos viáveis. A inativação de microrganismos pode ser
realizada por meio de métodos físicos ou químicos.
Entre os tipos de medicamentos que precisam ser estéreis, estão
aqueles administrados por:
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Além desses, as preparações para irrigação utilizadas em cirurgias, as
preparações citotóxicas (quimioterápicos, por exemplo) e outros
produtos para a saúde que entrem em contato com a corrente
sanguínea, como agulhas, seringas e bolsas de plástico para coleta de
sangue, também precisam ser estéreis.
No caso dos produtos termoestáveis (produtos metálicos como agulhas
e bisturis, alguns tipos de plásticos e vidrarias utilizadas na produção
dos medicamentos em condições assépticas), ou seja que suportam
altas temperaturas sem perder suas características, a esterilização mais
frequente é pelo calor.
No entanto, para produtos termossensíveis (vacinas, nutrição parenteral,
produtos contendo proteínas, fármacos termolábeis, entre outros), que
sofreriam alterações fisico-químicas devido ao calor, essa abordagem
 Injeções intravenosas, intramusculares ou
subcutâneas (como as vacinas injetáveis)
 Medicamentos oftálmicos (como os colírios)
 Otológicos (como os anti-in�amatórios para otite)
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não pode ser empregada e o desenvolvimento do ciclo de esterilização
depende do conhecimento da carga microbiana do produto.
Ao esterilizar um material, deseja-se remover ou
destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal,
macroscópica ou microscópica, saprófitas ou não,
porém garantindo a funcionalidade daquele material.
Contudo, esses processos não são capazes de garantir a inativação de
toxinas e enzimas celulares. A escolha do processo adequado depende
do conhecimento acerca do material a ser esterilizado, e a informação
de possíveis tipos, quantidades e fontes dos contaminantes nos
produtos contribui para assegurar o êxito da esterilização.
Agora que você já entende o que é esterilização e quais os
medicamentos que precisam ser estéreis, veja os principais métodos de
esterilização!
Esterilização por calor
A aplicação de calor é o método esterilizante mais utilizado, por ser
simples, econômico e seguro.
Alguns microrganismos são mais resistentes a esse método,
especialmente aqueles que possuem a capacidade de gerar esporos
(esporulação). Com isso, a eficiência do processo de esterilização vai
depender tanto da temperatura utilizada quanto do tempo de exposição,
e se o calor aplicado será seco ou úmido, pois a presença de água, em
geral, favorece o processo. No caso do calor seco, ocorrem processos
oxidativos, que necessitam de maiores temperaturas e tempos de
exposição, ao passo que o calor úmido provoca coagulação das
proteínas microbianas. Vamos ver os detalhes de cada um!
Calor seco
Este processo de esterilização é aplicado principalmente para materiais
sensíveis às condições utilizadas no calor úmido, e é realizado em
estufa com distribuição homogênea do calor.
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Em geral, é utilizada a temperatura de 160°C por pelo menos duas horas,
sendo que, em temperaturas acima de 220°C, também pode ser usado
para esterilizar e despirogenizar (remover pirogênios, que são
substâncias capazes de causar febre, como veremos mais à frente)
materiais como vidrarias laboratoriais vidraria laboratorial.
Exemplo de estufa industrial utilizada na esterilização por calor seco.
Vidros, metais, pós, vaselinas, gorduras, ceras, soluções e suspensões
oleosas, e tecidos especiais podem ser esterilizados pelo calor seco.
Para validar e monitorar este método, pode-se utilizar uma preparação
de esporos de Bacillus atrophaeus como indicador biológico.
Calor úmido
Nesta metodologia, é utilizado um equipamento chamado autoclave,
que gera um microambiente com vapor saturado sob pressão, que
gradualmente substitui o ar da câmara interna do equipamento.
O ciclo-padrão para esterilizar preparações aquosas é de, no mínimo,
121°C por pelo menos 15 minutos. Outras configurações podem ser
utilizadas, contanto que sejam validadas e tenham a eficácia do
processo comprovada.
A combinação de tempo e temperatura deve ser selecionada levando
em conta alguns fatores intrínsecos ao material a ser esterilizado, tais
como sua composição química, sua termolabilidade (resistência ao
calor), e a penetrabilidade do vapor no produto, além de outros
parâmetros determinados no processo de validação.
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Autoclaves industriais.
Para que o processo de esterilizaçãoseja realmente eficiente, deve-se
garantir que a distribuição dos materiais na câmara interna da autoclave
seja feita de maneira a possibilitar o contato do vapor com todo o
produto, levando em consideração as regiões de mais difícil acesso.
Como indicador biológico do processo, pode-se utilizar uma colônia de
Geobacillus stearothermophilus, e seu valor D deve ser avaliado tanto no
programa de validação do ciclo esterilização quanto na ocorrência de
alguma alteração nesse programa.
Valor D
Também conhecido como Tempo de Redução Decimal, corresponde ao
intervalo de tempo à temperatura constante de tratamento necessário para
a redução de 90% da população microbiana inicial no produto farmacêutico.
Esterilização por radiação ionizante
As radiações ionizantes são definidas como emissões de ondas
eletromagnéticas de alta energia, capazes de alterar a carga elétrica do
material que está sendo irradiado, por meio de deslocamento de
elétrons, ionizando positiva ou negativamente os átomos irradiados.
Alterar o processo de multiplicação celular e eventualmente levar o
patógeno a ser destruído.
Ao penetrar células, essas radiações geram radicais hidroxilas,
hidrogênio livre e alguns peróxidos, que causam lesões intracelulares, e
pode culminar em morte celular.
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O processo de esterilização por radiação ionizante possui algumas
vantagens, como, por exemplo:

Ser realizado a baixas temperaturas, possibilitando o seu uso para
produtos termossensíveis.

Possuir baixa reatividade química, não alterando a maioria dos
materiais.
Outra vantagem importante é o fato de existirem poucos parâmetros a
serem controlados.
Esterilizador por radiação ionizante do tipo UV.
Contudo, é imprescindível controlar a dose de radiação que possa ser
absorvida pelo produto. As principais radiações são os raios X, alfa, beta
e gama, sendo os processos utilizados para esterilização realizados a
partir do decaimento de radioisótopo (radiação gama) e radiação por
feixe de elétrons energizados com auxílio de um acelerador de elétrons.
A validação de processo de esterilização, no caso da radiação gama,
inclui:
Constatação da compatibilidade do material com o método;
Definição de como o produto será carregado e o mapeamento da
dose de radiação no interior do recipiente de esterilização, com
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identificação de possíveis áreas com doses máxima e mínima de
radiação;
Fixação do tempo de exposição e a comprovação de que ocorreu a
aplicação da dose requerida de radiação para ocorrer a
esterilização.
Já para a irradiação por feixe de elétrons devem ser validadas a
voltagem, a corrente, a velocidade da esteira transportadora e a
dimensão de varredura do feixe de elétrons.
A dose de radiação absorvida padrão utilizada para esterilização é de 25
kGy, porém, podem ser utilizadas doses maiores ou menores,
dependendo do material a ser esterilizado. Deve-se levar em conta que a
dose escolhida precisa oferecer um nível de letalidade de
microrganismos adequado e reprodutível, especialmente caso o
processo seja repetido rotineiramente.
