Controle microbiológico de medicamentos não estéreis

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Controle microbiológico de medicamentos não estéreis
Prof. Vinícius Rodrigues Viana
Descrição
As principais fontes de contaminação microbiana em produtos
farmacêuticos e cosméticos, suas técnicas de contagem e identificação
e determinação da eficácia do sistema conservante.
Propósito
O controle de qualidade microbiológico é um dos parâmetros
fundamentais de todo produto farmacêutico, pelo qual verificamos se os
produtos estão de acordo com os limites estabelecidos para presença
de microrganismos e a ausência de patógenos. O conhecimento das
técnicas de identificação e contagem nos permite assegurar a
segurança microbiológica desses produtos.
Objetivos
Módulo 1
Crescimento microbiano na indústria
farmacêutica
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Reconhecer as principais formas de contaminação de produtos
farmacêuticos.
Módulo 2
Contagem e pesquisa de patógenos
Identificar as principais técnicas de contagem e pesquisa de
microrganismos.
Módulo 3
E�cácia do sistema conservante
Reconhecer as diferentes técnicas para avaliação da eficácia do
sistema conservante e da potência de antimicrobianos.
Introdução
A contaminação por partículas biológicas é um dos principais
problemas que assola a produção de medicamentos, cosméticos
e correlatos. Ela pode ser proveniente da matéria-prima, do
processo produtivo, da estocagem ou até mesmo do uso. Para
evitar desde alterações em características organolépticas do
produto até infecções nos usuários, é importante ter um controle
de qualidade microbiológico efetivo.
Neste conteúdo, abordaremos especificamente o ramo do
controle de qualidade microbiológico de produtos não estéreis.
Esses produtos abrangem a maioria de medicamentos, de uso
oral e tópico, e cosméticos. Vamos conhecer os principais testes
para contagem de microrganismos permitidos pela farmacopeia

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e os testes para identificação de patógenos que não devem estar
presentes.
Por fim, vamos tratar da eficácia do sistema conservante em
formas farmacêuticas e cosméticas, que tem como objetivo a
preservação destas contra microrganismos durante e após a sua
produção. Vamos conhecer também os testes para avaliar a
potência de antibióticos.
1 - Crescimento microbiano na indústria farmacêutica
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as principais formas de contaminação
de produtos farmacêuticos.
Importância do controle
microbiológico
Carga microbiana em produtos farmacêuticos
Os medicamentos e cosméticos são classificados de acordo com:
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Forma física
Sólidos, líquidos e semissólidos.
Via de administração
Oral e tópico.
Esquema de doses
Dose única e multidoses.
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Carga microbiana
Produtos não estéreis ou produtos estéreis.
Entre os produtos não estéreis, estão praticamente todos os
medicamentos orais e tópicos e os cosméticos. Produtos não estéreis
podem conter algumas bactérias e fungos, desde que estejam em
quantidade que não comprometa a saúde do usuário. Isso se deve ao
fato de sua utilização se dar em regiões do corpo que possuem uma
microbiota natural e que, consequentemente, não são estéreis. Mesmo
nessas formulações, alguns microrganismos específicos devem estar
ausentes. São aqueles que, até em pequenas quantidades, podem ser
patogênicos, isto é, causar infecções.
O controle de qualidade dos medicamentos não
estéreis visa assegurar que o produto não terá sua
qualidade final ou a segurança do paciente
comprometidas pela carga microbiana ali presente.
Microrganismos contidos na microbiota humana, como Acinetobacter
spp. e Fusobacterium spp., podem atuar como oportunistas em
pacientes imunodeprimidos; por isso, a importância de se definir
quantidades máximas de microrganismos, tendo em vista o uso do
produto tanto por pacientes imunocompetentes quanto
imunodeprimidos.
Já o aspecto qualitativo deve ser definido com base em diversos
fatores. Consumo por pessoas imunodeprimidas, tipo de pele, no caso
de cosméticos, e via de administração são alguns exemplos que devem
ser levados em consideração quando estabelecidos os tipos de
microrganismos que podem estar presentes em produtos.
A presença dos microrganismos nos medicamentos pode ainda
promover sua deterioração devido à produção de enzimas que
degradam a formulação e podem afetar tanto a qualidade quanto a
segurança de medicamentos. As consequências podem ser queda da
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potência, redução da biodisponibilidade do fármaco, formação de
pigmentos e odores, formação de toxinas, ou até inativação do sistema
conservante, tornando os produtos inadequados para o uso.
Atenção!
Apesar disso, alguns produtos, mesmo portando populações
microbianas, não apresentam alterações sensoriais evidentes, sendo o
processo de controle de qualidade microbiológico fundamental em seu
contexto.
Microrganismos relevantes para o controle de
qualidade
Os microrganismos mais relevantes no controle de qualidade
farmacêutico são bactérias, fungos e, em alguns casos, vírus. Vamos
relembrar as principais características desses microrganismos!
Bactérias
São procariontes, ou seja, não possuem organelas membranosas e seu
material genético está disperso no citoplasma, organizando-se apenas
de forma unicelular. Dividimos as bactérias em dois grandes grupos, de
acordo com a composição da sua parede celular:
Gram-positivas
Possuem uma espessa parede de peptidoglicano, localizada
acima da membrana plasmática. Assim, durante o processo de
coloração de Gram, acaba conseguindo reter o cristal violeta.
Podemos citar Staphylococcus aureus, Clostridium tetani e
Streptococcus agalactie como exemplos de Gram-positivas.
Gram-negativas
Possuem uma camada fina de peptidoglicano e uma membrana
externa, na qual são encontrados lipopolissacarídeos. Na
coloração de Gram, o álcool remove o corante cristal violeta. Em
seguida, as bactérias são coradas pela fucsina, adquirindo
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coloração rosa. Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae são exemplos de Gram-negativas.
Observe a diferença na parede celular de bactérias Gram-negativas e de
Gram-positivas:
Fungos
São eucariotos, ou seja, apresentam membrana nuclear e podem se
organizar de forma uni ou pluricelular. Sua organização pluricelular
permite que variem desde a escala microscópica, chamados de
leveduras, até a escala macroscópica, com os famosos cogumelos. Em
termos de características gerais, são:
Imóveis;
Aeróbios estritos ou facultativos;
Não possuem clorofila;
A maioria é saprófita de vida livre.
Também possuem parede celular, não formada por peptidoglicano, mas
sim por manoproteínas, glucanas e quitina. Veja agora a estrutura da
parede celular em fungos:
Vírus
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São estruturas menores, mais simples, e parasitas intracelulares
obrigatórios, ou seja, dependem de células tanto procariontes quanto
eucariontes para poderem se replicar. Sua estrutura básica é a de um
ácido nucleico (DNA ou RNA)e um envoltório proteico chamado de
capsídeo. Além disso, alguns vírus podem ser envelopados, ou seja,
possuem uma bicamada lipídica externa ao capsídeo que é adquirida do
hospedeiro.
Podemos ver as principais estruturas virais no exemplo abaixo
(Influenza vírus):
Fontes de contaminação extrínsecas
A introdução da carga microbiana pode ser feita por meio das matérias-
primas e da água, nas etapas intermediárias da manipulação e durante o
envase do produto. Além disso, durante o tempo de prateleira do
produto, fatores como a composição da formulação, pH, quantidade de
água e processo produtivo podem interferir na elevação ou na redução
da carga microbiana.
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Matéria-prima
Em sua maioria, matérias-primas de origem sintética ou semissintética,
como estearato de magnésio ou ácido acetilsalicílico, utilizadas na
produção de medicamentos e cosméticos, possuem baixa carga
microbiana. Mas isso não pode ser dito de produtos de origem natural,
como drogas vegetais para medicamentos fitoterápicos, que
apresentam bastante probabilidade de possuírem contaminação por
microrganismos, que podem ser advindos do solo ou da própria
microbiota simbiótica.
Recomendação
É muito importante obter essas matérias-primas por meio de
fornecedores qualificados, fazer o controle microbiológico antes de sua
utilização em plantas industriais e, quando necessário, realizar
tratamentos físicos ou químicos para redução da carga microbiana.
Esses cuidados permitem a redução da chance de contaminação do
produto final por microrganismos que estejam presentes na matéria-
prima.
Produtos correlatos, de maneira geral, são produzidos com materiais de
origem polimérica que dificilmente carregam microrganismos,
principalmente pelas altas temperaturas utilizadas nos processos de
moldagem.
Áreas de produção e equipamentos
Na área de produção, espaços mortos, como juntas e válvulas, são
locais propensos ao acúmulo de água e resíduo de produtos, gerando
um ambiente propício para a contaminação microbiana e formação de
biofilme, uma forma persistente e de difícil eliminação de bactérias e
fungos.
Deste modo, os:
Ambiente secos
Costumam ser fonte de
bacilos Gram-positivos,
cocos e fungos, quando
Ambientes úmidos
Propiciam o
crescimento de
bactérias Gram-
negativas, em especial
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não cuidados
adequadamente.
