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PapelCaMKIIhipocampal_Apolinario_2023

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
PAPEL DA CaMKII HIPOCAMPAL NO PROCESSAMENTO DAMEMÓRIA DE
RECONHECIMENTO DE OBJETOS
Discente: Gênedy Karielly da Silva Apolinário
Orientador: Prof. Dr. Martín Cammarota
Coorientadora: Profa. Dra. Janine I. Rossato
NATAL
2023
GÊNEDY KARIELLY DA SILVA APOLINÁRIO
PAPEL DA CaMKII HIPOCAMPAL NO PROCESSAMENTO DAMEMÓRIA DE
RECONHECIMENTO DE OBJETOS
Orientador: Prof. Dr. Martín Cammarota
Coorientadora: Profa. Dra. Janine I. Rossato
Natal
2023
Apolinário, Gênedy.
 Papel da CaMKII hipocampal no processamento das memórias de
reconhecimento de objetos / Gênedy Karielly da Silva Apolinário.
- 2023.
 106f.: il.
 Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Biociências, Programa de pós-graduação em
psicobiologia, Natal, 2023.
 Orientador: Dr. Martín Pablo Cammarota.
 Coorientadora: Dra. Janine Inez Rossato.
 1. CaMKII - Tese. 2. Consolidação - Tese. 3. Reconsolidação -
Tese. 4. Memória de reconhecimento de objetos - Tese. I.
Cammarota, Martín Pablo. II. Rossato, Janine Inez. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 159.929
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429
Título: Papel da CaMKII hipocampal no processamento da memória de reconhecimento de
objetos
Autor: Gênedy Apolinário
Data da defesa: 12/07/2023
Banca Examinadora
Prof. Dr. Martín Cammarota
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profa. Dra. Grace Schenatto Pereira Moraes
Universidade Federal de Minas Gerais
Prof. Dr. Jorge Horácio Medina
Universidade de Buenos Aires
Agradecimentos
Gostaria de aqui ressaltar o quão especiais foram os anos de meu doutorado! É tanta coisa que
pode acontecer dentro de um período relativamente curto. Foram muitas reviravoltas. E para
minha felicidade, muitas boas. Conheci por meio do laboratório gente que passei a adorar.
João, Joseph, Raquel e Brisa vocês foram uma bela e definidora reviravolta no meu
doutorado! É ótimo trabalhar com vocês! Agradeço também à Marina, Luizi e Lívia, que na
iniciação científica contribuem (contribuiu, né Marina?) até demais para a vida dos
pós-graduandos (hehe). Agradeço também a Andressa e a Caro! O trabalho de vocês duas é e
tem sido muito importante para o funcionamento do laboratório. Minha história com vocês
começa juntamente com minha entrada no laboratório! Me selecionaram como ic, acho que,
inclusive, sem o Martín saber (?!). Depois o Martín intrigado perguntou “¿Quién es este
chico?” (haha).
No período de doutorado, Caio, começamos a morar juntos! E eu sou muito feliz por isso.
Não poderia ter uma companhia melhor que a sua. E isso numa perspectiva de doutoramento,
aí é que não poderia mesmo. Agradeço-lhe enfaticamente, com o lhe no canto correto da
palavra, para soar como uma brincadeira simples (S2) de acadêmicos! Você foi fundamental
no meu doutorado (e certamente não só nele!). Amo nossa história. Você é especial demais,
você é minha referência de melhor presente. Se gosto muito de alguém, penso “você tem que
conhecer o Caio!” Você é tão profundamente real! Sabe o que eu captei? que sentem por todo
canto “dois doutorandes muito humanos e duas cachorras super doces… eis que são” (eu te
amo!).
Mãe e irmãs, esperando ansioso por a gente se ver juntes. Imaginam só? E agora eu com
minha formação completa? Mesmo com tantos furos de tempo, só sinto que vai ser legal!
Entram no meu agradecimento também, as causas são maiores do que eu possa dizer. É uma
coisa de história, por certo. E olha já se vão muitos anos em?! Sempre saudades de vocês.
Aline! Especialíssima em minha vida! Trouxe-me tanta coisa tesouresca (de tesouro!). Não
vou falar tanto mais, mas é sempre muito mais o que tenho para falar a mim mesmo da sua
presença. Agradeço sua companhia, também no período doutorado!
Para falar desta pessoa, eu já começo com um AGRADECIMENTO todo enorme. E só de
fazer isso, o mundo já sabe de quem se trata, né? Janine, quero agradecer bastante por todo
seu empenho na minha orientação. Este documento de tese tem muito-muito de você (quando
digo muito, pensem ainda mais!). Não tenho nem como pontuar. É muito bom estar em um
laboratório com você à frente. Você tornou-se idilicamente (!! eu inventando coisa) incrível
para mim. Obrigado!
