AULA_4_REPLICAÇÃO DNA

Prévia do material em texto

AULA_3 REPLICAÇÃO do DNA
ACH4157 – Genética Molecular
Na divisão celular;
DIVISÃO CELULAR
Ou um processo de proliferação celular em um organismo
multicelular;
Que pode ser um processo de reprodução assexuada em
espécies unicelulares;
Concretizada na fase M do ciclo celular;
DIVISÃO CELULAR
Acontecem dois processos sucessivos;
DIVISÃO CELULAR
E a separação do conteúdo citoplasmático durante a
citocinese;
A divisão nuclear e separação dos cromossomos na telófase
no final da mitose;
DIVISÃO CELULAR
No processo de divisão celular, uma célula origina duas
células iguais a ela própria;
O que implica a célula
genitora duplicar seu
conteúdo genético de
forma precisa;
Durante a fase S
(síntese de DNA);
Antes da divisão
celular.
A continuidade da vida depende da transmissão da
informação genética de forma precisa de uma célula
mãe para as duas células filhas!
REPLICAÇÃO CELULAR
A estrutura da molécula de DNA (modelo da dupla 
hélice) foi proposto por Watson & Crick em 1953.
Qual foi a grande sacada do modelo?
A complementaridade das
bases nitrogenadas entre
as cadeias de DNA
permitiu visualizar um
modelo de duplicação,
Qual foi a grande sacada do modelo?
onde cada cadeia
original da molécula
passa a ser um molde
para a síntese de uma
cadeia complementar
resultando na geração
de duas novas
moléculas de DNA
Duplicação do DNA: semiconservativa
Acuidade do processo de replicação
É fundamental para o processo de replicação gerar duas
cópias fiéis do material genético, o que de fato acontece;
Mesmo para genomas contendo trilhões de pares de
nucleotídeos;
E com a necessidade de ser um processo muito rápido.
TAXA DE REPLICAÇÃO 
Eucarioto: 100 nucleotídeos/ segundo;
Bactéria : 1000-2000 nucleotídeos/ segundo.
Conservação do mecanismo de replicação
Os mecanismos e a maior parte das proteínas envolvidas
na replicação em bactérias e em eucariotos;
São conservados entre eles;
Provavelmente indicando que o surgimento desse
processo celular básico para a vida surgiu cedo na
evolução e foi mantido entre os seres vivos.
UMA EVIDÊNCIA CLARA DO PROCESSO EVOLUTIVO
A bactéria E coli, é uma espécie modelo para os estudos
básicos de biologia molecular.
13
Escherichia coli
Uma das espécies mais utilizadas em toda Biologia. Proporcionou
avanços notáveis: descobrimento do código genético, replicação
de DNA, regulação da expressão gênica, entender a importância
das mutações para evolução, utilização como organismo
geneticamente manipulável;
Bactéria Gram-negativa, aeróbia facultativa, formato de
bastonete;
Fácil de manter no laboratório, crescimento rápido.
Bactéria do microbioma (intestino) de vertebrados,
comensal (ou mutualista);
No intestino humano, é a espécie mais abundante de
bactéria aeróbia (90%);
Embora, esteja na proporção de 1 para cada 1.000 (10.000)
bactérias anaeróbias;
Forma um biofilme no epitélio da mucosa do intestino. 14
Escherichia coli
MECANISMO de REPLICAÇÃO
As pontes de hidrogênio precisam ser desfeitas para expor as cadeias à
maquinaria de replicação do DNA;
Necessidade de um molde, que é cada uma das cadeias originais ;
Nucleotídeos livres e complementares vão sendo adicionados pela
DNA polimerase um a um, de acordo com a sequência da cadeia
molde;
MECANISMO de REPLICAÇÃO
A incorporação ocorre de uma única maneira, na direção 5’ para 3’;
O fosfato do nucleotídeo a ser incorporado se liga covalentemente à
hidroxila da posição 3 do açúcar do último nucleotídeos da cadeia;
Isso confere polarização da cadeia e a direcionalidade do processo;
Que é energeticamente favorável com a hidrólise das ligações fosfato e
liberação do pirofosfato.