Pseudomonas e
Acinetobacter, em locais
como pias e drenos.
Poeira e escamas da pele costumam carrear esporos bacterianos e
cocos, sendo os principais contaminantes aéreos.
Além disso, água de resfriamento e ar insuflado em processos de
extrusão, se não tiverem sua qualidade microbiológica bem controlada,
podem acabar contaminando materiais poliméricos durante sua
produção. Caso não tratada adequadamente, a água pode vir
contaminada com microrganismos, em grande parte bactérias Gram-
negativas, de origem ambiental, como Acinetobacter, Achromobacter,
Enterobacter, Flavobacterium e Pseudomonas, incluindo aquelas de
origem fecal, como Escherichia coli e bactérias provenientes de fezes de
animais, como Salmonella spp.
Para minimizar as contaminações provenientes do ambiente e dos
equipamentos, as instalações devem ter piso, parede e teto de
revestimento liso, impermeável e lavável; estar íntegros, conservados,
livres de rachaduras, trincas, goteiras, vazamentos, infiltrações, bolores e
descascamentos.
Comentário
São importantes para a qualidade microbiológica do ambiente de
produção a construção de uma antessala para controlar o acesso e
impedir pessoas sem paramentação adequada, o monitoramento de
temperatura e umidade, bem como o controle de pragas.
Os equipamentos devem ser de material inerte, livre de ranhuras que
permitam o acúmulo de microrganismos.
De maneira geral, os processos de limpeza e sanitização dos
equipamentos e da área produtiva devem estar devidamente
documentados e qualificados, a fim de minimizar a contaminação por
essas fontes.
Operadores
A contaminação carreada por operadores depende de diversos fatores,
como hábitos de higiene, que podem levar Salmonella e Escherichia coli,
bactérias comuns de origem fecal. Tratando-se da microbiota residente,
micrococos não patogênicos, difteroides e estafilococos são
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comumente transportados por operadores, bem como Staphylococcus
aureus, em alguns casos. É importante destacar que o gênero
Staphylococcus sp., assim como a principal espécie bacteriana
transmissora de infecções deste gênero: Staphylococcus
aureus, colonizam a pele de seres humanos.
A melhor forma de evitar a contaminação por operadores é o
treinamento, abordando a correta paramentação nas áreas produtivas, o
uso dos equipamentos de proteção, a importância da higiene pessoal,
as técnicas assépticas e a conduta na circulação.
Embalagens
As condições de armazenamento das embalagens podem levar à
contaminação delas pelo ambiente e, por isso, devem sempre ser limpas
antes do uso.
Para evitar a contaminação das embalagens, elas precisam ser lavadas
com água tratada, para não haver contaminação microbiana pela água, e
secas em procedimentos validados que garantam uma baixa carga
microbiana, por meio de técnicas de desinfecção.
Importância da formulação na
contaminação microbiana
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A introdução de um microrganismo patogênico no produto não é a única
parte relevante; sua interação com a formulação também é um ponto-
chave para a manutenção da carga microbiana. Em muitos casos,
componentes da própria formulação, como água e vitaminas, podem
servir como estimulantes para viabilidade e proliferação dos
microrganismos presentes naquele produto.
Durante o desenvolvimento, devemos prestar atenção em cada fator que
pode contribuir para a introdução de microrganismos, além de evitar que
os microrganismos se mantenham viáveis e com condições de
reprodução. O crescimento e a sobrevivência de microrganismos em
qualquer produto, seja ele medicamento, correlato ou cosmético, são
influenciados (inibindo ou estimulando) pela presença de conservantes
e de insumos ativos, como antibióticos e quimioterápicos. Além disso,
até mesmo alguns recipientes podem afetar o produto e atuar como
antimicrobianos.
A seguir, elencamos os fatores que podem impactar na carga
microbiana:
A característica do IFA da formulação pode facilitar ou reduzir,
por si só, a carga microbiana. IFAs como clorexidina, amoxicilina
e fluconazol, que apresentam atividade antimicrobiana, levam
naturalmente a uma redução da carga microbiana e à diminuição
da chance de proliferação dos microrganismos. Entretanto, IFAs
de caráter proteico, como as imunoglobulinas, auxiliam no
crescimento microbiano e aumentam a chance de degradação
do medicamento.
Deve-se ainda considerar que todo IFA, a princípio, é passível de
ser degradado pelo metabolismo dos microrganismos, e isso vai
afetar seriamente não só a segurança como também a eficácia
dos medicamentos.
Alguns excipientes, como açúcares, poliálcoois e minerais,
podem estimular o crescimento de microrganismos,
comprometendo a estabilidade física, química e terapêutica do
medicamento ou cosmético. Outros excipientes utilizados em
formulações de medicamentos, como lauril sulfato de sódio e
Insumo farmacêutico ativo (IFA) 
Excipientes 
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ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), apresentamatividade
antimicrobiana e ajudam a prevenir a proliferação de
microrganismos.
Em muitos casos, a existência de um sistema conservante é
crucial para que não haja o crescimento de novos
microrganismos, reduzindo a carga microbiana a níveis não
detectáveis durante a estocagem do produto. Costumam ser
adicionados apenas a formas farmacêuticas multidose, sendo
desencorajada a utilização em doses únicas, como SPGV
(Soluções Parenterais de Grande Volume).
O sistema conservante é um recurso complementar para garantir
a qualidade do produto e não substitui as boas práticas de
fabricação. São exemplos os parabenos, o cloreto de
benzalcônio, entre outros.
A viabilidade dos microrganismos também é afetada pelo pH do
meio, nesse caso, o da formulação. Geralmente, valores de pH
abaixo de 6,0 inativam o crescimento de algumas bactérias,
porém, leveduras e bolores conseguem se adaptar bem a
ambientes mais ácidos (pH entre 4,0 e 6,0). Assim, formulações
que tenham pH inferior a 4 e superior a 10 têm menor chance de
contaminação microbiana.
Apesar disso, ajustar o pH da formulação para regiões que
dificultem o crescimento microbiano não é tão simples, visto que
pode afetar atributos, como solubilidade e estabilidade.
A presença de água também é relevante porque faz com que a
formulação seja um ambiente muito propício para o crescimento
de microrganismos, principalmente formas líquidas, como
soluções, e formas semissólidas que apresentam uma boa
quantidade de água, como cremes e géis. Tais formulações
exigem a presença de sistemas conservantes eficazes.
Sistema conservante 
pH 
Água 
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Mas não é simplesmente a presença de água que causará
crescimento microbiano. Para a água favorecer o crescimento
microbiano, ela precisa estar disponível, ou seja, livre, sem estar
solvatando um componente da formulação.
Logo, quando falamos de água na formulação, devemos levar em
conta a atividade de água, que não é a mesma coisa que o teor
de umidade de uma formulação, ou matéria-prima. Isso é
importante, pois formulações como xaropes, que poderiam ser
vistos como apresentando alto teor de água, têm baixa chance
de contaminação microbiana, pois a atividade de água no xarope
é muito pequena. Quanto maior a atividade de água de uma
matéria-prima, maior a suscetibilidade a contaminação.
O controle da osmolaridade da formulação é um fator importante
para o impedimento do crescimento de microrganismos, que
dificilmente conseguem sobreviver em condições de alta
pressão osmótica, na qual a atividade da água está baixa por
causa da grande concentração de solutos.
Os tensoativos presentes na formulação podem possuir um
efeito sinérgico ou antagônico com os conservantes da fórmula,
podendo aumentar ou diminuir a carga microbiana. Além disso,
bactérias Gram-negativas têm seu crescimento melhorado sob
baixa tensão superficial, enquanto o crescimento de espécies
Gram-positivas é inibido a tensões superficiais baixas.
A disponibilidade de oxigênio pode afetar o crescimento
microbiano, tendo em vista que, enquanto alguns precisam de
oxigênio para se desenvolver (conhecidos como aeróbios e
necessitando de um potencial redox de 100-500mV), outros não
sobrevivem em ambientes com oxigênio (microrganismos
anaeróbios, que necessitam de um potencial redox em torno de
-420mV), e alguns crescem em ambos os casos (anaeróbios
facultativos como enterobactérias que crescem em uma faixa de
100 a - 600mV).
Para a proteção de algumas substâncias da formulação,
antioxidantes são utilizados, porém, devemos nos atentar que
Osmolaridade e tensão superficial 
Potencial redox 
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isso pode aumentar a sobrevivência de microrganismos
anaeróbios.
Produtos biológicos, como sangue, utilizado como substrato para a
obtenção de alguns fatores de coagulação, ou enzimas derivadas de
tecido, podem ser uma fonte de vírus que, mesmo sendo parasitas
intracelulares obrigatórios, podem sobreviver como partículas inertes.
Assim, todo processo de fabricação precisa incluir algum tratamento
para poder inativar ou remover fisicamente esse tipo de
microrganismos, como o calor, radiação, tratamento químico e filtração.