Nesses casos, é necessário validar a eficácia dessa esterilização, por
meio da determinação da resistência da carga microbiana do produto à
radiação utilizada. Padrões de carregamento de produto específico e a
distribuição de doses mínimas e máximas absorvidas devem ser
estabelecidos. As doses absorvidas são verificadas com a utilização de
dosímetros de radiação específicos e padronizados.
Exemplo de dosímetro.
Os procedimentos de validação dessa metodologia de esterilização
podem tanto usar a exposição de um produto simulado inoculado com
um microrganismo de referência e resistente, como o Bacillus pumilus,
ou a exposição de amostras do produto acabado à dose radioativa do
processo.
No segundo caso, temos uma determinação mais verossimilhante da
resistência microbiana da amostra, contudo, esse procedimento exige
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conhecimento prévio da população de microrganismos, realizado por
meio de uma amostragem representativa de diferentes lotes de produto.
Uma vez que se conheça a carga microbiana, a dose de radiação a ser
utilizada pode ser estabelecida baseando-se em tabelas disponíveis na
literatura.
Outra metodologia que pode ser aplicada para estabelecer a dose de
radiação necessária para esterilização de um produto é aplicar
incrementos de doses de radiação até alcançar, no máximo, uma única
amostra positiva em 100 irradiadas. Essa dose capaz de esterilizar 99%
das amostras fornece o dado necessário para obtenção da dose de
radiação.
A eficiência da esterilização por radiação ionizante deve ser
periodicamente avaliada de duas maneiras, sendo elas as seguintes:
Por meio da determinação da carga de microrganismos presente
do produto estéril;
Pelo emprego do indicador biológico adequado e pela utilização de
dosímetros calibrados.
Esterilização por �ltração e química
Como �ltrar uma solução pode esterilizá-la?
Na esterilização por filtração, temos uma remoção mecânica dos
microrganismos, pelo uso de uma membrana porosa com poros bem
pequenos, que impedem a passagem dos microrganismos, sendo esse
método utilizado para esterilizar soluções termossensíveis.
O material utilizado na confecção da membrana filtrante não pode
liberar fibras ou materiais indesejáveis para a solução filtrada,
restringindo a composição do elemento filtrante a vidro, metal inerte,
polímeros sintéticos que não soltem monômeros e membranas
poliméricas.
Em geral, pode-se dizer que um filtro é composto por uma matriz porosa
por onde escorrerá o líquido e seu abrigo impermeável tanto à solução
quanto a microrganismos externos. A eficiência de um filtro depende
basicamente de três fatores:
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O efeito de peneira depende basicamente do diâmetro dos poros da
membrana filtrante, e a adsorção na matriz do filtro é condicionada à
composição e espessura do filtro e do líquido que está sendo filtrado. O
diâmetro dos poros é estimado pela capacidade da membrana de reter
microrganismos de cepas referência.
Exemplo de equipamento utilizado para filtração.
Em geral, a esterilização por filtração é efetuada com membranas de
poro de 0,2 µm, ou menor, que são capazes de reter todos os
microrganismos de uma cultura padronizada de Brevundimonas
diminuta contendo 107 microrganismos por cm2 de superfície de
membrana filtrante, sob uma pressão mínima de 30 psi (2,0 bar).
O analista é responsável pela escolha do filtro apropriado, levando em
conta as características do material a ser filtrado, de forma a atender às
necessidades específicas de esterilização, devendo investigar se
 Tamanho do poro
 Adsorção de microrganismos na matriz do �ltro
 Efeito de peneira ou exclusão
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parâmetros utilizados na produção do material em questão influenciarão
na eficiência da retenção microbiana.
Como a eficiência do processo também é influenciada pela quantidade
de microrganismos presentes na solução a ser filtrada, é interessante
determinar a presença e concentração microbiana das soluções antes
da filtração, de forma a ajustar os parâmetros, como pressão necessária
no sistema de filtro, taxa de fluxo e características da unidade filtrante.
Recomendação
Uma opção é utilizar o valor de redução logarítmica para avaliar a
capacidade de retenção do filtro. Nesse caso, um filtrode 0,2 µm, que
pode reter 107 microrganismos de uma cepa específica, terá uma taxa
de redução logarítmica de, pelo menos 7, quando utilizado nas
condições declaradas pelo fabricante ou previamente testadas para
determinada cepa.
As membranas filtrantes encontradas no mercado brasileiro atual são as
seguintes:
acetato de celulose;
nitrato de celulose;
fluorcarbonato;
polímeros acrílicos;
poliéster;
policarbonato;
cloreto de polivinila;
vinil;
nylon;
polytef;
membranas metálicas.
Os filtros de membrana polimérica possuem pontos positivos quando
comparados aos filtros antigos de porcelana ou material sinterizado,
especialmente por serem descartáveis, evitando possíveis
contaminações cruzadas.
Uma vez que boa parte da superfície representa um espaço vazio ou
aberto, ao realizar uma montagem correta do aparato, temos a
vantagem de uma alta taxa de fluxo do líquido filtrado. Por outro lado,
uma desvantagem que podemos mencionar é que, devido ao fato de a
membrana ser frágil, deve-se sempre garantir que não ocorra nenhuma
ruptura durante a montagem, esterilização prévia ou uso.
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Portanto, deve-se sempre testar o sistema de filtração antes e após o
processo de filtração, de modo a garantir sua integridade durante o
processo de filtração.
Membrana filtrante aplicada em placa de Petri contendo meio de cultivo bacteriano.
Alguns exemplos de testes de uso são os seguintes:
O teste escolhido deve ser correlacionado com a capacidade de
retenção de microrganismos, sendo o ponto de bolha o mais
comumente utilizado. Por fim, testes de controle de qualidade da
membrana, que já foram realizados pelo fabricante do filtro, não
precisam ser repetidos pelo usuário.
 Teste do ponto de bolha
 Teste de �uxo de ar difusivo
 Teste de retenção sob pressão;
 Teste de �uxo progressivo
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Aplicações da esterilização química
A esterilização química pode ser o método de escolha para produtos
que não aguentam as temperaturas empregadas no processamento por
calor seco ou úmido. O gás geralmente empregado nessa forma de
esterilização é o óxido de etileno. Porém, ele apresenta algumas
desvantagens, como suas propriedades mutagênicas, a chance de
deixar resíduos tóxicos nos produtos tratados e sua natureza altamente
inflamável, exceto quando misturado com determinados gases inertes.
Nesse caso, o procedimento de esterilização é efetuado em uma
câmara pressurizada projetada de forma semelhante às autoclaves, mas
com algumas características específicas, como um sistema que
realizará a desgaseificação da câmara após a esterilização com o
objetivo de reduzir a exposição dos usuários ao gás utilizado.
Câmara de esterilização por gás de óxido de etileno.
Com a esterilização por gás de óxido de etileno, o programa de
qualificação do processo é maior que de outros processos de
esterilização, havendo necessidade de controlar a temperatura, a
umidade, o vácuo ou a pressão positiva e, obviamente, a concentração
de gás utilizada.
É importante verificar se todos esses parâmetros críticos estejam
adequados no interior da câmara durante todo o procedimento. O
programa de validação desse processo é comumente realizado
utilizando uma amostra do produto inoculado, ou uma simulação de
produto inoculado com preparações apropriadas de esporos de Bacillus
atrophaeus.