MECANISMO de REPLICAÇÃO
A replicação ocorre a partir de regiões específicas do genoma, onde
estão presentes as sequência de origem da replicação;
Existem entre 104 a 105 origens de replicação no genoma humano;
Com um tamanho do replicon (unidade de replicação) entre 5x 104 a 3x
105 pbs;
O rompimento das pontes de hidrogênio na região de origem de
replicação separam as fitas e geram as bolhas de replicação;
MECANISMO de REPLICAÇÃO
Nas extremidades de cada bolha é formada uma forquilha de
replicação;
As forquilhas afastam-se em sentidos contrários enquanto o DNA está
sendo duplicado.
MECANISMO de REPLICAÇÃO
Existe uma assimetria na forquilha de replicação, na forma como o
processo acontece em cada uma das fitas;
A síntese é contínua na fita líder e descontínua na fita retardada;
A síntese contínua é feita a partir da cadeia molde 3’ para 5’;
A síntese descontínua é feita a partir da cadeia molde 5’ para 3’.
MECANISMO de REPLICAÇÃO
A síntese contínua significa que uma vez iniciada, a cadeia não é
interrompida;
Enquanto na síntese
descontínua, a cadeia é
gerada a partir da síntese
simultânea em pequenos
trechos;
Originando fragmentos de
Okazaki (fragmentos entre
1000-2000pb em bactéria
e 1/10 em eucariotos);
Essa diferença de síntese é uma restrição da DNA polimerase pois
possui capacidade de polimerizar apenas da direção 5’ para a 3’.
MECANISMO de REPLICAÇÃO
Por outro lado, a DNA polimerase tem
uma capacidade de autocorreção;
Tem a capacidade de checar se o último
nucleotídeo incorporado está errado;
E nesse caso, apresenta uma atividade
exonucleolítica 3’ – 5’;
Removendo o nucleotídeo e tendo a
oportunidade de incorporar o nucleotídeo
correto;
Diminuindo a frequência de mutações
durante a replicação.
AUTOCORREÇÃO
A replicação em eucariotos e procariotos é muito semelhante;
Na bactéria, o genoma é uma molécula única de DNA circular que é
replicada a partir de uma única origem de replicação;
REPLICAÇÃO
Nos eucariotos a replicação é iniciada simultaneamente a partir de
inúmeras origens de replicação.
A replicação do DNA circular é chamada de teta
por causa da similaridade com a letra grega ɵ;
Etapa final com atuação de
topoisomerase para separar as
moléculas entrelaçadas;
Processo bem controlado, uma vez
iniciado tende a ser finalizado, e
existe um controle rígido tb para
reinício da síntese.
Origens de replicação duplicadas estão ligadas a
membrana ajudando na separação dos
cromossomos;
REPLICAÇÃO BACTÉRIA
As bactérias possuem uma única origem de
replicação no cromossomo circular;
Essa região tem algumas centenas de nucleotídeos
e é rica em A/T;
Na origem forma-se uma bolha de replicação e
duas forquilhas estendem cadeias em direções
opostas até se encontrarem, após duplicarem
metade do cromossomo;
E coli leva 40 minutos para duplicar 4,6x106 pb;
(≈50.000 pb).
REPLICAÇÃO BACTÉRIA
Proteínas DnaA reconhecem sequências da
origem de replicação;
Promovem o enrolamento do DNA no seu
entorno, ao mesmo tempo
desestabilizando e abrindo trecho de DNA
adjacente rico em AT;
Esse complexo atrai duas proteínas
carregadoras de helicases e as próprias
helicases ainda inativas;
Após a fixação no DNA as helicases são
ativadas e desemparelham regiões
imediatamente na região das forquilhas;
Abrindo a cadeia o suficiente para a
sequência do processo replicativo.
REPLICAÇÃO BACTÉRIA
MAQUINARIA DE REPLICAÇÃO
A DNA polimerase é parte de um complexo multienzimático; Outras
enzimas com funções específicas são necessárias para viabilizar a
polimerização.