Lia, nós nos demos muito bem, não é? A gente fez disciplinas juntos (tu de professora e eu de
aluno ou de estagiário docente!), e era fácil da gente se relacionar com os assuntos e, logo, um
com o outro! Aquela vez que eu montei uma apresentação sobre epigenética e falei para você
assim “tá vou falar do jeito que eu penso” foi um divisor de águas para mim na
pós-graduação! Senti também que a gente se encontrou de kindred spirits ali. Eu aprendi
muito com a sua maneira de dar aula! Sinto-me bem sortudo por ter ganhado isso de você,
saiba. Agradeço muito seu cuidado e sua abertura para comigo. Obrigado pela companhia no
doutorado também! Love u (e dito assim, lembro-me de você especialissimamente!)
Martín, eu tenho certeza do ótimo trabalho que você faz em seu laboratório. E é muito bom
perceber isso. Digo, ter em mim meios de entender (não que eu seja um super entendido, né?!
haha). Meu agradecimento é um dos que mais deve ter a palavra trabalho por ai, aposto. E
isso tem muito a ver com uma compreensão muito refinada de sua parte sobre o que o ato do
trabalho traz consigo. Você é demais! Obrigado pelo espaço de seu laboratório, pela sua
orientação e por você ser você!
Agradeço também à banca examinadora, composta pelas professoras Elaine Gaviole, Vanessa
Rachetti e Grace Moraes, e pelo professor Jorge Medina, pela disponibilidade e pela
contribuição neste momento tão importante de minha formação.
Por fim, mas de maneira nenhuma menos importante, agradeço à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN) e à Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) por todo o financiamento investido em minha formação! Possibilitaram minha
realização pessoal, a qual também é profissional. Fico muito realizado!
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Resumo
Informações adquiridas podem ser estabilizadas em memórias de longa duração (MLD) por
meio de um processo dependente de síntese proteica e expressão gênica denominado
consolidação. A evocação é capaz de desestabilizar as MLD que podem ser modificadas e,
para persistirem, devem passar por um novo processo dependente de síntese proteica e
expressão gênica denominado reconsolidação. A reconsolidação acontece em duas etapas e
atua sobre um traço mnemônico já existente. A primeira, chamada desestabilização, deixa o
traço mnemônico reativado em um estado maleável e passível de modificação, a segunda,
chamada restabilização, permite que o traço mnemônico se torne novamente estabilizado. As
memórias de reconhecimento de objetos (MRO) são representações declarativas essenciais
para recordar conhecimentos e eventos. De fato, um dos primeiros sintomas da doença de
Alzheimer é o declínio desse tipo de memória. O estudo das proteínas sinápticas hipocampais
foi fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos da memória nas últimas
décadas. No entanto, o papel dessas proteínas no processamento das MRO permanece pouco
compreendido. Investigamos o papel da proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina
(CaMKII) hipocampal no processamento da MRO. Nossos resultados demonstram que, em
ratos, (1) a CaMKII hipocampal é fundamental para a consolidação da MRO, (2) esseresultado é observado tanto em machos como em fêmeas, (3) a inibição da CaMKII não
impede aprendizados futuros nem prejudica os já consolidados, (4) a CaMKII hipocampal é
essencial para a desestabilização da MRO, mas não para a sua restabilização, (5) o processo
de desestabilização da MRO induz o acoplamento de amplitude de fase teta-gama hipocampal
que é impedido pela inibição da CaMKII. Entendemos que a regulação dos mecanismos de
ativação dados pela CaMKII é de extrema importância para os processos fisiológicos e, logo,
seu estudo, para a compreensão de como desordens neurológicas se desenvolvem.