O laboratório de controle
microbiológico
Controle de qualidade em farmácias com
manipulação
O controle microbiológico é preconizado tanto em farmácia de
manipulação quanto em indústrias, sejam elas de medicamentos ou de
cosméticos, cada uma com suas especificações, de acordo com as
Resoluções da Diretoria Colegiada (RDC) vigentes.
Nas farmácias de manipulação, o controle microbiológico é muito mais
restrito, tendo em vista que seria necessária uma estrutura muito grande
que muitas delas não possuem.
Exemplo
Para matérias-primas, o laudo de um fornecedor qualificado já basta
para comprovar a qualidade microbiológica. A água purificada precisa
ser avaliada mensalmente, enquanto a água potável semestralmente, e a
água esterilizada deve ser avaliada mensalmente para bactérias e
fungos e sempre antes do uso para endotoxinas provenientes de
bactérias Gram-negativas e micotoxinas provenientes de fungos
patogênicos.
Medicamentos não estéreis estão isentos de controle microbiológico
quando não forem produzidos para ficar em estoque na farmácia, já os
produtos estéreis deverão ser avaliados a cada novo lote produzido. A
RDC 67, de 2007 possibilita que os testes microbiológicos sejam
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realizados por um laboratório terceirizado, entretanto, esses laboratórios
devem ser devidamente habilitados.
Tais laboratórios precisam ser vinculados à Rede Brasileira de
Laboratórios Analíticos em Saúde (REBLAS), constituída por
laboratórios, públicos ou privados, habilitados pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (Anvisa), capazes de oferecer serviços com
qualidade, confiabilidade, segurança e rastreabilidade.
Controle microbiológico em indústrias
Laboratórios de controle de qualidade microbiológica são usuais em
todas as indústrias que possuem minimamente um local para preparo
dos materiais (meio de cultura, diluente), além de locais para
esterilização dos materiais e capela de fluxo laminar para execução das
análises.
Os testes microbiológicos devem ser realizados para todo lote que
chegar de matéria-prima, além disso, a água purificada deve ser avaliada
semanalmente. Independentemente da classificação microbiológica,
medicamentos estéreis e não estéreis devem sempre ser submetidos a
testes microbiológicos.
O laboratório de controle de qualidade deve ser um laboratório
independente do ambiente produtivo, possuir procedimentos de
biossegurança, pessoal treinado e procedimentos validados. A
amostragem dos materiais deve sempre ser realizada de forma
asséptica, seguindo os procedimentos operacionais padrão, e todo
material que será utilizado na análise deverá ser esterilizado
previamente.
Os procedimentos devem ser realizados em uma capela de fluxo
laminar, e é necessário haver um programa de gerenciamento de
resíduos para descartar apropriadamente todos os materiais biológicos.
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Preparação de amostra microbiológica em capela de fluxo laminar.
Os laboratórios de controle microbiológico devem estar atentos às
normas de biossegurança para evitar contaminações ao ambiente e aos
manipuladores. Vamos rever as classificações de biossegurança de
acordo com os microrganismos de trabalho:
 Microrganismo Classe de Risco 1
Baixa probabilidade de contaminação e
patogenicidade individuale coletiva. Inclui
microrganismos conhecidos por não serem
patogênicos ao homem. Ex.: Lactobacillus spp. e
Bacillus subtilis.
 Microrganismo Classe de Risco 2
Moderada probabilidade de contaminação e
patogenicidade individual e baixa probabilidade
coletiva. Inclui os agentes biológicos que provocam
infecções no homem ou nos animais. Já existem
meios profiláticos e curativos. Ex.: E. coli,
S l ll P d S
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A classificação de risco dos agentes biológicos foi publicada na Portaria
2.349, de 14 de setembro de 2017, pela Comissão de Biossegurança em
Saúde (CBS), do Ministério da Saúde. Considerando a portaria, podemos
dizer que a maioria dos laboratórios de controle microbiológico de
produtos farmacêuticos será classe 2 de risco e devem ser construídos
para cumprir com os requisitos necessários. Além disso, todos os
trabalhadores deverão estar munidos dos equipamentos de proteção
individual (EPIs) adequados para a atividade.
Fontes de contaminação microbiana
Salmonella spp., Pseudomonas spp., S. aureus,
Schistosoma mansoni e vírus da rubéola.
 Microrganismo Classe de Risco 3
Alta probabilidade de contaminação e
patogenicidade individual e moderada
probabilidade coletiva. Inclui os agentes biológicos
que possuem capacidade de transmissão, alguns
por via respiratória, e que causam doenças em
humanos ou animais potencialmente letais. Já
existem meios profiláticos e/ou curativos. Ex.:
Mycobacterium tuberculosis.
 Microrganismo Classe de Risco 4
Alta probabilidade de contaminação e
patogenicidade individual e coletiva. Inclui os
agentes biológicos com grande poder de
transmissibilidade, em especial por via respiratória,
ou de transmissão desconhecida. Não existe
tratamento. Ex.: vírus ebola.

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Veja, agora, as principais fontes de contaminação extrínsecas e a
importância de características da formulação para a contaminação
microbiana.
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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
O controle de qualidade microbiológico é uma atividade importante
durante o desenvolvimento e na produção de medicamentos,
cosméticos e correlatos. Nas indústrias, é um setor independente
da produção e, nas farmácias de manipulação, costuma ser
terceirizado, porém devem seguir sempre as mesmas
classificações. De acordo com os possíveis microrganismos que
podemos encontrar nas amostras analisadas, qual é a classificação
de risco biológico de laboratórios de Controle de Qualidade
Microbiológica de medicamentos?
Parabéns! A alternativa C está correta.
A Sem risco biológico
B Classe de Risco 1
C Classe de Risco 2
D Classe de Risco 3
E Classe de Risco 4
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Tendo em vista a Portaria 2.349, de 14 de setembro de 2017, a
maioria dos laboratórios de controle microbiológico de produtos
farmacêuticos estão na classe 2 de risco, incluem agentes
biológicos que infectam homens ou animais e se caracterizam por
certa probabilidade de contaminação e patogenicidade individual e
baixa probabilidade coletiva.
Questão 2
Os medicamentos, produtos correlatos e cosméticos podem ser
contaminados por microrganismos em qualquer uma das etapas da
pré-produção, produção e pós-produção. Entre as alternativas a
seguir, qual delas está relacionada a uma fonte de contaminação
que ocorrerá antes de se iniciar a produção do medicamento?
Parabéns! A alternativa B está correta.
Alguns microrganismos podem vir com as matérias-primas,
principalmente quando provenientes de origem natural, e exigem
um processo de descontaminação prévio, para que a carga
microbiana seja baixa na hora de utilizá-las na produção.
A Contaminação ambiental
B Matéria-prima
C Armazenamento do produto
D Sistema conservante
E Interação com material de embalagem
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2 - Contagem e pesquisa de patógenos
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car as principais técnicas de contagem e
pesquisa de microrganismos.
Preparo da amostra
A análise de produtos farmacêuticos e cosméticos não estéreis abrange
três etapas:
Amostragem;
Contagem de formas viáveis;
Isolamento e identificação de microrganismos patogênicos.
Amostragem
O processo de amostragem engloba os procedimentos de coleta,
transporte e preparação da amostra para análise. A quantidade de
amostra precisa ser representativa do tamanho do lote e leva em
consideração o volume contido, o número de unidades e as operações
unitárias que representam um risco de contaminação. O esquema a
seguir resume os critérios adotados para diferentes classes, sendo N o
tamanho do lote:
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Deve-se prestar atenção na utilização de utensílios descontaminados
(limpos e estéreis) e na assepsia prévia da área próxima à coleta (saída
de válvulas, abertura realizada por corte etc.) para que não sejam
introduzidos novos contaminantes durante a amostragem. Quando essa
amostragem precisar ser feita durante etapas intermediárias do
processo, a aliquotagem deverá ser feita em local limpo, por operador
treinado, utilizando-se de recipientes, dispositivos auxiliares, espátulas
ou pipetas esterilizadas.
A manipulação asséptica é fundamental para o
sucesso do controle de qualidade, e deverá ser feita
preferencialmente em fluxos laminares.
O processo de manipulação asséptica consiste em executar
determinados processos de produção ou amostragem em ambiente
controlado, com filtros retentores de partícula, por exemplo, o filtro HEPA
Matéria-prima
Frações da parte superior,
mediana e inferior. 2√N + 1
Produtos em processo
Triplicata no início, meio e fim do
processo.
Produto terminado
Triplicata no início, meio e fim do
processo de enchimento.
Lotes muito pequenos
N < 200: 2 unidades.
N < 100: 1 unidade.
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(alta eficiência para partículas do ar ou filtro absoluto com eficiência
mínima de 99,97%) ou o ULPA (filtros de ar ultrabaixo particulados com
eficiência mínima de 99,99996%) visando minimizar o risco de
contaminação do produto.