Atenção!
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O indicador biológico sempre deve ser utilizado para monitoramento de
ciclos de rotina, e no planejamento do ciclo de esterilização por óxido de
etileno. Também deve ser considerado, quando do planejamento do
processo de esterilização, a forma como o material a ser processado
será acondicionado, e como será sua distribuição dentro da câmara de
esterilização, uma vez que a capacidade de difusão do óxido de etileno
em áreas mais internas do produto é limitada.
Por fim, é extremamente importante o controle de resíduos químicos em
produtos esterilizados por óxido de etileno, de modo a garantir um risco
mínimo de intoxicações quando ocorrer a utilização do produto.
Deve-se verificar a presença de resíduos de óxido de etileno,
etilenocloridrina e etilenoglicol, que podem ser formados na câmara de
esterilização, dependendo das condições utilizadas. Efeitos locais,
como irritação cutânea, podem ocorrer em produtos esterilizados com
gás.
Validação de processos de
esterilização
A validação é um procedimento que deve ser realizado e devidamente
documentado para comprovação de que a esterilização realizada
fornecerá produtos com o nível de garantia de esterilidade exigido na
legislação.
Uma vez que o processo esteja validado, deve-se revalidá-lo
periodicamente, e deve-se proceder um novo processo de validação
sempre que houver alterações no produto ou na sua fabricação, nos
equipamentos utilizados ou no processo de esterilização. Os principais
elementos da validação são:

Quali�cação de instalação

Quali�cação de operação

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Quali�cação de desempenho
Quali�cação de instalação
A qualificação de instalação fornece evidências documentadas de que
determinado equipamento utilizado no processo de esterilização, assim
como todos os itens auxiliares e suprimentos (como vapor, água e ar,
por exemplo) foram projetados, fornecidos, instalados, calibrados e
funcionam de acordo com as especificações.
Para isso, deve-se utilizar instrumentação adequada para monitorar os
parâmetros críticos do processo, como temperatura, tempo, umidade,
concentração do gás esterilizante ou radiação absorvida. Essa
qualificação compreende o equipamento, sua função e instalação,
confira mais a seguir:
Equipamento
Documentação gerada que deve incluir uma descrição
detalhada das características físicas e operacionais do
equipamento, seus componentes e serviços. Desenhos e
diagramas de processo e instrumentação devem ser
analisados e atualizados, se necessário.
Função
Deve-se verificar se o equipamento e os sistemas de segurança
funcionam como ditam as especificações técnicas, os ciclos
de operação estão de acordo com o definido e que não
ocorrem vazamentos das utilidades ou do esterilizador, quando
aplicável.
Instalação
Qualificação da instalação é necessária tanto para novos
equipamentos quanto na ocasião de realocação do
esterilizador existente. Ela deve ser refeita em intervalos de
tempo definidos, e quando ocorrerem alterações que possam
alterar a eficácia do processo de esterilização (reforma de
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equipamentos, ou partes, e/ou modificações nos suprimentos
de processo, por exemplo).
Quali�cação de operação
Na qualificação de operação, o objetivo é demonstrar e documentar que
o equipamento instalado é capaz de realizar o ciclo de esterilização nos
parâmetros definidos no processo. Antes de realizar a qualificação,
deve-se verificar se todos os equipamentos que serão utilizados se
encontram devidamente calibrados e documentados. Veja a seguir mais
detalhes!
Como ocorre com as autoclaves, deve-se fazer um estudo de
distribuição do calor em diversos pontos do interior da câmara, e
confirmar que ela opera dentro dos parâmetros em todos os
seus principais locais. Em ciclos de 121°C, uma variação
aceitável de temperatura na câmara vazia é ± 1°C.
Deve-se monitorar a umidade relativa, a concentração do gás e a
temperatura, assim como os sistemas de segurança. Em
esterilizadores que utilizamsoftwares de controle, deve-se
aplicar condições de falha para avaliar como será a resposta.
Deve-se verificar a penetração e distribuição dessa na carga,
utilizando dosímetros.
Esterilizadores por calor 
Esterilizadores a gás 
Esterilização por radiação ionizante 
Operação de filtros esterilizantes 
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A qualificação desta operação deve ser realizada pelo teste de
integridade dos filtros, medição da pressão aplicada e controle
da velocidade de fluxo. No caso específico desse processo, uma
vez que os líquidos esterilizados podem acabar sendo expostos
ao ambiente após o processamento, é parte integrante da
qualificação de operação da filtração, o controle ambiental e a
qualificação ou validação da área de manuseio asséptico.
Quali�cação de desempenho
Na qualificação de desempenho, deve-se comprovar que o processo de
esterilização funciona de maneira adequada, ou seja, que é atingido o
nível de esterilidade requerido, o equipamento funciona de acordo com
os critérios predeterminados e o produto final esterilizado atende aos
requisitos de segurança, qualidade e desempenho necessários após a
esterilização.
A qualificação de desempenho inclui avaliações físicas e
microbiológicas que demonstram que o processo é capaz de esterilizar
o produto sem alterá-lo, ou seja, mantendo suas características
desejadas.
São considerados, nos estudos físicos, critérios como:
 Integridade da embalagem após o processamento
 Carga teste representativa do processo
 Embalagem idêntica ao produto (no caso de produto
simulado)
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A quantidade de produtos para esterilização deve ser estabelecida e
documentada, considerando parâmetros como:
distribuição no interior da câmara;
posicionamento;
dimensões;
composição do material.
No caso de utilização de um produto simulado, este deve possuir
características físicas similares ao produto e deve ser embalado de
maneira idêntica. Além disso, deve-se realizar o pior ciclo possível de
esterilização, ou seja, usar o máximo da capacidade da câmara, nas
condições limites do processo. Nos estudos físicos, deve-se comprovar
a reprodutibilidade do processo, realizando-o em triplicata.
Nos estudos microbiológicos podem ser aplicados diferentes métodos,
baseados na inativação ou eliminação da carga microbiana natural,
inativação ou eliminação de microrganismo de referência (sobremorte
ou overkill) ou uma combinação de ambos (biocarga e indicador
biológico).
Nesses estudos, deve-se utilizar as condições mínimas do processo, de
modo a verificar se elas estão atendendo aos critérios de esterilização
desejados. Esses estudos também devem ser realizados em triplicatas,
assim como nos físicos. Os indicadores biológicos (microrganismos de
referência) utilizados devem ser posicionados em localizações
predefinidas do produto.
 Alterações visuais no produto
 Resposta de indicadores químicos ou físicos (�ta de
autoclave, por exemplo)
 Documentação e entre outros
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Validação de processos de
esterilização
Neste vídeo, o especialista falará um pouco mais sobre o processo de
validação dos processos de esterilização. Vamos lá?

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Um dos métodos mais utilizados de esterilização é o de calor
úmido, que utiliza um equipamento para gerar um ambiente quente
e cheio de vapor em alta pressão. Qual equipamento é necessário
para o método de esterilização de calor úmido?
A Filtro a vácuo.
B Câmara de gás.
C Ionizador.
D Autoclave.
E Estufa.
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Parabéns! A alternativa D está correta.