MAQUINARIA DE REPLICAÇÃO
A principal enzima da replicação é a DNA polimerase;
Ela própria uma holoenzima (formada por cadeias diferentes);
DNA POLIMERASE
Existem diferentes DNA
polimerases em bactérias, duas
delas atuam ativamente na
síntese de DNA;
As DNA polimerase I e III;
Sendo que a DNA polimerase III
sintetiza a fita contínua e a
maior parte da fita descontínua.
BRAÇADEIRA DESLIZANTE
Complexo necessário para manter a DNA polimerase aderida ao DNA;
A braçadeira propriamente dita amarra a polimerase ao DNA sem
impedir sua atuação;
O complexo ainda depende um carregador que controla a interação
utilizando ATP;
Com a hidrólise o complexo é desfeito e a polimerase se solta, também
necessário quando a polimerase encontra o primer na cadeia
retardada.
DNA PRIMASE
A DNA polimerase é uma enzima que
estendeuma cadeia já iniciada;
É incapaz de iniciar a polimerização de
novo (na ausência de uma sequência já
presente);
Então, uma cadeia iniciadora com uma
sequência de RNA (10 nucleotídeos), que
é o primer necessário para a DNA
polimerase atuar;
A enzima responsável pela síntese do
primer é a primase, uma RNA
polimerase.
SÍNTESE DESCONTÍNUA
FRAGMENTO 
DE OKAZAKI
A partir da extremidade 3’ do primer de
RNA;
A DNA polimerase sintetiza trechos de
DNA, fragmentos de Okazaki (1200
nucleotídeos);
Ao se aproximar de um primer, a DNA
polimerase reconhece o híbrido;
E tem capacidade de remover os
ribonucleotídeos e e substituí-los por
desoxirribonucleotídeos.
DNA 
POLIMERASE I
A DNA polimerase I
reconhece o trecho
de RNA;
E remove essa
sequência repondo
com nucleotídeos de
DNA.
DNA LIGASE
Após a DNA polimerase I estender o trecho onde estava o
primer;
A DNA ligase utilizando ATP;
Consegue ligar o fosfato 5’ e a hidroxila 3’ da cadeia aberta;
Selando as extremidades de uma cadeia com uma ligação
covalente.
DNA HELICASE
Enzima que está à frente da DNA polimerase e é responsável pela
separação das cadeias na forquilha de replicação;
Por meio de energia fornecida por ATP.
PROTEÍNAS LIGADORAS DE DNA FITA SIMPLES
Após a helicase separar as fitas de DNA;
Proteínas ligadoras de DNA fita simples, atuam de forma
cooperativa impedindo que as pontes de hidrogênio se refaçam;
Ou a formação de pareamentos entre nucleotídeos da cadeia
lagging.
TOPOISOMERASES
À frente da forquilha de DNA, a
medida que a dupla fita de DNA
é desenrolada, tb é gerada uma
torsão da fita mais adiante;
Na impossibilidade de aliviar
essa tensão desenrolando todo
cromossomo, poderia ser
gerada uma situação de
superenrolamento que afetaria
a própria replicação.
Essa situação é contornada pela
topoisomerase em regiões anteriores à
forquilha;
A enzima gera uma quebra temporária de uma
única fita;
Possibilitando a rotação livre das extremidades
quebradas e o alívio da tensão local;
Em seguida ocorre a regeneração espontânea
da ligação.
TOPOISOMERASES
A presença das enzimas ativas na região de síntese define uma
maquinaria de replicação ou replissoma;
Que coordena a síntese das duas fitas que ficam próximas entre
si.
MAQUINARIA DE REPLICAÇÃO
Os eucariotos realizam de forma equivalente a replicação do
DNA;
Com algumas diferenças;
Como um controle mais complexo do início de replicação
durante o ciclo celular;
E a remoção do primer ser realizada por 2 enzimas
diferentes: uma RNAse que reconhece a molécula híbrida
DNA-RNA e uma polimerase específica que complete os
nucleotídeos faltantes.
REPLICAÇÃO EUCARIOTOS
REPLICAÇÃO EUCARIOTOS
Em levedura foram mapeadas as sequências de DNA que atuam
como origens de replicação;
Em organismos mais complexos essas regiões ainda não são
conhecidas;
Cada origem de replicação, origina uma unidade de replicação
(replicon);
Origens de replicação vizinhas são acionadas simultaneamente.