Adequação da amostra
Após a aliquotagem, é necessário verificar a atividade antimicrobiana do
próprio produto, em razão da presença de conservantes, para evitar
falso negativo. É importante a inativação do conservante com
substâncias químicas adequadas, previamente esterilizadas e validadas,
além do ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade.
Conservante ou antimicrobiano             Inativante            
Clorados Tiossulfato de sódio 0,5
Sais de NH4+ Polissorbato 80 3,0% + le
Fenóis e derivados Polissorbato 80 1,0%
Tensoativos anfóteros Polissorbato 3,0% + lecit
Parabenos Polissorbato 80 e lecitin
Antibiótico beta‐lactâmico Beta‐lactamase
Sulfonamida Ácido para-aminobenzoi
Tabela: Inativantes específicos para agentes antimicrobianos de formas farmacêuticas e
cosméticas.
Pinto et al., 2015. p. 101.
A diluição e correta homogeneização da amostra compreendem uma
parte fundamental do sucesso da análise. O processo de
homogeneização deve ser realizado em equipamentos que não utilizem
altíssimas velocidades, para não levar à morte os microrganismos,podendo também ser feitas homogeneizações manuais ou em almofariz
previamente esterilizados.
O processo de diluição dependerá da forma farmacêutica, podendo
exigir um tratamento específico para compatibilizar a amostra com o
diluente empregado. Todas as operações utilizadas pretendem viabilizar
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a contagem e a pesquisa de microrganismos e devem ser validadas
para assegurar a confiabilidade do teste.
Podemos resumir as principais adequações que devem ser realizadas
para cada forma farmacêutica e devemos ter o cuidado para que
diluentes e aditivos estejam sempre estéreis:
 Produtos hidrossolúveis
10g ou mL (mistura de amostras) + diluente.
 Produtos de natureza não lipídica insolúveis
em água
10g ou mL (mistura de amostras) + diluente. Usar
Tween 80 a 0,1% para facilitar a dispersão.
 Produtos de natureza lipídica
Método 1: 1g ou mL (mistura de amostras) +
100mL miristato de isopropila com posterior
filtração (40-45°C); Método 2: 10g ou mL + Tween
80 ou 20 a 5% + diluente; Diluições: adicionar
Tween.
 Cremes e pomadas insolúveis em miristato
10g + diluente + 0,1% tetradecilsulfato de sódio +
Aquecimento (40-45°C).
 Dispositivos transdérmicos
R ti lí l t t b i f d i
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Os diluentes estéreis biocompatíveis mais utilizados são água salina
(0,9% de NaCl), água peptonada (0,1 % de peptona), caldo lactosado,
caldo caseína soja (TSB) e caldo lauril sulfato triptose. A diluição
depende de diversos fatores, como a quantidade de produto e a carga
microbiana permitida, sendo as mais comuns 100, 10-1,10-2 e 10-3,
conforme imagem:
Esquema de diluição de formas farmacêuticas e cosméticas para ensaios microbiológicos.
Outro ponto importante e que deve ser visto antes de se iniciar os testes
é verificar se o meio de cultura selecionado possui capacidade nutritiva,
ou seja, se ele é capaz de promover o crescimento das bactérias e
fungos em análise.
Basicamente, fazemos esse teste tanto com meios líquidos quanto com
meios sólidos que são inoculados com não mais que 100 UFC do
microrganismo de interesse para aquele meio. Para meios sólidos, é
considerado um crescimento satisfatório maior que 2 em escala
logarítmica em relação à quantidade de microrganismo inoculada; já
para meios líquidos sua aprovação está condicionada a um crescimento
visível e comparável com lotes anteriores.
Retirar a película protetora e cobrir face adesiva
com gaze; 10 unidades + 500mL diluente + agitação
≤ 30 minutos.
 Correlatos
Algodão e gaze: 3 x 3,3g + diluente; Outros: 10
unidades + diluente + contato 10-30 minutos.
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Comentário
Em ambos os casos, é necessário um controle negativo, que deverá ser
incubado nas mesmas condições e não deverá apresentar crescimento
microbiano.
Limites farmacopeicos
Para produtos não estéreis, os limites de carga microbiana são definidos
de acordo com o produto e a via de administração. Por exemplo, para
produtos aquosos e não aquosos:
Produtos aquosos (uso oral de origem
sintética ou biológica
Têm um limite de 102 UFC/g ou mL de produto para bactérias totais e
102 UFC/g ou mL para fungos totais, desde que se comprove ausência
de Escherichia coli.
Produtos não aquosos
Mantém-se a comprovação de ausência de E. coli, entretanto, os limites
de bactérias e fungos totais passam a ser de 102 UFC/g ou mL e 103
UFC/g ou mL, respectivamente.
Os demais produtos (tópicos, inalatórios, vaginais, transdérmicos)
mantêm o limite de 102 UFC/g ou mL de produto para bactérias totais e
102 UFC/g ou mL para fungos totais.
Ausência de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus deve ser
constatada em todos os produtos, e o teste de ausência de Candida
albicans deve ser feito nos produtos para uso vaginal.
Vejamos agora os limites de carga microbiana, de acordo com sua
origem:
Produtos acabados de origem vegetal (uso
oral)
Devem apresentar ausência de Escherichia coli, Salmonella spp., e de
bactérias bile tolerantes, cujo limite máximo é de 10³ em 1g ou mL e
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está relacionado ao processo de pré-tratamento.
Produtos de origem vegetal (uso tópico,
vaginal e inalatório)
Devem apresentar ausência de Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus. Além disso, devem-se realizar testes de
ausência de Clostridium spp., para uso tópico, de Candida albicans, para
uso vaginal, e de Gram-negativas bile tolerantes, para uso inalatório.
Matérias-primas e bases galênicas devem apresentar ausência de
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus em
1g ou mL do produto e, caso sejam de origem vegetal, comprovar a
ausência de Escherichia coli e Salmonella e se as bactérias Gram-
negativas bile tolerantes estão dentro dos limites especificados.
Recomendação
Algumas considerações são necessárias para os testes de contagem de
microrganismos totais. Resultados de contagem de bactérias e fungos
dentro dos limites aceitáveis não excluem a necessidade da pesquisa de
patógenos e, caso o produto se enquadre em mais de uma situação,
prevalecerão os limites mais restritivos.
Técnicas de contagem de
microrganismos
Principais técnicas
Os métodos de contagem de microrganismos servem para determinar o
número total de bactérias mesofílicas e fungos em produtos e matérias-
primas não estéreis e verificar se o produto satisfaz às exigências
farmacopeicas de carga microbiana.
Podemos dividir os métodos em técnicas quantitativas e
semiquantitativa:
Mesofílicas
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Microrganismos que apresentam uma temperatura ideal de crescimento em
média de 20 a 45°C
Quantitativas
Técnica de semeadura em profundidade - pour plate, técnica de
semeadura em superfície e técnica de filtração em membrana.
Semiquantitativa
Contagem do número mais provável (NMP).
Confira mais sobre cada técnica!
Técnicas quantitativas
Semeadura em profundidade (pour plate)
Essa técnica tem por diferencial possibilitar o crescimento de
microrganismos tanto aeróbios quanto anaeróbios. É preciso garantir
que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito
quente para não matar as células microbianas.
A técnica pode ser resumida da seguinte forma: é iniciada com a adição
das diluições da amostra a placas de petri estéreis e, em seguida, deve-
se verter aproximadamente 15 a 20mL de meio de cultura fundido a ±
45°C e homogeneizar com posterior incubação das placas em estufas
reguladas, com temperatura adequada.
Método de espalhamento em profundidade para contagem e isolamento de microrganismos.
Os meios mais utilizados são:
Ágar caseína soja (tryptic soy agar ou TSA);
Ágar nutriente (NA);
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Ágar padrão para contagem (PCA).
Tais meios devem ter composição completa para possibilitar o
crescimento dos possíveis contaminantes, além de fatores que confiram
seletividade e diferenciação, caso seja necessária sua identificação.
Para bactérias mesófilas aeróbicas, o pH do meio deverá ser 7,0, com
incubação entre 30 e 35°C, por 3 a 5 dias; já para fungos, deverá ser
utilizado ágar sabouraud dextrose ou ágar batata dextrose (PDA) com
pH ajustado para 5,6, com adição de ácido tartárico para inibição do
crescimento bacteriano, além de a temperatura de incubação ficar em
torno de 20°C a 25°C,por 5 a 7 dias.
Saiba mais
Somente as placas que apresentarem número de colônias inferior a 250
(bactérias) e 50 (bolores e leveduras) deverão ser consideradas para o
registro dos resultados. Deve-se utilizar a média aritmética das placas
de cada meio e calcular o número de UFC por grama ou mL do produto.