No método de esterilização por calor úmido utilizamos uma
autoclave para gerar um ambiente cheio de vapor de água em
condições de temperatura e pressão elevadas. Já os demais
equipamentos são utilizados para outros métodos de esterilização.
Questão 2
Existem alguns medicamentos e produtos para a saúde que não
podem ser esterilizados por determinadas metodologias, por serem
termossensíveis ou por reagirem quimicamente a gases que não
sejam inertes. No caso de um produto sólido termossensível e
reativo a gases não inertes, qual seria o método de esterilização
mais apropriado?
Parabéns! A alternativa B está correta.
Como é um produto sólido, não pode ser filtrado. Por ser
termossensível, não pode ser esterilizado por calor. Por reagir com
gases não inertes, não poderia ser esterilizado pelo óxido de
etileno. Portanto, o produto deve ser esterilizado por radiação
ionizante, pois esse processo é realizado a baixas temperaturas e
baixa reatividade química.
A Filtração.
B Radiação ionizante.
C Calor seco.
D Óxido de etileno.
E Calor úmido.
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2 - Salas e zonas limpas e indicadores biológicos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car as características fundamentais das
salas limpas onde os medicamentos estéreis são produzidos.
Classi�cação de salas e zonas limpas
Muitos produtos estéreis são fabricados utilizando metodologias
assépticas, ou seja, por meio de processos totalmente livres de
microrganismos, desde o início da produção até o envase do produto
acabado. Portanto, é necessário impedir a contaminação de
microrganismos nos locais de produção, em recipientes abertos durante
o envase e no produto final. Com isso, um dos fatores cruciais nesse
tipo de produção é a carga microbiana do ambiente de fabricação, que
está intimamente relacionada ao nível de garantia de esterilidade
desses produtos. Por esse motivo, existem métodos para avaliar e
controlar o estado microbiológico das chamadas salas e zonas limpas,
com variedade de equipamentos e métodos para amostragem
microbiológica.
Salas e zonas limpas são aquelas construídas e
utilizadas de modo que a introdução, geração e
retenção de partículas na área seja minimizada ou
zerada, quer dizer, a concentração de partículas em
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suspensão no ar dessas áreas é o fator principal de
controle.
Outros parâmetros ambientais, que sejam relevantes para a produção
realizada nesse local, como temperatura, umidade e pressão, são
controlados conforme necessário.
Atenção!
A norma “ABNT NBR ISO 14644-1 – Salas limpas e ambientes
controlados associados – Parte 1: classificação da limpeza do ar” traz a
classificação de limpeza do ar de salas e zonas limpas, por meio da
análise de concentração de partículas em suspensão no ar, sendo esse
documento aplicável a partículas suspensas no ar dentro de um
ambiente controlado, mas sem caracterizar a natureza das partículas.
Ou seja, ela não faz distinção entre o número de partículas não viáveis
(poeiras, por exemplo) e a concentração de microrganismos viáveis.
A indústria farmacêutica, em geral, preocupa-se principalmente com a
contaminação por partículas viáveis (microrganismos viáveis). Contudo,
no caso de produtos injetáveis, há preocupação adicional com a
contagem de partículas totais, uma vez que microrganismos não viáveis
podem gerar, por exemplo, contaminação por pirogênios.
Pode-se dizer que quanto menor o número de partículas presentes em
uma sala limpa, menoré a chance de existirem microrganismos no
ambiente.
Na tabela a seguir, estão apresentadas as classes de limpeza do ar, de
acordo com a norma ABNT NBR ISO 14644-1, baseada em limites de
partículas com tamanhos de 0,1 a 5 μm.
Classificação
(N)
Limites máximos de concentração (partículas/m
que os tamanhos co
0,1 μm 0,2 μm 0,3 μm
ISO classe 1 10 2
ISO classe 2 100 24 10
ISO classe 3 1.000 237 102
ISO classe 4 10.000 2.370 1.020
ISO classe 5 100.000 23.700 10.200
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Classificação
(N)
Limites máximos de concentração (partículas/m
que os tamanhos co
ISO classe 6 1.000.000 237.000 102.000
ISO classe 7 3
ISO classe 8 3
ISO classe 9 35
Tabela: Classes de limpeza do ar para partículas em suspensão, selecionadas para salas e
zonas limpas, de acordo com a norma ABNT NBR ISO 14644-1.
Adaptado de ABNT, 2019.
Avaliação microbiológica de salas e
zonas limpas
Monitorar somente a quantidade de partículas suspensas no ar das
salas e zonas limpas não contempla o conteúdo microbiológico do
ambiente, uma vez que os contadores de partículas normalmente
medem partículas de tamanho a partir de 0,5μm, incluindo outras
substâncias além de microrganismos. Portanto, é necessário o
monitoramento de partículas não viáveis e de microrganismos, sendo
ambos imprescindíveis para atingir as exigências referentes à
esterilidade para os produtos.
Programas de monitoramento microbiológico para
salas e zonas limpas (PMM) devem ser capazes de
veri�car se os procedimentos de limpeza e
desinfecção aplicados no ambiente estão sendo
e�cientes.
Em geral, o PMM não identi�ca e quanti�ca todos os
microrganismos nos ambientes, mas deve fornecer
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informação su�ciente para garantir que o ambiente
esteja operando na classi�cação correta.
A coleta de amostras ambientais deve ocorrer durante operações
normais, quando os materiais utilizados e produzidos estiverem na área,
as atividades de processamento estiverem acontecendo e todos os
funcionários habituais estiverem no local.
Limpeza de sala limpa. Observe nas roupas utilizadas pelo profissional, que está praticamente
todo coberto.
O PMM deve incluir a quantificação da carga microbiana presente no ar
da sala, no ar comprimido que entra no ambiente, em superfícies,
equipamentos, recipientes, pisos, paredes e vestimentas dos
funcionários. O objetivo é obter uma estimativa representativa da carga
microbiana e, uma vez compilados e analisados, os dados devem ser
analisados por pessoas devidamente treinadas.
Um exemplo de teste laboratorial que pode ser aplicado no PMM é o
teste de envase asséptico de meio de cultura, ou “Media fill”. Nesse
ensaio, o produto final é trocado por um meio de cultura de
microrganismos, com a finalidade de evidenciar se o processo de
produção e envase está ocorrendo de forma asséptica. Ele deve ser
realizado em todos os turnos em que haja produção, e sempre durante
uma operação normal da fábrica. Os meios de cultura mais indicados
são o caldo de caseína e de soja, por serem nutritivos e aplicáveis a
diversos microrganismos.
Caso se exceda a carga microbiológica de um ambiente controlado,
deve-se proceder a uma revisão minuciosa da documentação referente
ao local em questão, incluindo os documentos referentes a manutenção
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da área, processos de desinfecção executados, parâmetros físicos ou
operacionais (se ocorreram alterações na temperatura ambiental e
umidade relativa, por exemplo) e o estágio de treinamento dos
funcionários envolvidos.
Exemplo de cientista trabalhando em fluxo laminar dentro de uma sala limpa.
Finalizada a etapa de investigação, as ações adotadas podem incluir:
reforço no treinamento dos profissionais;
amostragem em frequência aumentada;
desinfecção adicional;
identificação e localização da possível fonte do microrganismo e a
reavaliação e revalidação dos atuais procedimentos operacionais
padronizados, se necessário.
