dosagem de bilirrubina

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DOSAGEM DE BILIRRUBINA
ASPECTOS SOBRE A DETERMINAIÃO DE BILIRRUBINA
A bilirrubina é uma substância produzida pelo fígado, consequente da filtragem de glóbulos vermelhos, e é eliminada do organismo por meio das fezes e urina. Sua formação ocorre como produto da degradação do grupo heme, em que aproximadamente 70% se derivam de células vermelhas envelhecidas. A bilirrubina circulante é extraída pelo fígado, onde é conjugada por esterificação.
Figura 1 – Estrutura química da bilirrubina, cuja fórmula é C33H36N4O6. Fonte: Adaptada de PubChem
(2016).
O método de determinação de bilirrubina mais amplamente usado é a reação diazo, que distingue duas frações: direta e indireta. Aspectos sobre essas determinações serão abordados no próximo tópico.
 (
LABORATÓRIO
 
DE BIOQUÍMICA
 
CLÍNICA
DOSAGEM
 
DE
 
BILIRRUBINA
)
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ALGETEC
 
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SOLUÇÕES
 
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Na literatura científica, a reação orgânica para a determinação de bilirrubina é conhecida como Sims-Horn, e consiste na diazotização e formação de azobilirrubina vermelha, que tem absorção em comprimento de onda na faixa de 500 a 540nm.
As doenças hepatocelulares e a obstrução das vias biliares são as causas mais frequentes de alterações séricas da bilirrubina.
Na prática, kits comerciais contendo os reagentes necessários são facilmente encontrados, devendo-se apenas adicionar cada item indicado para posterior análise. No local de trabalho, todas as etapas que devem ser seguidas para o preparo da solução a ser analisada estarão descritas em um procedimento operacional-padrão (POP), que deverá ser rigorosamente seguido.
A composição desses kits para testagem consiste basicamente em três frascos: acelerador (cafeína, benzoato de sódio e acetato de sódio); nitrito de sódio; e reagente sulfanílico (ácido sulfanílico e ácido clorídrico). Além desses, há ainda o padrão, que é o calibrador. A partir da adição de reagentes, realiza-se a homogeneização e posterior banho-maria, antes de ser realizada a análise instrumental.
BILIRRUBINA DIRETA X BILIRRUBINA INDIRETA
Na rotina clínica, é comum encontrar as designações “bilirrubina direta”, “bilirrubina indireta” e “bilirrubina total”. A reação direta ocorre com a reação imediata da bilirrubina ao reagente diazo de Ehrlich. A bilirrubina direta, ou conjugada, é ligada ao ácido glicurônico e dosada em meio aquoso. A bilirrubina total é a soma da direta com a indireta, sendo dosada por solubilizador de ação catalisadora, também denominado “acelerador”, com composição de cafeína e benzoato. A reação indireta consiste em outra forma de a bilirrubina reagir somente após adicionar-se álcool ao meio da reação, pois ela é insolúvel em água. A bilirrubina indireta, que é não conjugada, pode ser determinada pela diferença entre as bilirrubinas total e direta.
A bilirrubina não conjugada, ou indireta, circula na corrente sanguínea, ligada à albumina. No fígado, ao ser conjugada com o glicuronídeo, resulta na bilirrubina conjugada, ou direta, que é excretada do fígado para a bile, atingindo o segmento duodenal do intestino delgado através do ducto biliar comum.
ASPECTOS SOBRE A AMOSTRA
A maioria dos testes comerciais disponíveis permite a análise em soro ou plasma (com uso de EDTA ou heparina), livres de hemólise, uma vez que a hemoglobina pode causar resultados falsamente aumentados.
Como as bilirrubinas são oxidadas pela ação da luz, as amostras de sangue devem ser protegidas da exposição direta a luz artificial ou solar. O analito é estável por três dias, quando a amostra é armazenada entre 2 e 8°C, protegida da luz.
Uma vez preparada a solução a ser analisada no equipamento, deve-se lembrar de que a estabilidade de sua cor é de apenas trinta minutos.
A coleta de informações prévias tem muita importância, principalmente para rastrear o uso de possíveis substâncias, ou quadros clínicos, que podem interferir no resultado da análise.
Algumas substâncias, como esteroides anabolizantes, ácido ascórbico, salicilatos e vitamina A, podem elevar os valores de bilirrubina. Já a cafeína e as penicilinas podem interferir nas dosagens, diminuindo os valores de bilirrubina.
Lipemias com valores de triglicérides acima de 150mg/dL apresentam interferência, levando a resultados falsamente diminuídos.