Semeadura em superfície (spread plate)
Em contrapartida, a técnica de semeadura em superfície, apesar de
obter o crescimento dos microrganismos em toda a superfície da placa,
só possibilita o crescimento de bactérias aeróbias.
Conheça as vantagens e as desvantagens da técnica de semeadura em
superfície:
Vantagens
Não afeta
microrganismos
sensíveis ao calor,
possibilita maior
oxigenação, além de
melhorar visualização
das colônias.
Desvantagens
O pequeno volume de
material semeado
causa menor
sensibilidade e
aplicabilidade restrita.
Nessa técnica, o meio de cultura é preparado, distribuído em placas de
petri e previamente solidificado. Em seguida, cerca de 0,1mL a 0,5mL da
diluição considerada é adicionada na superfície do ágar e espalhada
com auxílio de bastão de vidro ou alça de Drigalsky, até que todo o

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líquido tenha sido absorvido. A incubação é feita com placas não
invertidas entre 20 e 25°C, por 5 a 7 dias.
Método de espalhamento em superfície para contagem e isolamento de microrganismos.
Após a incubação, deve-se utilizar a média aritmética das placas de
cada meio e calcular o número de UFC por grama ou mL do produto da
seguinte forma:
Por exemplo, se 42 colônias estão presentes em uma placa com
diluição 1:100:
Técnica de �ltração em membrana
Nessa técnica, recomendada pela Farmacopeia Brasileira, alíquotas do
produto sob forma líquida, ou suas diluições, são filtradas em
equipamento que possibilite a transferência da membrana para os
meios de cultura.
Em geral, membranas de nitrato de celulose com dimensões de poro de
0,47µm ou 0,22µm e 47mm de diâmetro são mais utilizadas para
soluções aquosas, oleosas ou fracamente alcoólicas, e as membranas
de acetato de celulose, para soluções fortemente alcoólicas.
 Microrganismo  (
UFC
mL
) =
N
0 de Colônias 
 Diluição 
 Microrganismo  (
UFC
mL
) =
42
10−2
= 42 × 102 = 4200 = 4, 2 × 103UFC/mL
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Membrana em meio de cultura com crescimento de coliformes após a filtração de 100mL de
água.
Esse método é vantajoso por permitir volumes elevados na
amostragem, 10mL, ou a quantidade de diluição que represente 1g ou
1mL da amostra a ser testada (se necessário, diluir a amostra de forma
a obter contagem de colônias entre 10 e 100 UFC).
As membranas devem ser imediatamente transferidas para a superfície
de uma placa contendo ágar caseína soja, incubando a (32,5 ± 2,5)°C,
durante três a cinco dias, para determinação do número de
microrganismos aeróbicos totais, enquanto outra membrana deverá ser
transferida a superfície de uma placa contendo ágar sabouraud dextrose
e incubar a (22,5 ± 2,5)°C, durante cinco a sete dias, para a determinação
de bolores e leveduras.
Segundo a Farmacopeia Brasileira 6ª Edição, sempre
que possível, a técnica de filtração em membrana
deverá ser utilizada.
Técnica semiquantitativa: número mais provável (NMP)
A técnica do número mais provável (NMP) indica uma faixa que reflete o
número de microrganismos presentes. É uma técnica que apresenta
como vantagem melhor recuperação de microrganismos debilitados,
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além de ser aplicável a espécies sensíveis ao calor e em amostras com
baixa contaminação.
Apesar da sua maior imprecisão em relação aos outros métodos
descritos, ainda é recomendado e muito empregado, inclusive como
método oficial, no controle microbiológico de medicamentos,
cosméticos, alimentos e águas.
Recomendação
Para amostras pouco solúveis e translúcidas, como alguns tipos de
emulsões, e, caso haja opacidade, é necessário diferenciar a turbidez da
amostra com a do crescimento microbiano adotando o recurso de
subculturas.
Nessa metodologia, diferentemente das demais, são empregados meios
líquidos, utilizando diluições seriadas das amostras inoculadas neles
(1:10, 1:100 e 1:1000). São feitas em triplicata, e a presença ou ausência
dos microrganismos de interesse em dada diluição da amostra original
pode ser analisada estatisticamente para estimar a carga microbiana da
amostra original.
A Farmacopeia disponibiliza uma tabela que faz a relação entre o
número de tubos positivos e o número mais provável de
microrganismos por g ou mL do produto. Vamos ver o experimento
mostrado na imagem a seguir para entender melhor:
Técnica do Número Mais Provável
Nesse ensaio, foram realizadas cinco replicatas de cada uma das
concentrações do produto. Os tubos azuis apresentam crescimento, e
os verdes não têm crescimento. Ou seja, em:
1:10, temos 4 tubos positivos;
1:100, 2 tubos positivos;
1:1000, apenas 1 tubo positivo.
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Esse padrão de números positivos por diluição é comparado com a
tabela e fornece o número mais provável de microrganismos por 100mL
(no caso da tabela indicada) da amostra.
Bactérias Gram-negativas a serem
pesquisadas
Os meios de cultura utilizados nos testes iniciais são gerais e promovem
o crescimento sem seletividade, por isso, é necessário proceder com
testes de identificação para fechar o laudo de análise.
Esses testes compreendem morfologia colonial, teste de coloração de
Gram e testes bioquímicos para a confirmação do microrganismo.
Atualmente, os contemplados nos testes de pesquisa de patógenos são
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella spp.,
Escherichia coli, bactérias Gram-negativas bile tolerantes (BGNBT),
Clostridium sulfito redutores e Candida albicans.
Curiosidade
A pesquisa desses microrganismos é necessária, pois são os principais
patógenos encontrados no ambiente de produção, em operadores e
matérias-primas, que podem oferecer riscos ao paciente.
Todas as amostras devem passar por uma etapa de pré-enriquecimento,
preferencialmente em caldo caseína de soja, sendo incubadas a (32,5 ±
0,5)°C, durante 18 a 24 horas, para garantir a recuperação dos
microrganismos, se presentes no produto. Podem ser realizados testes
de identificação por métodos clássicos e/ou automatizados, desde que
seja validada a sua equivalência com os métodos Farmacopeicos.
Pseudomonas aeruginosa
É uma bactéria Gram-negativa que costuma causar infecções em
indivíduos com sistema imunológico comprometido, infectando
aparelho respiratório, aparelho urinário, queimaduras, e causando outras
infecções sanguíneas, além de severos problemas nos olhos, podendo
levar à cegueira.
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Após a técnica de enriquecimento, o principal meio de cultura
recomendado é o ágar cetrimida, com incubação por 18 a 72 horas em
temperatura de 30 a 35°C. Esse ágar é seletivo para P. aeruginosa, visto
que a cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina), composto amônio
quaternário, inibe uma vasta variedade de outros organismos, incluindo
outras espécies de Pseudomonas e organismos relacionados. Além
disso, possibilita a produção de piocianina, devido à presença de cloreto
de magnésio e sulfato de potássio na composição do meio.
Pseudomonas aeruginosa em ágar cetrimida.
A piocianina é um dos principais fatores de virulência dessa espécie de
Pseudomonas e apresenta uma coloração verde fluorescente quandoirradiado por luz ultravioleta. A produção de piocianina pode ser
empregada como teste bioquímico confirmatório. Outros testes
bioquímicos importantes são motilidade positiva, redução de nitrato a
nitrito, indol negativo, ácido sulfídrico negativo e Lisina negativo, que
podem ser visualizados em meios semissólidos como Rugai e TSI.
Escherichia coli
É uma bactéria Gram-negativa que faz parte da microbiota intestinal e
costuma causar infecções intestinais acompanhadas de diarreia, às
vezes intensa ou com sangue, e dor abdominal. Necessita de um
enriquecimento seletivo após o caldo caseína de soja em caldo
MacConkey (42-44°C, por 24 a 48 horas) para selecionar apenas
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microrganismos Gram-negativos com posterior transferência para ágar
MacConkey, sendo incubado por 18 a 72 horas a 30-35°C.
Além de ser um meio de cultura destinado ao crescimento de bactérias
Gram-negativas, ele também irá separar os microrganismos em
fermentadores de lactose ou não, por mudança de cor do meio. As
colônias de E. coli irão se apresentar vermelho-tijolo a púrpura, com halo
de precipitação de bile, além de degradar lactose alterando a coloração
do meio. Os testes confirmatórios de identificação bioquímica também
podem ser realizados em meio Rugai ou EPM-MILi, com resultados de
motilidade positiva, tendo em vista que a E. coli é uma bactéria
flagelada, oxidase negativa e lactose positiva.
À direita, colônias vermelhas de E. coli (lactose(+)); À esquerda, colônias de Proteus mirabilis
(lactose (-)) em sua coloração original.
Salmonella
Apesar de relevante na parte de alimentos, bactérias do gênero
Salmonella também recebem atenção especial na pesquisa de
patógenos em medicamentos. É uma bactéria da família
Enterobacteriaceae, que também causa intoxicação alimentar e, em
casos raros, pode provocar graves infecções fatais. Tal como a E. coli, o
processo de pesquisa de Salmonella spp. também se inicia com um
enriquecimento seletivo em caldo Salmonella Rappaport Vassiliadis com
incubação a 30-35°C, por 18 a 24 horas.
