01-Introdução

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CULTURA DE CÉLULAS
Prof. Michel Gantus
O que é?
➢ Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora
do organismo onde existem, mantendo as características próprias;
➢ A cultura de tecidos implica a prévia desagregação (mecânica ou
enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa
camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de
cultura.
Tecidos 
Humanos
Animais
Vegetais
IN VITRO X IN VIVO
Qual a finalidade?
História
➢ Primeiras culturas de fragmentos de tecidos colocados em coágulos de
plasma.
➢ Grande avanço (1940): crescimento de linhagens celulares a partir de células
isoladas que aderiam à superfície de placas de cultura
Mas… As células eram cultivadas em meios indefinidos: combinação de soro e
extractos embrionários.
➢ Em 1952: Crescimento de células num meio contendo:
- Plasma de galinha
- Extracto de embrião bovino
- Soro de cordão umbilical
Mas… O meio era complexo e indefinido tornando impossível analisar as
necessidades específicas para o crescimento de células animais.
História
VARIANDO ESTES COMPOSTOS…
➢ Eagle determinou os necessários para o crescimento celular:
- Sais
- Glicose
- 13 aa
- Vitaminas
- Juntamente com soro de proteínas
➢ Atualmente ainda é usado o meio desenvolvido por Eagle como meio
básico para cultura de células animais.
➢ O seu uso permitiu aos cientistas cultivar uma ampla variedade de
células sob condições experimentais definidas.
Tipos de Cultivos Celulares
50% 70% 100%
Divisões celulares
Divisões celulares
Classificação
Confluência de Culturas
Fibroblastos VelhosFibroblastos Jovens
Viabilidade de Culturas
Cultura em Adesão de Cerebelo
Cultura em Suspensão 
Co-cultura
Culturas 
em 3D
• Migração celular 
• Adesão celular 
• Proliferação celular
•Estudos imunológicos 
- Resposta celular in vitro
- Estudos de sensibilidade a drogas
- Citotoxicidade
Aplicações
De forma a preservar mais informações sobre cada tipo individual de
células, os biólogos desenvolveram meios de dissociar as células dos
tecidos e separar os vários tipos;
Fig. 5 - Centrifugadora
Isolamento Celular
1. Romper a matriz
extracelular e as junções
intercelulares;
2. As células de tecidos fetal
ou neonatal são as
melhores produções de
células dissociáveis
viáveis por:
• Dissociação Mecânica
• Dissociação Enzimática -
(tripsina e colagenase)
Isolamento Celular
• Gradiente de centrifugação
• Explantes
• Adesão diferencial
• Citometria de Fluxo
• Separação Magnética
• Microdissecção
Modelos de Isolamento Celular
➢ Células grandes são separadas das
células pequenas e células densas de
células não densas por centrifugação
fraccionada;
Gradiente 
de 
Centrifugação
Eritrócitos + PMNs - mais densos
Células mononucleares (linfócitos/ monócitos)-menos densos: recuperados à superfície
Gradiente de Centrifugação
density
Ficoll-
hypaque
PBMC
Soro
plaquetas
Aderência celular a uma superfície sólida
Panning
Adesão Diferencial
➢ Marcação específica das células com
anticorpos acoplados a um corante
fluorescente, em seguida, a separação
destas células marcadas das não
marcadas num separador de células
activado por fluorescência;
Citometria de Fluxo
MACS® Magnetic Cell Sortin
Magnetic labeling 
with MACS 
MicroBeads
Flow through with 
unlabeled cells
Elution of 
positively 
selected 
cells
Isolation of untouched B cells
from PBMC using B Cell Isolation Kit 
Before separation
CD45-FITC
C
D
1
9
-P
E
Untouched B cells
CD45-FITC
C
D
1
9
-P
E
11.4% 95.86%
Microdissecção
Desvantagens
• Necessidade de operadores
experientes (com conhecimentos da
técnica asséptica, etc);
• Custo do esforço e material (baixa
quantidade de células produzidas para
o material e esforço gasto);
• Perda de características fenotípicas;
• Instabilidade das células (sobretudo
em linhas celulares imortais).
Vantagens
•Controle das condições ambientais (pH, 
temperatura, concentração de O2 e CO2, 
etc);
•Obtenção de células com boa
homogeneidade e bem caracterizadas;
•Economia de animais, reagentes, tempo,
etc.
Incubadora
Incubadora de CO2
Ar condicionado Capela de Fluxo 
(Biossegurança 2)
Geladeira
Cilíndros de CO2
Entrada 
Principal
Pias de imersão Pia de lavagem
Estufa de 
secagem
Saída de ar
Autoclave
Estufa de 
esterilização
Prateleiras de 
Armazenamento
Carrinho de 
serviço
Freezer
Bancada
N2 Líquido para 
armazenamento
Laboratório de Cultura Celular
Câmara de fluxo laminar horizontal
Laboratório de Cultura Celular
Câmara de fluxo laminar vertical
Laboratório de Cultura Celular
Incubadora de CO2
Centrífuga Microscópio Invertido
Laboratório de Cultura Celular
➢ Ao contrário das bactérias, a maior parte das células de tecidos não
estão adaptadas para viverem em suspensão e necessitam de uma
superfície sólida para crescerem e dividirem-se, que é agora usualmente
a superfície plástica de uma placa de cultura de tecidos;
Placas de Cultura
• Escolha do meio de cultura depende do tipo celular
• Meio de cultivo é suplementado com antibióticos para 
impedir a contaminação. 
• Após seu preparo sempre é filtrado com membranas de 
0,22μm impedindo a passagem de agentes contaminantes
Meios de Cultura
Culturas Bacterianas
Exemplos de contaminação por bactérias
Exemplos de contaminação por fungo