Os nucleossomos são empecilhos para a replicação;
As subunidades de histona são afastadas ou temporalmente
removidas dos nucleossomos à frente da forquilha, atividade
mediada por complexos de remodelagem da cromatina;
Imediatamente após a duplicação dímeros e tetrâmeros de
histonas vão sendo reorganizados com auxílio de outras
proteínas;
Além disso, histonas adicionais são necessárias para gerar os
nucleossomos nas novas fitas sintetizadas;
O que é possível graças a um aumento da expressão de várias
cópias desses genes durante a fase S.
REPLICAÇÃO EUCARIOTOS
REPLICAÇÃO TELÔMERO
REPLICAÇÃO TELÔMERO
A replicação do DNA linear dos
cromossomos gera um problema nas
extremidades do cromossomo;
O último primer da fita retardada não vai
ser reposto com uma sequência de DNA;
Pois não há OH-3’ para DNA polimerase
estender;
Então, a tendência é a perda DNA das
extremidades a cada replicação (entre 50 -
200 pb).
Os eucariotos lidam com esse problema com as
características especiais das regiões das extremidades dos
cromossomos (TELÔMEROS);
Os eucariotos possuem repetições em tandem nessas
regiões;
Em humanos, a unidade de repetição é a sequência 5′-
TTAGGG-3′ presente entre 100 a 1500 cópias;
Então, a perda de sequências não implica na perda de
genes por um número limitado de gerações.
REPLICAÇÃO TELÔMERO
Por outro lado, a existência de extremidades não emparelhadas;
Ou seja, uma extremidade maior que a outra, predispõe o sistema
de monitoramento celular eliminar esse DNA alterado;
Exonucleases atuam diminuindo o tamanho da fita podem tb
comprometer regiões mais internas do cromossomo;
Algumas espécies protegem a extremidade saliente da fita
formando uma alça.
REPLICAÇÃO TELÔMERO
REPLICAÇÃO TELÔMERO
As sequências repetidas dos
telômeros;
Tb são alvos de uma polimerase
especial, a telomerase;
Que possui uma sequência de
RNA completar as repetições;
E atividade transcriptase reversa;
Que uma fita de DNA a partir de
um molde de RNA;
Nesse caso, estende a fita
sobressalente;
Enquanto uma DNA polimerase
estende a outra fita.
Mesmo assim existe um encurtamento dos telômeros;
Que é mais sério nas célulsa onde as telomerases não atuam;
A hipótese é de que a divisão celular constante nesses tecidos
poderia resultar na formação de tumor;
Por outro lado, em algumas linhagens esse encurtamento é
justamente o desencadeador do mal funcionamento de tecidos
e o surgimento de tumores;
Por isso, o encurtamento dos telômeros é interpretado como
um relógio celular, responsável pela senescência e pelo
envelhecimento.
REPLICAÇÃO TELÔMERO
	Número do slide 1
	Número do slide 2
	Número do slide 3
	Número do slide 4
	Número do slide 5
	Número do slide 6
	Número do slide 7
	Número do slide 8
	Número do slide 9
	Número do slide 10
	Número do slide 11
	Número do slide 12
	Número do slide 13
	Número do slide 14
	Número do slide 15
	Número do slide 16
	Número do slide 17
	Número do slide 18
	Número do slide 19
	Número do slide 20
	Número do slide 21
	Número do slide 22
	Número do slide 23
	Número do slide 24
	Número do slide 25
	Número do slide 26
	Número do slide 27
	Número do slide 28
	Número do slide 29
	Número do slide 30
	Número do slide 31
	Número do slide 32
	Número do slide 33
	Número do slide 34
	Número do slide 35
	Número do slide 36
	Número do slide 37
	Número do slide 38
	Número do slide 39
	Número do slide 40
	Número do slide 41
	Número do slide 42
	Número do slide 43
	Número do slide 44
	Número do slide 45
	Número do slide 46
	Número do slide 47
	Número do slide 48
	Número do slide 49