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O principal meio de isolamento é o ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD),
um meio diferencial e moderadamente seletivo utilizado para o
isolamento e a diferenciação de elementos patogênicos entéricos Gram-
negativos (Salmonella e Shigella).
As colônias de Salmonella spp. se apresentam em coloração
avermelhada e de núcleo negro devido à produção de ácido sulfídrico, o
que as diferencia das colônias de Shigella.
Exemplo de Salmonella spp. em ágar XLD.
Bactérias Gram-negativas bile tolerantes
As bactérias Gram-negativas bile tolerantes são conhecidas como
coliformes totais e englobam todas as espécies de Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Produzem gás e ácido lático
quando incubadas a 35°C a 37°C e podem ser isoladas em água, solo,
material orgânico e material fecal.
Os coliformes fecais, além de serem bactérias Gram-negativas bile
tolerantes, são também termotolerantes, sendo a principal representante
a E. coli. Após o enriquecimento em caldo caseína de soja, devem ser
transferidos para um novo caldo de enriquecimento, o caldo Mossel,
adequado para enterobactérias, e incubados por 24 a 48 horas, em
temperatura na faixa de 35°C.
A incubação em meio seletivo ocorre no ágar violeta vermelho neutro
bile glicose (VVNBG), na temperatura de 30-35°C, por 18 a 24 horas, na
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qual a presença dessas bactérias irá gerar colônias rosas ou
avermelhadas, podendo apresentar halo de precipitação de bile.
Comentário
Caso haja crescimento, deverá ser realizado teste quantitativo nas
proporções 1:10, 1:100 e 1:1000 da diluição do produto que feita para o
enriquecimento não seletivo em caldo caseína de soja. Após a
incubação por 24 a 28 horas, na faixa de temperatura de 30 a 35°C,
deverá ser semeado em ágar VVNBG para contagem por número mais
provável.
Bactérias Gram-positivas e fungos a
serem pesquisados
Staphylococcus aureus
É um microrganismo naturalmente presente na pele humana,
considerado um patógeno oportunista, frequentemente associado a
infecções hospitalares.
As infecções mais comuns envolvem a pele (foliculite, furúnculo,
impetigo) e as feridas em locais diversos.
Após o enriquecimento, deverá ser feita a semeadura em um meio
seletivo, o ágar sal manitol e incubação a 30-35°C, por 18 a 72 horas.
Esse ágar é comumente utilizado para o isolamento de Staphylococcus
aureus de amostras biológicas, como urina, secreções, feridas e
exsudatos, nas quais a degradação do manitol com a produção de ácido
muda a cor do meio de rosado a amarelo, devido à presença do
indicador vermelho de fenol, além de o alto conteúdo salino ser seletivo
para microrganismos halófilos como S. aureus.
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Exemplo de Staphylococcus aureus em ágar manitol sal (à direita) e Staphylococcus epidermidis
(à esquerda).
Pela coloração de Gram, é vista como bactéria Gram-positiva com
morfologia de cocos em formato de cachos de uva, e as principais
evidências bioquímicas são o Teste da catalase e o da coagulase.
A catalase é uma enzima que degrada o peróxido de
hidrogênio, agindo como mecanismo de defesa da
célula do microrganismo contra o nosso sistema
imunológico.
O teste basicamente consiste em adicionar na própria placa de petri,
após o crescimento, uma solução de peróxido de hidrogênio e verificar a
formação de bolhas de oxigênio.
O teste da coagulase é baseado na presença da coagulase livre, que
reage com um fator plasmático, formando um complexo que atua sobre
o fibrinogênio formando a fibrina. O procedimento mais comum é a
adição de 0,1mL de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia
suspeita a um tubo de ensaio com 0,5mL de plasma e, em seguida,
proceder com a incubação por 4 horas a 35°C. Após o período, o tubo de
ensaio deverá ser inclinado suavemente a 90 graus para se verificar a
formação do coágulo.
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Clostridium spp.
Talcos e pós devem também realizar a contagem e pesquisa de
microrganismos anaeróbios como o Clostridium spp., com ênfase no
Clostridium tetani.
São bactérias Gram-positivas, anaeróbias estritas e produtoras de
esporos importantes para a sua sobrevivência, permitindo que eles
consigam resistir em condições de aerobiose.
O enriquecimento deverá ser realizado em caldo de enriquecimento para
Clostridium e incubação anaeróbia na temperatura de 30-35°C por 48
horas. Em seguida, deverá ser semeada uma alíquota em ágar Columbia
com gentamicina e incubar novamente em anaerobiose por 48 a 72
horas a 30-35°C. Esse ágar possui duas peptonas com extrato de
levedura como uma fonte de vitaminas de complexo B, entre outros
componentes, sendo considerado meio diferencial, devido à
possibilidade de hemólise, e seletivo para microrganismos Gram-
positivos, devido à presença dos antimicrobianos colistina e ácido
nalidíxico, que inibem bactérias Gram-negativas.
Teste da catalase para confirmação de Clostridium spp. A – teste negativo. B – teste positivo.
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Devido à alta quantidade de nutrientes, quando submetido à ambiente
anaeróbio, crescerão apenas microrganismos fastidiosos anaeróbios,
tais como Clostridium. Caso haja crescimento de bacilos Gram-
positivos,deverá ser realizado teste da catalase para confirmar a
presença de Clostridium. A amostra é considerada adequada se o teste
der negativo.
Candida albicans
É o único representante do reino Fungi contemplado pelas principais
Farmacopeias oficiais, sendo de extrema importância verificar a sua
ausência em produtos para uso vaginal.
O meio de enriquecimento precisa ser seletivo, e utilizamos o caldo
sabouraud dextrose, que possui os nutrientes necessários para o
crescimento de fungos e grande quantidade de açúcar, que inibe o
crescimento de bactérias.
A incubação deverá ser feita por 3-5 dias, a 30-35 °C. O isolamento
deverá ser feito em ágar sabouraud dextrose ou ágar Nickerson, que,
devido ao seu conteúdo nutricional e à temperatura de incubação (24-48
horas a 30-35°C) promovem o crescimento de leveduras. O crescimento
de colônias brancas (ágar sabouraud dextrose) ou colônias
marrons/pretas (ágar Nickerson) evidencia a suspeita de Candida
albicans.
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Crescimento de Candida albicans em ágar sabouraud dextrose.
Técnicas de contagem de
microrganismos
Confira, agora, os fundamentos e passos das técnicas de contagem de
microrganismo.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Os produtos farmacêuticos e cosméticos precisam cumprir as
especificações da Farmacopeia para microrganismos totais. Já
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para microrganismos patogênicos, estes precisam estar ausentes e
para cada um deles é necessária a realização de testes presuntivos
e testes confirmatórios. O Staphylococcus aureus é um dos
principais microrganismos patogênicos que podem contaminar
produtos farmacêuticos e pode ser proveniente da microbiota dos
operadores. A alternativa que apresenta, respectivamente, o meio
de cultura necessário para confirmação desse patógeno e o teste
confirmatório indicado pela Farmacopeia Brasileira é
Parabéns! A alternativa D está correta.
Ágar manitol sal é comumente utilizado para o isolamento de
Staphylococcus aureus de amostras biológicas como urina,
secreções, feridas e exsudatos, nas quais a degradação do manitol
com a produção de ácido muda a cor do meio de rosado a amarelo,
devido à presença do indicador vermelho de fenol, além de o alto
conteúdo salino ser seletivo para microrganismos halófilos como S.
aureus. A catalase é uma enzima que está presente no
Staphylococcus aureus e processa o peróxido de hidrogênio, agindo
como mecanismo de defesa da célula do microrganismo contra o
nosso sistema imunológico.
Questão 2
Dentre os inúmeros testes a que são submetidos os produtos, os de
patógenos são necessários somente quando houver crescimento
de microrganismos durante os ensaios de ausência/presença de
A ágar MacConkey e meio rugai.
B ágar cetrimida e teste da coagulase.
C ágar cetrimida e teste da catalase.
D ágar manitol sal e teste da coagulase.
E ágar MacConkey e teste da coagulase.
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patógenos. Dentre os microrganismos abaixo, qual é um coliforme
fecal?
Parabéns! A alternativa E está correta.
As bactérias Gram-negativas bile tolerantes, conhecidas como
coliformes totais, englobam todas as espécies de Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella, entretanto, das citadas,
apenas a Escherichia coli é considerada um coliforme fecal.
3 - E�cácia do sistema conservante
A Salmonella spp.
B Clostridium sulfito redutores
C Candida albicans
D Pseudomonas aeruginosa
E Escherichia coli
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Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as diferentes técnicas para avaliação da
e�cácia do sistema conservante e da potência de antimicrobianos.