A investigação deve ser totalmente documentada e arquivada no
sistema de gerenciamento da qualidade.
Outros parâmetros avaliados ao classificar uma sala ou zona limpa são
a integridade dos filtros de ar, a verificação da existência de pressão
diferencial entre sala e antessala e padrões de mudança do ar.
Um método de teste de partículas no ambiente consiste em aumentar
propositalmente a concentração de partículas no ambiente, utilizando
fumaça no entorno das áreas limpas, e visualizar o padrão de
movimentação do ar. Caso o fluxo de ar não esteja operando da maneira
correta, ocorrerá a formação de vórtices e zonas turbulentas. Dessa
forma, o padrão de fluxo de ar poderá ser ajustado para eliminar ou
minimizar efeitos indesejáveis. Esse teste é conduzido sob condições
de produção simuladas, uma vez que pode gerar contaminação, porém,
com todos os equipamentos ligados e funcionários habituais no local.
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Garantir que o ambiente está operando da maneira adequada com as
especificações dará garantia extra de que a carga microbiana do
ambiente é apropriada para processamento asséptico.
Indicadores biológicos
Um indicador biológico é uma cultura bem caracterizada de
microrganismos de referência, ou seja, já extensivamente estudada, que
possui uma resistência conhecida e estável a um processo de
esterilização. Em geral, são utilizadas bactérias formadoras de esporos,
uma vez que esses microrganismos são mais resistentes aos processos
de esterilização, com exceção da esterilização por radiação ionizante.
Indicadores biológicos podem ser utilizados na qualificação de
desempenho do equipamento de esterilização, no desenvolvimento e
estabelecimento do processo de esterilização, em processos de
obtenção de produto estéril em seu recipiente final e de esterilização de
equipamentos, materiais e componentes de embalagem empregados no
processo de fabricação asséptico, para monitorar ciclos de esterilização
e para avaliar os procedimentos de descontaminação de isoladores ou
salas limpas.
Tipos de indicadores biológicos
Existem três tipos de indicadores biológicos mais utilizados. Confira a
seguir:
Pode ser em papel de filtro, vidro, plástico, ou outro material
embalado de modo a manter a integridade e viabilidade do
material. Nesse caso, é importante garantir que nem os
carreadores, nem as embalagens contenham contaminação
química, física ou microbiológica capazes de comprometer o
desempenho e a estabilidade do indicador biológico. Os
carreadores e as embalagens primárias devem resistir ao
Esporos inoculados em um suporte ou carreador 
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transporte e manuseio até o momento do uso sem perder o
inóculo original.
Deve ser utilizada uma suspensão de esporos com valor D
conhecido, e deve-se garantir que o produto simulado, caso
necessário, não possua características que comprometam a
resistência do indicador biológico. Para produtos líquidos, é
recomendável a determinação do valor D e valor Z (elevação de
temperatura necessária para reduzir o valor D em 90%, ou
produzir a redução de um ciclo logarítmico na curva de
resistência térmica) do indicador biológico.
Trata-se de uma apresentação na qual a embalagem destinada
para incubação após a esterilização contenha o meio de cultura
necessário para a recuperação do esporo. O sistema de
indicador biológico + meio de cultivo deve ser resistente à
esterilização, mas também deve possibilitar apenetração do
agente esterilizante. Esse tipo de indicador também pode ser
uma suspensão de esporos em um meio de cultura contendo
indicador de pH que permita determinar visualmente a presença
ou a ausência de crescimento após a incubação, a partir da
mudança de coloração, ou pela turbidez decorrente do
desenvolvimento do microrganismo, ou ainda, pelo exame
microscópico do meio inoculado. Em ambos os casos, a
capacidade do meio de cultura de promover crescimento
microbiano após a exposição ao processo de esterilização deve
ser comprovada. São ideais para o monitoramento dos
processos de esterilização a vapor.
Seleção e preparo do indicador
biológico
Suspensão de esporos inoculados em unidades do
produto a ser esterilizado ou em um produto simulado 
Indicador biológico autocontido 
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Para escolher um indicador biológico apropriado para o
desenvolvimento do ciclo de esterilização e sua validação ou
monitoramento de rotina, é necessário conhecer bem o material que
será esterilizado, incluindo seus componentes e a embalagem, assim
como ter informações completas sobre a resistência do indicador frente
ao processo de esterilização utilizado no produto, garantindo que o
indicador biológico represente um desafio maior ao processo que a
carga microbiana no produto.
Deve-se, preferencialmente, utilizar indicadores
biológicos padronizados nas monografias
farmacopeicas para o desenvolvimento ou validação
de um processo de esterilização.
Quando não for possível, microrganismos “domésticos” podem ser
utilizados, desde que estes tenham sido previamente descritos em
literatura científica para preparo de indicadores biológicos. Nesse caso,
o laboratório deve ser capaz de determinar os valores D e Z para os
indicadores domésticos, e deve-se confirmar a população, pureza e
validade, de modo a garantir a confiabilidade dos testes que serão
realizados com esse indicador.
Caso a escolha do processo de esterilização seja feita pela carga
microbiana do produto, deve-se quantificar essa carga e comparar a sua
resistência ao processo com a do indicador biológico.
Dica
Pode-se também aplicar o método de sobremorte (overkill) no
desenvolvimento do processo de esterilização. Em linhas gerais, os
processos que utilizam esse método são desenvolvidos levando em
conta uma carga microbiana suposta de 106 microrganismos altamente
resistentes. Dessa maneira, o processo definido deve resultar em uma
probabilidade de não esterilidade menor que 10-6. O uso do método de
sobremorte e sua validação podem minimizar ou evitar a necessidade
de quantificação e identificação da carga microbiana do produto.
Para esterilização por calor úmido, o indicador biológico mais
recomendado são esporos de Geobacillus stearothermophilus, porém,
outros microrganismos formadores de esporos resistentes ao calor
úmido como Clostridium sporogenes, Bacillus atrophaeus e Bacillus
coagulans, também, podem ser utilizados.
No caso do calor seco, podem ser empregados esporos de Bacillus
atrophaeus. Nesses casos, também podem ser realizados estudos de
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inativação de endotoxinas bacterianas, por ser um processo muito mais
lento que a inativação dos esporos. Em geral, uma redução da ordem de
três ciclos logarítmicos do nível de endotoxina indica uma probabilidade
de não esterilidade menor que 10-6. Ou seja, se realizarmos uma
metodologia capaz de demonstrar que as endotoxinas foram inativadas
(o método LAL, por exemplo, que veremos mais à frente), podemos
inferir que os microrganismos viáveis e os esporos bacterianos também
foram inativados, uma vez que ambos são menos resistentes ao calor
que as endotoxinas.
Nos processos de esterilização por radiação ionizante, podem
ser utilizados esporos de Bacillus pumilus, contudo, o método
mais empregado é o de estabelecimento da dose de radiação,
que não usa indicadores biológicos. Já para o processo de
esterilização por óxido de etileno são utilizados esporos de
subespécies de Bacillus atrophaeus var. niger.