Palavras-chave: CaMKII, Consolidação, Reconsolidação, Memória de reconhecimento de
objetos
Abstract
Consolidation stabilizes learned information in long-term memories (LTM) through a protein
synthesis and gene expression dependent process known as consolidation. LTM can be
destabilized when recalled and must go through a “de novo” protein synthesis and gene
expression dependent process called reconsolidation. Reconsolidation takes place in two
phases and acts on an already existing mnemonic trace. The first phase, named
destabilization, leaves the reactivated mnemonic trace in a malleable and modifiable state,
while the second one, named restabilization, allows the mnemonic trace to become stable
again. Object recognition memories (ORM) are declarative representations essential for
remembering general knowledge and autobiographical episodes. In fact, one of the first
symptoms of Alzheimer's disease is a decline in this type of memory. In recent decades, the
study of hippocampal synaptic proteins has been fundamental for the better understanding of
the molecular mechanisms of memory. However, the role of these proteins in ORM
reconsolidation remains inconclusive. We investigated the role of hippocampal
calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in ORM processing. Our results
shows that in rats (1) hippocampal CaMKII is required for ORM consolidation, (2)
hippocampal CaMKII activity is necessary for ORM formation in male and female, (3)
inactivation of hippocampal CaMKII does not affect consolidated traces neither future
learning, (4) hippocampal CaMKII activity is required for ORM destabilization, but not for
ORM restabilization, (5) ORM destabilization induces phase-amplitude coupling of
theta-gamma, which is blocked by CaMKII inhibition. We understand that CaMKII activity is
unprecedented for physiological processes and, therefore, that the understanding of CaMKII
role in memory is crucial to the better comprehension of how neurological disorders develop.
Keywords: CaMKII, Consolidation, Reconsolidatio, Object recognition memory
Índice
Lista de abreviações.................................................................................................................. 12
Lista de figuras..........................................................................................................................13
Lista de tabelas..........................................................................................................................14
1. Introdução............................................................................................................................. 15
2. Antecedentes do tema........................................................................................................... 16
2.1. Conceitos e classificação das memórias............................................................................ 16
2.2. Substratos neurais.............................................................................................................. 19
2.3. Consolidação......................................................................................................................22
2.4. Reconsolidação.................................................................................................................. 24
2.5. Memórias de reconhecimento............................................................................................ 26
2.6. Atividade oscilatória neuronal........................................................................................... 28
2.7. CaMKII.............................................................................................................................. 29
2.8. NMDAr.............................................................................................................................. 31
2.9. Atividade da CaMKII e dos NMDAr na consolidação e reconsolidação.......................... 34
3. Objetivos............................................................................................................................... 36
3.1. Objetivo geral.....................................................................................................................36
3.2. Objetivos específicos......................................................................................................... 36
4. Metodologia.......................................................................................................................... 37
4.1 Animais experimentais........................................................................................................37
4.2 Cálculo amostral................................................................................................................. 37
4.3 Implantes de cânulas........................................................................................................... 37
4.4. Implantes de eletrodos....................................................................................................... 37
4.5. Análises eletrofisiológicas................................................................................................. 38
4.6. Fármacos............................................................................................................................ 38
4.7. Paradigma de reconhecimento de objetos..........................................................................39
4.8. Tarefas comportamentais complementares........................................................................ 41
4.9. Histologia........................................................................................................................... 41
4.10. Análise estatística dos dados............................................................................................41
5. Resultados............................................................................................................................. 43
5.1. Consolidação......................................................................................................................43
5.2. Reconsolidação.................................................................................................................. 52
6. Discussão.............................................................................................................................. 66
7. Conclusão..............................................................................................................................72
8. Bibliografia........................................................................................................................... 73
8. Anexos................................................................................................................................ 100
Lista de abreviações
AMPAr – receptor alfa-amino-3-hidrox-metil-5-4-isoxazolpropiónico
ANI – Anisomicina