Características de um bom sistema
conservante
Um conservante pode ser definido como uma substância cuja função é
inibir o crescimento de microrganismos nos produtos, mantendo-os livre
de deteriorações causadas por bactérias e fungos. São importantes,
principalmente, em formulações com alto teor de água livre (como
formas farmacêuticas líquidas, semissólidas, injetáveis e produtos
oftálmicos), tendo em vista que a água é um importante fator para o
crescimento microbiano.
Quando escolhidos adequadamente, evitam a proliferação de
microrganismos nos produtos durante o prazo de validade, ou ainda
após abertos pelos usuários. A utilização de um adequado sistema
conservante é necessária para garantir estabilidade e segurança das
preparações farmacêuticas quanto à pureza microbiana, visando tanto à
proteção do produto quanto à proteção do consumidor.
Os conservantes são necessários tanto em produtos não estéreis, como
líquidos e semissólidos, quanto em produtos estéreis e preparações
parenterais. Os principais conservantes utilizados em formas
farmacêuticas e cosméticas são:
 Parenterais dose única e dose múltipla
Conservantes
Clorocresol (0,1%), álcool benzílico (1%), fenol
(0,5%), clorobutanol (0,5%).
 Gotas oftálmicas e soluções para lente de
contato
Conservantes
Cl idi (0 1%) l t d b l ô i (0 3%)
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Para realizar uma escolha de um conservante, devemos possuir um
embasamento teórico que leve em consideração as características do
produto, dos possíveis microrganismos que podem contaminá-lo e do
conservante. Podemos até utilizá-los individualmente, mas o mais usual
é em conjunto com dois ou mais, para ampliar o espectro de ação.
O conservante ideal não deve interagir com princípio
ativo, nem com o material de embalagem, não deve
alterar gosto, cor e sabor do produto, deve possuir
ação rápida e biocida contra bactérias e fungos, devem
ser atóxicos, estáveis e solúveis.
É necessário também entender as características físico-químicas da
formulação para evitar que a atividade do sistema conservante seja
comprometida. A falta de compatibilidade do pH da formulação com o
conservante pode levar a dissociações que diminuem a eficácia do
conservante, como a migração parcial do conservante entre as fases
aquosa e oleosa.
Clorexidina (0,1%), cloreto de benzalcônio (0,3%),
clorobutanol (0,5%).
 Líquidos orais
Conservantes
Parabenos (Metil, etil, propil, butil...) (0,05 a 0,3%),
ácido benzoico (0,3-0,5%).
 Cremes
Conservantes
Parabenos, brometo de cetilamônio, clorocresol,
entre outros.
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Outros fatores, como interação com sólidos, macromoléculas,
ciclodextrinas ou lipossomas, polissorbatos, material de embalagem,
além de termossensibilidade e fotossensibilidade podem diminuir a
atividade do sistema conservante causando crescimento de
microrganismos e comprometendo a formulação e expondo o usuário a
riscos.
E�cácia do sistema conservante:
teste de desa�o
Atualmente, a metodologia reconhecida para a avaliação da eficácia do
sistema conservante é a do teste de desafio. Esse teste é recomendado
no desenvolvimento do produto e consiste no desafio do produto já
pronto, contendo conservante, com um microrganismo-padrão.
Esses testes são realizados apenas durante P&D dos produtos e fazem
parte do dossiê para registro exigido pela Anvisa e, depois de
estabelecida a eficácia, não é necessário realizar o procedimento a cadalote produzido. Mesmo a empresa tendo escolhido o sistema
conservante que mostrou ser eficaz no teste de desafio (teste de
eficácia do sistema conservante), isso não isenta a empresa de fazer os
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estudos de estabilidade acelerada e longa duração em câmaras
climáticas antes de entrar com pedido de registro na Anvisa.
A Farmacopeia Brasileira 6ª Edição recomenda os seguintes
microrganismos-padrão:
Candida albicans (ATCC 10231);
Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404);
Escherichia coli (ATCC 8739);
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027);
Staphylococcus aureus (ATCC 6538).
A partir da cultura ATCC original, os microrganismos utilizados nos
testes devem possuir no máximo cinco passagens, isto é, cinco
transferências de uma cultura estabelecida para um meio de cultura
estéril. Para culturas mantidas por técnicas de congelamento, cada ciclo
de congelamento-descongelamento e reativação é considerado uma
passagem.
Os produtos são utilizados em sua embalagem original, desde que ela
nunca tenha sido utilizada, e são divididos em quatro categorias para
aplicação dos critérios de aceitação. Veja:
 Categoria 1
Injetáveis, oftálmicos, otológicos e nasais estéreis
com veículo aquoso.
 Categoria 2
Produtos de uso tópico (inclusive mucosas), com
veículo aquoso, nasais não estéreis.
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A metodologia consiste em realizar repique da cepa-padrão (ATCC) em
ágar nutriente (TSA) para obtenção e padronização da suspensão-
padrão de microrganismos de concentração de 1 x 108 UFC/mL. A
suspensão de bactérias e leveduras deverá ser utilizada em 24 horas. A
suspensão de bolores pode ser utilizada em até sete dias, se mantida
sob refrigeração. Posteriormente, deverá se proceder com a inoculação
com volume de suspensão-padrão entre 0,5 e 1% do volume da amostra
de acordo com o tipo de produto:
Produtos do tipo 1, 2 e 3
Deve-se obter uma concentração final no produto entre 1 x 105 e 1 x 106
UFC/g ou mL.
Produtos do tipo 4
Deve-se obter uma concentração final no produto entre 1 x 103 e 1 x 104
UFC/g ou mL.
Após a inoculação no produto, as amostras devem ser incubadas entre
30°C a 35°C, e alíquotas deverão ser retiradas nos dias 0, 7, 14 e 28 e
semeadas e incubadas de acordo com a tabela:
Microrganismo Meio Tem
Escherichia coli ATCC 8739 TSA (32
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027        TSA (32
 Categoria 3
Produtos de uso oral, com veículo aquoso (exceto
antiácidos).
 Categoria 4
Antiácidos com veículo aquoso.
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Microrganismo Meio Tem
Staphylococcus aureus ATCC 6538 TSA (32
Candida albicans ATCC 10231 Sabouraud (22
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 Sabouraud (22
Tabela: Condições para incubação das cepas para o teste de eficácia do sistema conservante.
Adaptado de: BRASIL, 2019.
Ao retirar amostras do inoculado e realizar as diluições necessárias para
ver o crescimento microbiano, deve-se adicionar um inativante do
antimicrobiano em teste para evitar que este continue agindo durante a
incubação na placa.
Após o tempo de incubação, a concentração de cada microrganismo
deverá ser calculada e comparada com a contagem no tempo inicial,
sendo expressa a mudança em termos de reduções logarítmicas.
Confira um exemplo de contagem de microrganismos após incubação
em placa no teste do desafio:
Dia 0
UFC/mL - 106
Log UFC/mL - 6
Dia 7
UFC/mL - 105
Log UFC/mL - 5
Dia 14
UFC/mL - 104
Log UFC/mL - 4
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Os critérios de aceitabilidade estão dispostos da seguinte forma:
Microrganismo Categoria do produto
1 2
Bactérias
Redução log em relação
à contagem inicial: ≥ 1
no dia 7; ≥ 3 no dia 14;
sem crescimento do 14
para o 28.
Redução log em
à contagem inic
no dia 14; sem
crescimento do 
o 28.
Bolores e
Leveduras
sem crescimento entre
a contagem inicial e os
dias 7, 14 e 28.
sem cresciment
a contagem inic
dias 14 e 28.
Tabela: Critérios de aceitabilidade das diferentes categorias de produtos cosméticos e
farmacêuticos no teste de eficácia do sistema conservante.
Adaptado de BRASIL, 2019.
E�cácia do sistema conservante:
método de regressão linear
No final da década de 1970, Orth utilizou de forma pioneira a avaliação
de sistemas conservantes pelo método de regressão linear de forma
muito parecida ao preconizado pela Farmacopeia. O método de
regressão linear é baseado no fato de que determinada população de
microrganismo, quando exposta ao agente antimicrobiano, perde sua
viabilidade de modo regular, e a fração de sobreviventes decresce
exponencialmente com o tempo.
Dia 28
UFC/mL - 102
Log UFC/mL - 2
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Para tal metodologia, é necessária a utilização do valor D, que expressa
o tempo necessário para a redução de 90% da população do
microrganismo-teste, quando submetido ao agente letal sob condições
constantes, ou seja, o tempo de redução decimal. Esses valores podem
ser calculados por meio de uma curva expressa pela função obtida entre
o logaritmo do número de sobreviventes e o tempo após inoculação.