Todas as operações envolvidas no preparo dos indicadores
biológicos devem ser documentadas, de maneira que
possibilitem a rastreabilidade dos materiais incorporados à
suspensão microbiana, o carreador inoculado ou o indicador
biológico.
O preparo de suspensões estoque dos esporos dos microrganismos
requer o desenvolvimento de procedimentos operacionais padronizados,
incluindo o cultivo, a coleta, a etapa de purificação e sua manutenção.
As suspensões de estoque devem conter esporos latentes (não
germinativos) mantidos em meio não nutritivo, de modo a evitar sua
ativação indesejada. O indicador não deve conter nenhum
microrganismo diferente do microrganismo teste em número suficiente
que possa afetar o produto, e deve ser produzido com todas as
certificações necessárias para garantir esta ausência de contaminantes.
Escolha e preparo do indicador
biológico

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Neste vídeo, o especialista explica em mais detalhes o papel dos
indicadores biológicos. Vamos lá!
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Uma indústria farmacêutica está em vias de construir uma sala
limpa para a produção de um novo medicamento. Ao verificar os
requerimentos da sala, de acordo com a legislação, viu que os
limites máximos necessários eram de 24 partículas de 0,2 μm e 10
partículas de 0,3 μm. De acordo com a norma ABNT NBR ISO
14644-1, qual a classe máxima de sala limpa que pode ser
construída?
Parabéns! A alternativa B está correta.
De acordo com a tabela fornecida na norma ABNT NBR ISO 14644-
1, a classe máxima que pode ser construída é ISO classe 2, pois
apresenta os limites necessários de partículas de 0,2 μm e 0,3 μm.
Pode também ser construída uma sala ISO classe 1, porém, esta é
A ISO classe 1.
B ISO classe 2.
C ISO classe 3.
D ISO classe 4.
E ISO classe 5.
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de construção e manutenção mais complexa. As outras classes
ultrapassam a quantidade máxima de partículas desejada.
Questão 2
Para cada processo de esterilização existe um indicador biológico
tido como “mais indicado” para realizar o controle da esterilização.
Qual o indicador biológico mais recomendado para utilização em
processos de esterilização por calor úmido (autoclave)?
Parabéns! A alternativa C está correta.
Apesar de também poder utilizar a bactéria Bacillus atrophaeus, o
indicador mais recomendável, no caso de calor úmido, é o
Geobacillus stearothermophilus. Já os outros microrganismos não
são bons indicadores biológicos para nenhum dos processos de
esterilização estudados.
A Bacillus pumilus
B Escherichia coli
C Geobacillus stearothermophilus
D Bacillus atrophaeus
E Clostridium botulinum
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3 - Pirogênios e teste de esterilidade
Ao �nal deste módulo, você será capaz de distinguir os principais testes laboratoriais
aplicados aos medicamentos estéreis.
Teste de pirogênio
O que são pirogênios?
Os pirogênios ou contaminantes pirogênicos são substância de origem
química ou biológica capazes de gerar uma resposta febril no indivíduo.
Em geral, elas agem no centro regulador da febre, no sistema nervoso,
causando aumento da temperatura.
No caso dos medicamentos estéreis,vacinas e também equipamentos
utilizados na área da saúde, como agulhas e bolsas plásticas para
transferência de sangue e hemoderivados, é necessária a pesquisa
desses contaminantes, uma vez que entrarão diretamente na corrente
sanguínea, sendo capazes de chegar ao sistema nervoso central.
O teste de pirogênio clássico
O teste de pirogênio em coelhos é um dos mais antigos utilizados no
controle de qualidade de produtos para a saúde. Ele foi descrito por
pesquisadores no princípio do século XX e introduzido na farmacopeia
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dos Estados Unidos como método oficial na década de 1940. Em linhas
gerais, o teste fundamenta-se na medida do aumento da temperatura
corporal de coelhos, após injeção intravenosa da solução estéril em
análise.
Coelhos preparados para o teste de pirogênios.
Para o desenvolvimento desse teste, é recomendável utilizar coelhos de
ambos os sexos, da mesma raça, que se encontrem na fase adulta do
desenvolvimento, sadios, pesando ao menos 1,5kg. Eles devem ser
acondicionados em gaiolas individuais e a sala deve ser mantida em
temperatura uniforme entre 20 e 23°C, livre de perturbações que possam
estressá-los, tais como barulhos altos.
Os animais devem passar por processo de condicionamento, ou seja,
uma espécie de “treino” para o dia do teste, para evitar que a
manipulação deles comprometa o teste devido ao estresse gerado. No
momento do condicionamento, a temperatura retal dos coelhos deve ser
mensurada. Caso algum deles apresente elevação de temperatura igual
ou superior a 0,5°C, em relação à temperatura inicial, não deverá ser
utilizado no teste.
A alimentação dos animais deve ser suspensa duas horas antes do
início do teste. Antes de iniciar, os animais devem ter a temperatura
aferida novamente, e só podem ser utilizados aqueles que apresentarem
valor igual ou inferior a 39,8°C.
Deve-se usar sempre um termômetro clínico calibrado com precisão de
± 0,1°C ou outro dispositivo de registro de temperatura calibrado de
igual sensibilidade, que deve ser introduzido no reto do coelho, em uma
profundidade aproximada de 6cm.
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Posicionamento do termômetro no reto dos animais.
Administração do produto a ser testado no vaso sanguíneo periférico da orelha.
Procede-se ao preparo do produto farmacêutico a ser testado, conforme
especificado na padronizada monografia farmacopeica, que é aquecido
a (37 ± 2) °C e, então, injetado, pela veia marginal da orelha de três
coelhos.
O aumento total de temperatura é verificado pela diferença entre a maior
temperatura atingida pelo coelho durante o teste e a sua temperatura de
controle, aferida antes do início do teste.
Se nenhum dos três coelhos apresentarem aumento individual da
temperatura igual ou superior a 0,5°C, a amostra é considerada como
apirogênica. Se algum coelho apresentar aumento da temperatura igual
ou superior a 0,5°C, o teste deve ser repetido, utilizando outros cinco
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animais. Nesse caso, o produto será considerado aprovado para
ausência de pirogênios se, no máximo, três dos oito coelhos
apresentarem aumentos individuais de temperatura iguais ou superiores
a 0,5°C, e se a soma dos aumentos individuais de todos os coelhos não
exceder a 3,3°C.
O teste de pirogênio em coelhos, apesar de ser
considerado um ensaio robusto, por ser capaz de
detectar um amplo espectro de substâncias capazes
de induzir febre, e ser aplicável à grande maioria dos
produtos, não deve ser aplicado para certas classes de
medicamentos, como aqueles que interferem na
resposta imune e no mecanismo da febre, como os
analgésicos, antitérmicos e anti-inflamatórios.
Fatores relacionados ao animal, tais como diferenças entre raças e sexo
também contribuem para possíveis resultados falso-positivos e falso-
negativo. Do mesmo modo, os animais são suscetíveis à influência de
fatores relacionados ao ambiente onde são criados e onde o teste é
realizado, tais como temperatura, ruídos, umidade e ventilação.
Ao longo das últimas décadas testes in vitro para detecção de pirogênio
foram desenvolvidos visando reduzir o número de animais utilizados.
O mais aplicado e preconizado em todas as farmacopeias atuais é o
teste de endotoxinas bacterianas, mas que infelizmente não consegue
detectar todos os tipos de pirogênios.