INTERPRETAIÃO DE RESULTADOS
O aumento na dosagem de bilirrubina permite a análise de um quadro de icterícia, que compreende a coloração visível dos tecidos pela bile, que geralmente ocorre com taxas acima de 2,5mg/dL. As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta são as doenças hepatocelulares e as obstruções das vias biliares.
Já os casos de valores altos de bilirrubina indireta correlacionam-se com as seguintes causas: aumento na produção de bilirrubina, decorrente de hemólise; diminuição do transporte de bilirrubina, por ação de medicamentos e anticorpos; e defeito na captação de bilirrubina (deficiência ou bloqueio das lingandinas) ou em sua conjugação (icterícia fisiológica do recém-nascido, doença de Gilbert, etc.).
CONCEITOS ENVOLVENDO A MEDIIÃO ANALÍTICA
As análises realizadas podem ser divididas em qualitativas e quantitativas. Nas qualitativas, busca-se uma resposta sobre a presença ou ausência de determinada substância. É o caso de testes que dão resultados positivos ou negativos com base em uma mudança de cor (testes colorimétricos), e muitas vezes são rápidos, com preparo muito simples, ou até mesmo sem preparo, da amostra. As análises quantitativas, por sua vez, estabelecem um valor sobre a concentração da substância, como a determinação de bilirrubina.
Para essas medidas, utiliza-se instrumentação analítica que correlacione a concentração de analito com a intensidade de um sinal. Muitas vezes, faz-se necessário um procedimento experimental para preparo de solução, por meio da adição de reagentes, homogeneização, etc.
A chamada solução de “branco” refere-se à solução de reagente sem amostra ou padrão. A cor da solução final é transparente, pois não há qualquer concentração de
bilirrubina para reagir. Considera-se este um “branco de reagente”, pois contém todas
as substâncias presentes no procedimento de preparo, passando pelas mesmas etapas.
Essa solução refere-se a um pequeno erro positivo nos resultados do teste proveniente dos próprios reagentes, e o valor medido deve ser descontado do obtido para amostra.
É comum que ocorra confusão com a ideia de “amostra em branco” (ou “branco de equipamento”), que é o uso de uma solução para zerar um instrumento durante um procedimento de teste, como a água deionizada. Ao zerar o instrumento com uma amostra em branco, apenas a cor que se desenvolve a partir da reação com os reagentes é medida.
O padrão utilizado no procedimento consiste em uma solução preparada pelo fabricante, com composição conhecida e concentração determinada. Este servirá como valor de referência para estimativa do valor da amostra.
ANÁLISE POR ESPECTROFOTOMETRIA
Essa etapa é realizada em laboratório bioquímico, e engloba o preparo das soluções após coleta de amostras. Segue-se com a adição de reagentes, homogeneização e banho-maria, para análise em espectrofotômetro (Figura 2), a ser brevemente explicada neste tópico.
Figura 2 – Espectrofotômetro. Fonte: Shutterstock.
A espectrofotometria UV-VIS é uma das técnicas analíticas mais empregadas, devido a sua robustez, custo de aquisição acessível e ampla gama de aplicações difundidas na comunidade científica.
A análise tem como base as medidas de absorção da radiação eletromagnética, nas regiões visível e ultravioleta do espectro. Mede-se a quantidade de luz absorvida pela amostra e relaciona-se com a concentração do analito. A absorção de luz é determinada pelo comprimento de onda (na faixa visível e ultravioleta) selecionado para cada tipo de pigmento de cor observado e, no caso da análise da bilirrubina, estabelece- se em 530nm.
Esse feixe de luz no comprimento de onda estabelecido atravessaa amostra, que está em uma cubeta (material transparente que permite a passagem de luz). A relação da luz absorvida observada no detector do equipamento é apresentada na forma de absorbância, sendo calculada pela Lei de Lambert-Beer. Esse valor consta na tela do equipamento ou no computador acoplado, em que, algumas vezes, é possível ver o perfil gráfico obtido, conhecido como espectro.
A Lei de Lambert-Beer consiste no produto da multiplicação de três fatores: caminho óptico (tamanho da cubeta inserida no equipamento); constante de absortividade molar da substância de interesse (dado encontrado na literatura); e concentração do analito presente. Dessa forma, tem-se uma relação direta entre a intensidade de sinal e a quantidade de substância presente.
 (
Fonte
 