Comentário
Nessa metodologia, as amostras também devem ser inoculadas
separadamente, porém, a concentração de microrganismos no produto
deverá ser de aproximada de 107 microrganismos/g ou mL. A contagem
de sobreviventes é efetuada após 2, 4, 24 e 48 horas para bactérias, 4, 8,
24 e 48 horas para leveduras, e 4, 8, 24 e 48 horas e 7 dias para bolores.
O número de sobreviventes é estimado por método de contagem
validado (plaqueamento) em um meio de recuperação adequado e, a
partir dos dados de unidades formadoras de colônias (UFC) em função
do tempo, é gerada uma curva de sobreviventes.
O valor D pode ser estimado graficamente, por meio de análise de
regressão linear dos quadrados mínimos, sendo o valor D recíproca do
coeficiente angular da equação da reta obtida, ou matematicamente,
pela equação:
Em que:
 é o número de sobreviventes após o tempo t;
 é o número de organismos no tempo zero, ou seja, a biocarga;
t é o tempo de exposição.
Observe o gráfico:
D =
t
log ( N0
Nt
)
Nt
N0
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Gráfico: Exemplificando o Valor D.
Determinação da potência de
antibióticos
A potência (ou atividade) dos antibióticos é um teste de extrema
importância para avaliar se a concentração nas preparações
farmacêuticas está adequada com a infecção que se deseja combater, e
é um aspecto a ser estudado durante o desenvolvimento dos
medicamentos. Essa característica é demonstrada, sob condições
adequadas, no efeito inibitório sobre o crescimento de determinados
microrganismos. Métodos químicos nem sempre são capazes de revelar
alterações sutis na atividade antimicrobiana, sendo os mais comuns
ensaios microbiológicos, e os mais empregados os testes de difusão
em ágar (ou em placas) e o teste turbidimétrico (ou de tubos).
Exemplo
Deve-se utilizar nesse ensaio os microrganismos recomendados pela
Farmacopeia Brasileira 6ª Edição, como Staphylococcus aureus (ATCC
6538p), Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) e Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 25619).
Os materiais que serão utilizados deverão ser limpos após cada
utilização, para remover qualquer vestígio de antibiótico e
permanecerem cobertos quando não estiverem em uso. As vidrarias que
entrarem em contato com o microrganismo devemser esterilizadas em
estufa, em temperatura entre 200°C e 220°C por duas horas.
Deverão ser utilizados balões volumétricos, pipetas ou equipamentos
cuidadosamente calibrados no preparo da diluição da solução-padrão,
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para evitar erros de medida relacionados aos instrumentos.
Teste de difusão em ágar
O princípio do teste de difusão em ágar relaciona o tamanho do halo de
inibição com a dose da substância testada, sendo o método mais
comum para a determinação da potência de antibióticos. Uma placa
(dimensões de 20 x 100mm) contendo meio nutriente (ágar) deverá ser
inoculada com microrganismo-padrão e, em seguida, ocorrerá a adição
do antibiótico a determinada região da placa. O antibiótico selecionado
deverá ser adicionado em reservatórios que podem ser constituídos por
cilindros de vidro ou aço inoxidável, templates de aço, ou discos de
papel-filtro depositados sobre a camada de ágar nutriente para que haja
a difusão.
Adição de discos de antibióticos para o teste de potência de antibiótico por difusão em ágar.
Atualmente, os discos de papel filtro reduzem o trabalho e o tempo
envolvido no teste, além de facilitarem a manipulação das placas, sendo
o método mais utilizado. Após a adição do antibiótico, a substância
deverá se difundir no meio de uma região para outra até atingir um
equilíbrio, passando do meio mais concentrado (disco ou reservatório)
para o menos concentrado (ágar com inóculo). As quantidades de
inóculo e o tempo de incubação devem respeitar as diretrizes da
Farmacopeia Brasileira 6ª Edição, ou outro compêndio oficial.
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Após o tempo determinado, deverá se visualizar o halo de inibição
formado. Para que seja considerado sensível, é recomendado um
diâmetro de inibição de no mínimo 14mm, e o diâmetro máximo não
deve se sobrepor com outro halo formado.
Placa de teste de potência de antibiótico após incubação com diferentes tipos de sensibilidade aos
discos contendo antibióticos.
Método turbidimétrico
No método turbidimétrico, o microrganismo deverá crescer bem em
meio líquido, ser aeróbio e sensível ao antibiótico. O princípio dessa
técnica correlaciona a turbidez medida por espectrofotômetro com a
inibição proporcional à concentração de antibiótico. Confira as
vantagens e desvantagens:
Vantagens
Rapidez do teste,
facilidade operacional,
medida objetiva da
resposta, ausência de
efeitos de difusão e
exatidão.
Desvantagens
Necessidade de um
equipamento mais
específico para a leitura,
maior custo e não
aplicabilidade a
amostras coloridas que
interfiram na leitura
fotométrica.
Toda técnica espectrofotométrica segue a Lei de Lambert-Beer, na qual
a quantidade de luz absorvida, em dado comprimento de onda, será
diretamente proporcional à concentração da solução no meio.

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Para o caso de suspensões microbianas, a quantidade de bactérias
presentes na solução irá interferir diretamente na absorção da luz
incidida. A curva-padrão corresponde à relação gráfica entre os valores
de absorbância (A) e os de concentração. Com base na análise gráfica, é
possível verificar a linearidade da relação e calcular um fator de
conversão de valores de absorbância em concentração.
Nessa metodologia, deverão ser seguidos os requisitos da Farmacopeia
Brasileira para o microrganismo em estudo, meio de cultura, volume de
inóculo padronizado sugerido como referência inicial e temperatura de
incubação.
Espectrofotômetro de UV-visível.
Os tubos deverão ser incubados em banho-maria, por três a quatro
horas, tomando a precaução de assegurar temperatura adequada e
uniforme para todos os tubos. Após o período de incubação, o
crescimento deverá ser parado com a adição de 0,5mL de formaldeído a
12%.
A absorbância para cada tubo será determinada em espectrofotômetro,
no comprimento de onda de 530nm. Para padronização para o meio do
branco, deverão ser utilizadas a mesma quantidade de caldo nutriente e
formaldeído, a 12%.
Quando pensamos na escolha do método para a medição da atividade
antimicrobiana, devemos levar em consideração fatores como o tipo de
amostra a analisar, tempo para ser dispendido, assim como recursos
financeiros, mão de obra, sensibilidade inerente a cada método, precisão
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requerida, entre outros fatores. Independentemente do método
escolhido, este deve ser sempre validado e seguir as diretrizes
farmacopeicas.
Determinação da potência de
antibióticos
Entenda, agora, como é feita a determinação da potência de antibióticos
pelo teste de difusão em ágar, bem como pelo método turbidimétrico e
de que maneira deve fazer o delineamento experimental.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
Sobre as produções de formas farmacêuticas e cosméticas, é
preciso entender as características físico-químicas das
formulações, visto que fazem parte da qualidade e evitam
comprometimento do sistema conservante. A falta de
compatibilidade do pH da formulação com o conservante, entre
outros pontos, diminuem a eficácia e causam o crescimento de
bactérias. Podemos destacar outros pontos que reduzem essa
eficácia em qual alternativa?
A Material de embalagem
B Ação bactericida
C Emulsões recorrentes
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Parabéns! A alternativa A está correta.
A interação com o material de embalagem pode sequestrar ou
mesmo degradar o sistema conservante, diminuindo sua eficácia e
comprometendo a estabilidade da formulação.
Questão 2
Antibióticos são sem dúvida uma revolução medicamentosa, vide o
impacto da penicilina na humanidade. Contudo, para ser eficaz, o
antibiótico precisa ser potente frente à bactéria. Em qual alternativa
a seguir pode ser vista uma das formas de determinar a potência
antibiótica?
Parabéns! A alternativa A está correta.
Entre os testes microbiológicos, podemos destacar a difusão em
ágar, seja com discos de papel filtro ou com reservatórios de vidro
ou aço inoxidável, enquanto entre testes físico-químicos podemos
destacar o turbidimétrico, ou em tubos, que utiliza a
D Exposição ao CO2
E Imersão em meio básico
A Difusão em ágar e turbidimétrico.
B Espelhamento reverso e difusão em ágar.
C Aspecto em ágar e turbidimétrico.
D Cultura em meios diferenciais e difusão em ágar.
E Turbidimétrico e hemocultura.
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espectrofotometria para avaliar o crescimento microbiano em tubos
contendo meio líquido.
Considerações �nais
Aprendemos a importância do controle microbiológico para produtos
farmacêuticos e cosméticos e como os produtos podem ser divididos,
de acordo com a carga microbiana. Vimos quais são as principais
fontes de contaminação, as características que tornam o produto mais
suscetível à contaminação microbiana e as formas de minimizá-las.
Abordamos quais são os limites especificados pela farmacopeia, os
principais testes para contagem de microrganismos mesofílicos, além
dos testes de identificação de patógenos que precisam estar ausentes
em formulações farmacêuticas e cosméticas.
Apresentamos os testes para avaliar a eficácia do sistema conservante