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S aureus WTA - Microbio

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Introdução
O que são Staphylococcus aureus?
Os seres humanos são reservatórios naturais de S. aureus;
O S. aureus é um patógeno capaz de modificar-se à terapia antimicrobiana, caracterizando grande resistências antibióticas desse microrganismo. Ex.: penicilina.
 Staphylococcus aureus
As MRSA pode ser classificado em HA-MRSA e CA-MRSA;
Infecções em pele e partes moles constituem a maioria dos casos das infecções relacionadas ao CA-MRSA.
Abscesso causado por S. aureus.
Operon Agr e quorum sensing
Ácido Teicóico
Objetivo
Mostrar que ácido teicóico está diretamente envolvido na virulência específica em S. aureus e fornecer uma visão de mecanismos moleculares subjacentes que poderiam orientar o desenvolvimento de novas estratégias anti-infecciosas.
Resultados
Quantidade de WTA nas paredes: cepas altamente patogênicas X cepas pouco patogênicas
Foi quantificado o teor de WTA nas paredes celulares de cepas com diferentes níveis de patogenicidade;
Cepas altamente patogênicas têm mais WTA do que as pouco patogênicas;
WTAhigh (MW2, USA300, 103) e WTAlow (SA113, 331865).
Fenótipo WTAhigh e gene TarH
Foi analisada a expressão de genes envolvidos na biossíntese de WTA dos dois fenótipos;
Genes tarO, tarA, tarK, tarL, tarG e tarH;
Apenas o tarH foi diferencialmente expresso em WTAhigh e WTAlow e somente em fase estacionária;
TarH codifica uma parte de um transportador que facilita a translocação de WTA pela membrana.
Fenótipo WTAhigh e regulon Agr
O sistema Agr aumenta a expressão de fatores de virulência na transição da fase log para a estacionária;
Foi medido, por meio do transcrito primário RNAIII, se a expressão de Agr difere entre os dois fenótipos;
WTAhigh produz muito RNAIII; WTAlow produz pouco RNAIII (SA113 – mutante de deleção.
 l
Fenótipo WTAhigh e regulon Agr
Foi testado se Agr está relacionado com a regulação diferencial de TarH;
Comparação entre o mutante de deleção e o tipo selvagem (wt) de todas as cepas;
WTAhigh: a expressão de TarH em mutantes foi significativamente menor do que em wt;
WTAlow: não houve diferença entre o mutante de deleção e wt.
Fenótipo WTAhigh e regulon Agr
Foi avaliado o papel de Agr na biossíntese de WTA;
Quantificação de WTA nos mutantes e wt de ambos os fenótipos;
WTAhigh: mutantes apresentam menos WTA do que wt;
WTAlow: não houve diferença na quantidade de WTA em mutantes e wt;
WTAhigh mutante = WTAlow;
Aparente correlação entre deleção de Agr e baixa expressão de TarH em WTAlow.
Controle transcricional de TarH pelo repressor de toxinas (Rot)
Rot é um regulador transcricional de uma série de genes;
O mRNA de Rot é negativamente afetado pelo RNAIII;
Foi medida a expressão de TarH em WTAhigh e WTAlow wt, mutantes para Rot e mutantes para Agr e Rot.
Controle transcricional de TarH pelo repressor de toxinas (Rot)
WTAlow mutante para Rot apresentou a mesma expressão de TarH que um WTAhigh wt;
WTAhigh mutante para Rot apresentou ainda mais WTA;
A mutação de Rot atenuou a mutação de Agr em mutantes duplos;
Ensaios em gel de agarose demonstraram a ligação de Rot no promotor TarH;
Há uma cascata regulatória que envolve Agr, Rot e TarH;
Overexpression de tarH em cepas WTAlow pode restaurar o fenótipo WTAhigh
 O gene tarH foi colocado sob o controle de um promotor codificado no plasmídeo pRB474.