Já o teste de ativação de monócitos (MAT) tem se mostrado ser uma
alternativa completa ao teste em coelhos, porém, ainda não é
considerado um teste farmacopeico. Por esse motivo, o teste utilizando
animais ainda é realizado em todo o mundo.
Teste de endotoxinas bacterianas
O que são endotoxinas bacterianas?
As endotoxinas constituem o principal componente lipídico da
membrana externa das bactérias Gram-negativas e são liberadas em
seu ambiente tanto durante a multiplicação bacteriana quanto no evento
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de sua morte. As endotoxinas e seus fragmentos são substâncias muito
estáveis e os processos usuais de esterilização não conseguem
removê-las, sendo necessário o uso de ácidos ou bases fortes, ou um
processo de despirogenização a 180°C por 3 horas ou 250°C por 30
minutos, que são incompatíveis com a maioria das substâncias
injetáveis, inclusive vacinas e medicamentos.
Conforme determinam os órgãos reguladores, e devido à dificuldade de
recuperação do produto contaminado, uma das maiores preocupações
dos fabricantes de medicamentos injetáveis é a contaminação por
endotoxinas, principalmente devido às suas consequências para a
saúde humana, uma vez que são pirogênicas, inflamatórias e podem ser
mortais, se seus níveis não estiverem dentro dos padrões estabelecidos.
Como é realizado o teste de endotoxinas
bacterianas?
O teste de endotoxinas bacterianas (TEB), também chamado de teste do
lisado de amebócitos do Limulus (LAL) é um teste realizado in vitro, ou
seja, sem a utilização de coelhos, que tem como base o processo de
coagulação ou gelificação de amebócitos retirados do sangue do
caranguejo ferradura (Limulus polyphemus), ao entrar em contato com
endotoxinas provenientes de bactérias Gram-negativas. É considerado
um método rápido, fácil e sensível, e possui tanto técnicas qualitativas,
como o método de coagulação em gel (Gel-Clot), e quantitativas, como
o método cromogênico-cinético, um método fotométrico.
Limulus polyphemus
O TEB de coagulação em gel é a forma mais simples do ensaio LAL, que
fornece um resultado qualitativo, ou seja, ele é capaz de indicar a
presença ou ausência de endotoxina na amostra testada.
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Ele envolve a mistura do reagente contendo os amebócitos
com a amostra em um tubo, com posterior incubação deste a
37°C (± 1°C) por 1 hora (± 2 minutos). Se a amostra estiver
contaminada com endotoxinas bacterianas, a coagulação do
líquido pelo reagente LAL será iniciada. Após o fim do período
de incubação, o tubo é, então, examinado a olho nu para
determinar se um coágulo gelatinoso se formou em seu fundo.
Um resultado positivo é indicado pela presença de um coágulo
que permanece no fundo, após uma inversão suave do tubo,
enquanto um resultado negativo é indicado pelo líquido fluido.
O método cromogênico-cinético de TEB baseia-se na medida
da cor em diferentes intervalos de tempo após a adição de um
substrato cromogênico (contendo o reagente LAL obtido dos
caranguejos e o reagente cromogênico) à amostra em teste. A
solução obtida é, então, monitoradaao longo do tempo para a
aparência de cor amarela, medida usando métodos
espectrofotométricos. Nesse caso, a quantidade de tempo
necessária para a mudança de cor ocorrer é inversamente
proporcional à quantidade de endotoxina presente. Ou seja:
quanto mais endotoxina existir na amostra, menor será o
tempo necessário para o surgimento da cor.
Podemos calcular a concentração de endotoxinas nas amostras por
interpolação do tempo obtido por meio de uma curva-padrão preparada
anteriormente. Algumas vantagens importantes desse método são que
ele pode ser totalmente automatizado para aumentar a eficiência do
teste e permite a medição de muitas amostras em um curto período por
um fácil processamento de dados. O ensaio LAL cromogênico-cinético é
um método quantitativo e é o mais sensível dos ensaios LAL, com uma
faixa de sensibilidade de 0,005 EU/ml – 50,0 EU/ml.
Infelizmente, ainda não é possível substituir o teste de pirogênio em
coelhos pelos métodos de TEB, uma vez que existem outros pirogênios
além das endotoxinas bacterianas. Porém, visando à redução do
número de animais utilizados, em geral as amostras passam
primeiramente por alguma metodologia LAL e, se forem negativas,
seguem para o teste em animais. Caso sejam positivas em TEB, o teste
em animais é desnecessário, uma vez que a amostra já será reprovada.
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Teste de esterilidade
Os testes de esterilidade são aqueles que identificam a presença de
bactérias e/ou fungos em uma amostra, e são aplicados a insumos
farmacêuticos, medicamentos prontos e produtos para saúde que, de
acordo com a farmacopeia, devem ser estéreis.
Eles devem ser executados em condições assépticas utilizando, por
exemplo, uma cabine Classe II tipo A de segurança biológica, instalada
em uma sala limpa, com classificação compatível aos requerimentos de
controle ambiental exigidos para a realização do teste. No caso de
fármacos oncogênicos, mutagênicos, antibióticos, hormônios,
esteroides e outros, os testes devem ser realizados em cabine Classe II
tipo B2, pois ela possui sistema de exaustão externo ao laboratório.
Testes em ambientes sob exposição direta de luz ultravioleta ou em
áreas sob tratamento com aerossóis podem apresentar resultados falso
negativos. Portanto, não se deve proceder o ensaio nesses ambientes.
As condições ambientais também devem evitar contaminação acidental
da amostra durante o teste, tornando os controles microbiológicos das
áreas de trabalho obrigatórios.
Existem dois meios de cultura de microrganismos, que você verá a
seguir, aplicáveis nos testes de esterilidade, que são o meio fluido de
tioglicolato e o caldo de caseína-soja.
Meio �uido de tioglicolato
Utilizado principalmente para cultura de bactérias anaeróbicas, embora,
também, possa detectar bactérias aeróbicas.
Caldo de caseína-soja
Apropriado para a cultura de leveduras, fungos e bactérias aeróbicas.
Os meios utilizados devem ser previamente esterilizados e precisam
cumprir com os critérios dos seguintes testes de adequação de meio de
cultura:
Esterilidade
Para confirmar que o meio se encontra estéril, deve-se incubar
parte do meio preparado sem inóculo nenhum, nas condições
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especificadas para cada meio, por 14 dias. Não deve ocorrer
crescimento microbiano. A ocorrência de crescimento
microbiano inutiliza o meio para o teste de esterilidade.
Promoção de crescimento
O meio de cultura esterilizado deve ser capaz de promover o
crescimento de microrganismos. Para testar essa capacidade,
deve-se incubar parte do meio preparado com microrganismos
padronizados específicos, conforme as condições definidas
para cada meio. Neste caso, o teste é positivo se for observada
evidência de crescimento microbiano, visualizado pela
turvação e/ou por métodos microscópicos, após três dias de
incubação dos meios inoculados com bactérias e após cinco
dias com fungos.