AP5 – (2R)-amino-5-phosphonovaleric acid (antagonista dos receptores NMDA)
AIP – Peptídeo inibitório da CaMKII
ATG – Acoplamento de fase de amplitude teta-gama
CaM – Complexo Ca2+/Calmodulina
CaMKII – Proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina
EI – Esquiva inibitória
KN-93 – methoxybenzenesulfonamide inibitória da CaMKII
(N-[2-[[[(E)-3-(4-chlorophenyl)prop-2-enyl]-methylamino]methyl]phenyl]-N-(2-hydroxyethy
l)-4-methoxybenzenesulfonamide)
KN-92 – Derivadoinativo de KN-93 (usado como controle de KN-93)
LFP – Potencial de campo local
PSD – Densidade pós-sináptica
MCD – Memória de curta duração
MLD – Memória de longa duração
MRO – Memória de reconhecimento de objetos
NMDAr – receptor N-metil-D-aspartato
PSD-95 – Proteína 95 da densidade pós-sináptica
RO – RO 25-6981 (antagonista GluN2B dos receptores NMDA)
TCN – TCN-201 (3-cloro-4-fluoro-N-[4-[[2-(fenilcarbonil)hidrazino]carbonil]bensil]
benzenesulfonamida) (antagonista GluN2A dos receptores NMDA)
TEI – Tarefa de esquiva inibitória
TRON – Tarefa de reconhecimento de objeto novo
VEH – Veículo (solução de soro fisiológico)
12
Lista de figuras
Figura 1. Henry Molaison, o paciente H.M........................................................................ 19
Figura 2. Ressonância magnética do cérebro de Henry Molaison......................................19
Figura 3. William Scoville.................................................................................................. 20
Figura 4. Brenda Milner...................................................................................................... 20
Figura 5. O hipocampo........................................................................................................21
Figura 6. Modelo da reconsolidação da memória de reconhecimento de objetos.............. 24
Figura 7. Exemplos de padrões oscilatórios encefálicos.....................................................28
Figura 8. Diagrama da estrutura e do mecanismo de ativação da CaMKII........................ 30
Figura 9. O Receptor NMDA..............................................................................................32
Figura 10. Protocolo experimental da tarefa de reconhecimento de objeto novo...............38
Figura 11. Objetos estímulos da tarefa de reconhecimento de objeto novo........................38
Figura 12. Aparato da tarefa de reconhecimento de objeto novo....................................... 39
Figura 13. A inibição da CaMKII imediatamente após o treino impede a formação da
memória de reconhecimento de objetos de longa duração................................................. 43
Figura 14. A inibição da CaMKII durante o ciclo escuro também impede a formação da
MRO de longa duração....................................................................................................... 44
Figura 15. A amnésia causada pela inibição da CaMKII é persistente...............................45
Figura 16. A inibição da CaMKII não afeta a MRO de curta duração............................... 46
Figura 17. A inibição da CaMKII não afeta futuros aprendizados dependentes do
hipocampo...........................................................................................................................47
Figura 18. A amnésia causada por AIP é mimetizada pelo inibidor competitivo KN-93
mas não pelo análogo inativo ou pela sequência não codificante de AIP........................... 48
Figura 19. A amnésia causada por AIP é observada também em fêmeas adultas.............. 49
Figura 20. A infusão de AIP não impede aprendizados futuros nem prejudica aprendizados
já consolidados....................................................................................................................50
Figura 21. A inibição da CaMKII não afeta a restabilização da MRO...............................54
Figura 22. A inibição da CaMKII antes da reativação não afeta a expressão da MRO mas
impede o efeito amnésico do bloqueio farmacológico de GluN2A.................................... 57
Figura 23. A inibição da CaMKII concomitante com a inibição dos GluN2A não impede o
efeito amnésico induzido pelo antagonista TCN................................................................ 58
Figura 24. A inibição da CaMKII antes da reativação não afeta a expressão da MRO mas
impede o efeito amnésico da inibição de síntese proteica.................................................. 60
Figura 25. A inibição da CaMKII concomitante com a inibição de síntese proteica não
impede o efeito amnésico induzido pela anisomicina.........................................................61
Figura 26. A inibição da CaMKII impede o acoplamento Teta-Gama durante a reativação
da MRO...............................................................................................................................64
13
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.y2frn9d9p3g0
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.t566g2g23g2k
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.q07ay5v1p62d
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.yrxrqcvdqxry
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.6jkezbliatbk
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.fbpyykfyrzj7
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.iadcddo0kplg
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.31gh9sea3spl
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.47obajd6acwr
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.x0bxw96x80l7
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https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.vb0uderbpfw
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.vb0uderbpfw
Lista de tabelas
Tabela 1. Classificação das memórias segundo seu conteúdo (Sweatt, 2010)..........................18
Tabela 2. Classificação das memórias segundo seu tempo deduração (Sweatt, 2010)............ 19
14
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.pjpvgtayhkaf
https://docs.google.com/document/d/1VYJZSDSNkua3YykEK0ld460Vyx8yFVmL/edit#heading=h.94yoehofum63
1. Introdução
A busca pelo entendimento de como funcionam os mecanismos que possibilitam a vida, em
suas diversas formas, e os esforços empregados no desenvolvimento da medicina têm
originado diversas disciplinas (Lindberg, 2007). Uma delas é a neurociência. Essa disciplina,
pesquisas apontam, pode ter sua origem em estudos anatômicos e em estudos que procuravam
compreender o que torna o ser consciente e animado (Habbal, 2017; Lindberg, 2007; Wills,
1999). A esse respeito, existem registros da antiga Alexandria datados de meados de 400
A.C., os quais, por exemplo, relatam o fato de o cérebro controlar os músculos por meio dos
nervos (Habbal, 2017; Lindberg, 2007; Wills, 1999). Outrossim, há registros desse mesmo
período cujos apontamentos estabelecem uma relação entre número de giros cerebrais e nível
de inteligência das espécies (Will, 1984; Wills, 1999).