WTA induz IFN-y e IL-17
 O abcesso foi induzido pela injeção da mistura de WTA com cytodex beads no flanco de camundongos;
 O anticorpo bloqueador HLA-DR inibiu as produções de IFN-y em cultivo de células T humanas;
 Esse experimento demonstrou que o WTA ativa as células T humanas para produzir IFN-gama via mecanismo dependente de MHC-II.
Frações da parede celular de cepas WTAhigh induzem resposta imune mais eficiente que frações da parede de WTAlow
 Cultivaram células T humanas com frações da parede celular de cepas de fenótipos WTAhigh e WTAlow;
 Injetaram frações das paredes celulares em camundongos e quantificaram a formação de abcesso através do acúmulo de neutrófilo.
Overexpression de tarH em cepas WTAlow melhora a habilidade de induzir formação de abcesso comparada a uma cepa WTAhigh
 Compararam a habilidade da cepa SA113 de causar abcesso, com e sem o plasmídeo de super expressão de tarH;
 Para testar se WTA tem um impacto na formação de abcesso na cepa super patogênica de USA300. Utilizaram um mutante que não possui todas as moléculas de WTA.
Discussão 
Regulação genica TarH 
O aumento da expressão tarH leva ao fenótipo alto de WTA em CA-MRSA;
Os resultados apontam que há uma correlação entre deleção ou baixa expressão do gene Agr e o fenótipo WTAlow; 
O artigo demonstra a importância da proteína Rot como parte da regulação dos Genes Tar;
O RNAIII diminui os níveis de mRNA Rot 
Rot é um inibidor dos genes Tar 
Concluímos que WTA modula as fases muito iniciais da formação de abscesso da pele pelo mecanismo das células T CD4+ IFN-γ-dependente;
Enquanto os mecanismos dependentes de IL-17 desempenham um papel protetor do hospedeiro, contribuindo ao esvaziamento do abcesso e cicatrização de feridas. 
Valores elevados de WTA podem permitir que S. aureus amplifique mecanismos iniciais de formação de abscessos, criando um microambiente que protege das respostas das hospedeiras de bactérias.
Impacto da WTA sobre a virulência específica da cepa.
CONCLUSÃO
Podemos concluir que a superexpressão de tarH, que influencia os níveis de WTA, é um mecanismo que certas S. aureus exploram para ganhar a virulência.
Esse estudo contribui para o reconhecimento de novos alvos para antibióticos. Levado à conclusão de que as vias de WTA é um destino ideal para estratégias anti-infecciosas e antibióticos. 
Método
Cepas bacterianas e condições de crescimento
As cepas foram cultivadas em B-Medium (para isolamento de parede celular ou WTA e infecção experimentos) ou no meio TSB (caldo de soja tríptico) (Difco Laboratories) e incubado a 37 ° C com agitação;
Os S. aureus resistentes foram cultivados em meios suplementado com antibióticos apropriados (tetraciclina (5 μg ml-1 ) ou cloranfenicol (10 μg ml-1 ).
Construção de mutantes de eliminação de agr
Para eliminação de agr (Suplementar Tabela 1), o bacteriófago Φ11 contendo agr :: tet (M) foi propagado em tensão RN4220. Usando métodos padrão, Φ11 foi usado para transduzir agr :: tet (M) de RN6911 (referência 32) para diferentes cepas alvo;
A eliminação de agr foi confirmado por PCR e análise de transcrição (primer rnaIIIfor e rnaIIIrev).
O quadro de leitura aberto de tarH foi amplificado e clonado em expressão vetor pRB474 usando um protocolo modificado de clonagem de Gibson. amplificado por PCR (primersgib_pRB474_tarH_for e gib_pRB474_tarH_rev) de o DNA genômico das estirpes correspondentes;
Vetor e os produtos de PCR de inserção foram digeridos durante 1 h a 37 ° C com 10 U de DpnI. Cada um de as amostras de ADN digeridas com DpnI (1 μl) foram adicionadas a 15 μl da mistura principal Gibson e incubou-se durante 45 min a 50 ° C. 