Incapacidade de matar microrganismos
É preciso ter certeza de que nenhum componente do produto a
ser testado possui atividade bacteriostática ou fungistática, ou
seja, a capacidade de matar microrganismos. O teste de
validação para bacteriostase e fungistase deve ser realizado
quando o teste de esterilidade for realizado pela primeira vez
para um produto e sempre que houver modificações na
formulação do produto e/ou nas condições experimentais do
teste.
Existem dois métodos descritos na farmacopeia brasileira para a
realização do teste de esterilidade:
filtração em membrana;
inoculação direta.
Na inoculação direta, um pequeno volume da amostra é retirado
assepticamente da unidade da amostra e inoculado diretamente em um
volume adequado de meio de crescimento antes da incubação. Embora
simples, este método de teste pode ter algumas limitações
significativas. Somente pequenos volumes de produto podem ser
inoculados no meio de cultura, o que limita a sensibilidade do teste. Se a
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amostra tiver aspecto nebuloso ou turvo após a inoculação, pode ser
complicado detectar turbidez causada pelo crescimento microbiano ao
final da incubação. Além disso, se o produto tiver propriedades
antimicrobianas, a amostra deverá ser neutralizada, de modo que o
crescimento microbiano não seja inibido.
O tipo a ser selecionado depende do produto, exceto quando já existir
uma padronização na monografia farmacopeica do produto. Em ambos
os casos, devem ser realizados controles negativos apropriados. Todos
os materiais externos (embalagens, por exemplo) devem passar por
procedimento de assepsia apropriado antes de entrar na cabine
biológica, para não comprometer o ambiente de teste.
Veja a seguir em quais produtos é possível empregar os métodos de
filtração em membrana e inoculação direta em meio de cultura:
Método de �ltração em membrana
Líquidos miscíveis em veículos aquosos;
Óleos e soluções oleosas;
Pomadas e cremes;
Sólidos solúveis (não antibióticos);
Sólidos para preparações injetáveis (não antibióticos);
Antibióticos sólidos para preparações injetáveis;
Aerossóis estéreis;
Seringas já preenchidas com ou sem agulha acoplada;
Dispositivos estéreis.
Método de inoculação direta em meio de cultura
Líquidos não oleosos;
Líquidos oleosos;
Pomadas e cremes;
Sólidos;
Categute e outras suturas cirúrgicas;
Algodão purificado, gaze, bandagem e material relacionado;
Aparelhos parenterais.
Deve-se observar os meios incubados diariamente para verificar a
ocorrência de crescimento microbiano. Se, ao final do período de
incubação, não houver presença de microrganismos, a amostra é
aprovada no teste de esterilidade. Se for evidenciado surgimento de
microrganismos, a amostra é reprovada, a não ser que se verifique
alguma falha durante a execução do teste como, por exemplo,
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contaminação não relacionada com o produto em análise. Um exemplo
de falha pode ser a detecção de crescimento microbiano nos controles
negativos. Se o teste de esterilidade for invalidado, deve-se repeti-lo.
No caso de testes positivos, é recomendada a identificação do
microrganismo contaminante, por meio de técnicas
microbiológicas/bioquímicas convencionais ou técnicas moleculares
mais sensíveis.
Teste de pirogênio
Neste vídeo, o especialista responde as principais dúvidas sobre os
testes de pirogênio clássico e alternativos. Vamos lá!

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamospraticar alguns conceitos?
Questão 1
O teste LAL possui duas metodologias distintas, uma quantitativa e
a outra apenas qualitativa. O método de coagulação em gel para
detecção de endotoxinas bacterianas se trata de um ensaio
A
quantitativo, com resposta medida pelo tamanho do
coágulo formado.
B
qualitativo, com resposta medida por métodos
espectrofotométricos.
C
quantitativo, com resposta medida pela formação
de coágulo.
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Parabéns! A alternativa D está correta.
No teste de endotoxinas bacterianas pelo método de coagulação
em gel, temos uma técnica qualitativa, capaz apenas de responder
se há ou não a contaminação por endotoxinas, através da formação
de um coágulo gelatinoso.
Questão 2
Para cada classe de produto existe um teste de esterilidade
específico descrito nos compêndios oficiais, como a farmacopeia
brasileira. Entre as classes de produtos a seguir, para qual delas é
aplicado o teste de esterilidade pelo método de filtração em
membrana?
Parabéns! A alternativa B está correta.
D
qualitativo, com resposta demonstrada pela
formação de um coágulo.
E
quantitativo, com resposta demonstrada pela
formação de um coágulo.
A Líquidos não oleosos.
B Antibióticos sólidos para preparações injetáveis.
C Líquidos oleosos.
D Categute e outras suturas cirúrgicas.
E
Algodão purificado, gaze, bandagem e material
relacionado.
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No caso dos antibióticos sólidos para preparações injetáveis, o
método correto a ser utilizado é o de filtração em membrana. Para
os demais produtos, é aplicado o método de inoculação direta em
meio de cultura.
Considerações �nais
Como vimos, os processos de esterilização são extremamente
importantes para a produção de medicamentos, especialmente os
injetáveis. Eles devem ser pensados, padronizados e executados com o
máximo rigor possível, para garantir que os produtos estejam dentro dos
parâmetros desejados, e que sejam aprovados nos testes de controle da
qualidade que também vimos neste material.
Também conhecemos um pouco sobre as salas e zonas limpas e suas
classificações, de acordo com a norma ABNT NBR ISO 14644-1, assim
como os indicadores biológicos que são utilizados para testagem e
padronização dos processos de esterilização.
Por último, estudamos a importância dos testes de pirogênio,
endotoxinas bacterianas e esterilidade, e as formas de executá-los nos
medicamentos estéreis e outros produtos para a saúde que tenham
essa característica essencial.
Podcast
Neste podcast, o especialista aborda os principais conteúdos
abordados no tema.
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Pesquise pelo artigo Aplicabilidade do Teste de Ativação de Monócitos
(MAT) no Brasil: importância da sua utilização como teste para
detecção de pirogênios no controle da qualidade de produtos injetáveis,
escrito por Silva e colaboradores (2015), e conheça um pouco sobre um
teste in vitro que pretende substituir o uso de coelhos no teste de
pirogênios.
Referências
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Norma ABNT NBR
ISO 14644-1: Salas limpas e ambientes controlados associados – Parte
1: classificação da limpeza do ar. 2. ed. Rio de Janeiro: ABNT, 2019.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Resolução RDC nº 658, de 30 de
março de 2022. Dispõe sobre as diretrizes gerais de boas práticas de
fabricação de medicamentos. Brasília: Anvisa, 2022.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Farmacopeia Brasileira. 6. ed. Brasília:
Anvisa, 2019.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. POP 65.3210.063: ensaio de
esterilidade. Rev. 3. Rio de Janeiro: Fiocruz/ INCQS, 2018.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. POP 65.3330.002: ensaio de pirogênio.
Rev. 15. Rio de Janeiro: Fiocruz/ INCQS, 2019.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. POP 65.3330.006: ensaio para
endotoxina bacteriana. Rev. 15. Rio de Janeiro: Fiocruz/ INCQS, 2020.
COUNCIL OF EUROPE. The European Pharmacopoeia. 10th ed.
Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines &
Healthcare, 2020.
THE UNITED States Pharmacopeia 43. National Formulary 38. Rockville,
MD: U.S. Pharmacopeia, 2020.
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