de
 
luz
Seletor
 
de
comprimento
 
de onda
 
(530nm)
Amostra
 
(dentro
da
 
cubeta)
Detector
 
(gera
sinal
 
elétrico)
Processamento
de
 
sinal
 
para
computador
)A Figura 3 apresenta um esquema da análise por espectrofotometria no equipamento, que permite ao analista obter o valor de absorbância a ser trabalhado para conversão na determinação de glicose.
Figura 3 – Esquema do funcionamento da análise por espectrofotometria UV-VIS. Fonte: Elaborada pelo autor.
O cálculo para determinar a concentração de bilirrubina, em mg/dL, é realizado a partir da seguinte relação entre os parâmetros:
𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎çã𝑜 (𝐹𝐶) =
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜
∗ 10
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑙𝑖𝑟𝑟𝑢𝑏𝑖𝑛𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 𝐹𝐶
Para obter a absorbância de cada leitura no teste, deve-se realizar a seguinte subtração:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑙𝑖𝑑𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜
No caso do padrão, desconta-se também o valor do branco, para se obter a absorbância.
BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO
Como se pode perceber, há dois momentos distintos de cuidados a serem seguidos: a coleta de amostra e o procedimento realizado em laboratório. O uso de equipamentos de proteção individual (EPIs) é essencial em todas as etapas, visando garantir a segurança contra a exposição do profissional a agentes químicos e/ou biológicos, além de blindar todo o processo de possíveis contaminações.
Todas as etapas em laboratório devem seguir o Guia de boas práticas de laboratório – BPL (ou Good laboratory practice – GLP), cujo conhecimento é essencial para profissionais que ingressam no mercado de trabalho. Nas referências bibliográficas, há o link de acesso do documento em inglês, que serve como base para documentos editados no Brasil.
O adequado manuseio da pipetagem garante que o volume correto de amostra seja aliquotado. Nessa etapa, erros no manuseio de pipetas acarretam medidas imprecisas, uma vez que pode ocorrer desproporção entre volume de reagente e amostra.
Caso ocorra a coleta de menor volume de amostra ou reagente, o valor obtido no final será menor. Se for necessário trabalhar com uma menor quantidade de amostra
(por exemplo, 5μL), é importante que a proporcionalidade seja mantida (sendo
adicionados, portanto, 500μL).
É prudente consultar a Ficha de Informação de Segurança de Produtos Químicos (FISPQ) de cada reagente envolvido no procedimento, a fim de conhecer a toxicidade. Além disso, deve-se atentar ao correto descarte de material biológico após o manuseio.
Na prática vista no Laboratório Virtual, algumas medidas visam garantir também a não contaminação de material biológico, pelo uso de ponteiras descartáveis para cada amostra e reagente. Nesse caso, além de se evitar a contaminação do sangue do indivíduo A no frasco da amostra correspondente ao indivíduo B, garante-se que não haverá adição de padrão em amostras, que poderia acarretar uma medida incorreta.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANALISA. Bilirrubinas. Analisa, [20--?]. Disponível em:
http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B311C4377-C1C7-427F-B168- ECA6D041CC69%7D_BILIRRUBINAS[1].pdf. Acesso em: 29 jun. 2022.
BIOANALÍTICA DIAGNÓSTICA LTDA. Bilirrubina. Bioanalítica Diagnóstica Ltda., 2020. Disponível em: http://bioanalitica.com.br/wp-content/uploads/2019/06/bilirrubina- ref-ba031.pdf. Acesso em: 29 jun. 2022.
HEXIS CIENTÍFICA. Qual é a diferença entre branco do reagente e branco da amostra? Hexis	Científica,	2020.	Disponível	em: https://suporte.hexis.com.br/app/answers/answer_view/a_id/1027161/~/qual-
%C3%A9-a-diferen%C3%A7a-entre-branco-do-reagente-e-branco-da-amostra%3F- #:~:text=O%20valor%20do%20branco%20do%20reagente%20pode%20mudar%20de% 20um,durante%20um%20procedimento%20de%20teste. Acesso em: 29 jun. 2022.
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FMUSP. Manual de boas práticas laboratoriais. São Paulo: Fmusp,	2015.	Disponível	em:	https://limhc.fm.usp.br/portal/wp- content/uploads/2015/11/Manual_Guia_de_Boas_Praticas.pdf. Acesso em: 22 jun. 2022.
MBIOLOG DIAGNÓSTICOS LTDA. Bilirrubina: Sims-Horn – direta/total. MBiolog Diagnósticos Ltda., 2011. Disponível em:
http://mbiolog.com.br/produtos/Bilirrubina_Colorimtrica_c_padro_Cepa_vs_05_1.pdf
. Acesso em: 29 jun. 2022.
PUBCHEM.	SID	319295333.	PubChem,	2016.	Disponível	em: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/substance/319295333#section=2D-Structure.
Acesso em: 14 jul. 2022.
ROCHA, F. R. P.; TEIXEIRA, L. S. G. Estratégias para aumento de sensibilidade em espectrofotometria UV-VIS. Química Nova, v. 27, n. 5, p. 807-812, 2004. Disponível em:
https://doi.org/10.1590/S0100-40422004000500021. Acesso em: 22 jun. 2022.
VIDA BIOTECNOLOGIA. Bilirrubina total. Vida Biotecnologia, [20--?]. Disponível em:
https://www.vidabiotecnologia.com.br/novo_site/content/uploads/2015/08/BILIRRUB INA-TOTAL.pdf. Acesso em: 29 jun. 2022.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Good laboratory practice (GLP): quality practices for regulated non-clinical research and development. Geneve: UNDP/World Bank/WHO. Disponível em: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66894/TDR_PRD_GLP_01.2.pdf?seq uence=1&isAllowed=y. Acesso em: 22 jun. 2022.