Construção de um vetor de expressão recombinante (pRB474) para tarH com Gibson clonagem. 
Parede celular e isolamento WTA e análise de polímero 
Parede celular e WTA foram isolado como descrito anteriormente;
 Os instrumentos e dispositivos utilizados no processo de isolamento foram despirrogenado por inactivação por calor durante 4 h a 240 ° C;
As Celulas lisadas foram incubados durante a noite com DNase I (40 unidades ml-1, Roche) e RNase A (80 unidades ml-1, Sigma) a 37 ° C e 200 rpm. seguido de uma proteína digestível (80 unidades por parede celular g, Applichem);
As quantidades de WTA foram quantificadas pela determinação do fosfato inorgânico (Pi) conteúdo, conforme descrito anteriormente.
Ensaios de mudança de gel com o promotor tarH 
Foram preparados extratos de proteínas de células inteiras de culturas noturnas em TSB; 
As células foram lavadas em tampão tris-EDTA e lisadas num tampão contendo Tris 10 mM, EDTA 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, pH 7,4;
As amostras foram executadas diretamenteem um gel de agarose a 3% e foram impressas em uma Odyssey LI-CORsistema com configurações para emissão de 700 nm (promotor hla) e 800 nm (promotor de podridão).
Modelo de mouse de formação de abscesso subcutâneo
Foram misturados com volumes iguais de pérolas de dextrano estéril (Cytodex 1,Sigma), e a mistura (0,2 ml) foi injetada em cada flanco do rato;
Após 48 h, os camundongos sofreram eutanásia, e os abscessos foram excisados ​​e homogeneizado em 1 ml de PBS (Gibco by Life Technologies) para c.f.u. determinação ou em 500 μl de tampão de extração para medição de MPO ou determinação de citocinas;
 A atividade MPO foi determinada com um ensaio colorimétrico e foi utilizado como medida quantitativa de neutrófilos infiltração.
Ativação de células T e teste de produção de citocinas IFN-γ.
As células mononucleares foram purificado por centrifugação em gradiente de densidade em Polymorphoprep (Axis-Shield) de sangue extraído de diferentes doadores humanos saudáveis;
Enterotoxina A de S. aureus (SEA) (2 ng ml-1) foi usado como um controle positivo, e as células T co-cultivadas com APCs sozinhas foram usadas como controles negativos;
O índice foi calculado pela normalização para poços com APCs e células T, mas não antígeno estimulante. Após a estimulação, os sobrenadantes foram coletados por centrifugação (300 g, 10 min, 4 ° C) e armazenados a -80 ° C até se verificar IFN-y por ELISA (I & D Biosystems);
Os anticorpos de bloqueio foram usados em algumas experiências para avaliar o impacto de HLA em IFN-γ dependente de WTA.
Isolamento de ARN in vitro e qRT-PCR.
Para o isolamento de RNA, as bactérias foram cultivadas durante a noite em TSB médio para a fase de crescimento estacionário;
e 1 ml foi recolhido por centrifugação durante 3 min a 10.000 r.p.m. e 4 ° C;
As quantificações relativas foram realizadas com um LightCycler480II instrumento (Roche);
Os níveis de transcrição dos genes alvo (tarO / A / K / L / G / H / M / S, operatório dlt, podridão, RNAIII) foram normalizados contra a expressão de gyrB como controle interno e em alguns ensaios normalizados para expressão na estirpe SA113 de WTAlow.
Declaração de ética
Os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com os regulamentos alemães da Sociedade de Ciência Animal de Laboratório (GV-SOLAS) e Lei de Saúde da União Europeia da Federação de Ciência Animal de Laboratório Associações (FELASA);
O protocolo foi aprovado pelo Regierungspräsidium Tübingen (número de permissão H2 / 10);
 O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis que deu consentimento informado por escrito para a punção venosa de acordo com os protocolos aprovado pela Universidade de Tübingen, na Alemanha.

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