A neurociência, apesar de ter referências tão antigas, foi inaugurada como disciplina apenas
no século XX, após o crescente acúmulo de conhecimento acerca do sistema nervoso.
Acúmulo que se intensificou a partir do período renascentista. Entre os séculos XV e XX,
contribuições importantes feitas por Vesalius, Galvani, Legallois, Broca, Cajal, Pavlov, Cole e
Curtis, Loewi e Dale, Eccles, Kuffler, Levi-Montalcini, Hubel, dentre muitos outros e outras,
estabeleceram os fundamentos da neurociência ao elucidar as particularidades do tecido
nervoso que o tornam diferente dos demais, o qual então passou a ser estudado a partir das
propriedades únicas da comunicação neuronal, incluindo suas atividades elétricas, químicas e
moleculares (Kandel, 1982).
A multidisciplinaridade é uma característica marcante da neurociência. Esse fato parece ter
causa na própria complexidade do que o sistema nervoso é. Não surpreendente, biólogos,
biomédicos, psicólogos, filósofos, químicos, físicos, matemáticos, engenheiros
computacionais e da informação, dentre outras profissões, são altamente atuantes na
neurociência, sendo essas mesmas profissões, em última instância, responsáveis pela própria
forma dessa disciplina.
15
Uma vertente da neurociência é a neurociência comportamental, também conhecida como
psicobiologia (Breedlove et al., 2010). Essa área de estudos é norteadora da presente tese. Ela
surge da busca pela compreensão das causas biológicas dos comportamentos. Para isso,
pesquisadores e pesquisadoras desse campo de conhecimento fazem uso de ferramentas
experimentais da área da fisiologia, da biologia evolucionista, da biologia celular e molecular,
da biofísica, da bioquímica, da computação, dentre outras áreas.
Na atualidade, a biologia molecular molda a forma como a neurociência comportamental é
pensada e estudada (Benson, 2020). Ela tem possibilitado, por exemplo, meios experimentais
para identificação dos componentes das cascatas da sinalização neuronal, para a determinação
de circuitarias nervosas e para o detalhamento das propriedades elétricas do tecido neural, o
que, por sua vez, tem promovido o melhor entendimento do sistema nervoso e de suas
resultantes comportamentais.
O campo de estudo da biologia da memória, de onde também fundamenta-se o presente
trabalho de tese, de mesmo modo, entrou, pode-se dizer, em sua era molecular. Hoje, por
exemplo, quando se pensa em memória de um ponto vista experimental, pergunta-se quais são
as circuitarias, as moléculas e os padrões oscilatórios que medeiam esse processo.
Nessa direção, esta tese de doutorado, no campo da neurociência comportamental e no campo
da memória, trata de entender o papel da proteína quinase II dependente de
cálcio/calmodulina (CaMKII) na consolidação e na reconsolidação da memória de
reconhecimento de objetos. Para isso, foi preciso a construção de uma fundamentação teórica
e a execução de experimentos, ambos apresentados no decorrer deste documento.
2. Antecedentes do tema
2.1. Conceitos e classificação das memórias
As memórias podem ser entendidas como representações cognitivas do passado, as quais se
estabelecem mediante modificações duradouras na comunicação neuronal, formando
engramas, as unidades físicas das memórias, também referidas como traços mnemônicos. Elas
16
têm uma natureza que depende do ato de lembrar, emergindo apenas quando evocadas, como
também têm a potencialidade para guiar comportamentos e pensamentos (Dudai, 2002a;
Hoediger III et al., 2007; Moscovitch, 2007). Ainda, uma vez que toda nossa experiência,
mesmo a introspectiva, tem-nas como origem ou, em última instância, afetam-nas, elas são
definidoras da percepção humana de existência e de identidade.
Essa explanação do que são memórias, ao ser abrangente e, ao mesmo tempo, resumida,
considera apenas o que há de comum entre elas, pontuando suas características centrais. As
memórias, entretanto, possuem particularidades suficientes para fazer com que elas sejam
reconhecidas como de diferentes tipos, bem como para fazer com que elas sejam
categorizadas em grupos distintos. A saber, as memórias podem ser diferenciadas e
categorizadas, por exemplo, segundo seu conteúdo, seu tempo de duração, bem como segundo
as circuitarias encefálicas envolvidas em seu processamento (Sweatt, 2010).
Com respeito ao conteúdo, as memórias podem ser explícitas/declarativas ou implícitas/não
declarativas (Tab. 1). As explícitas ou declarativas são aquelas disponíveis à recordação
consciente e possíveis de serem expressas por meio da fala ou acessadas por meio do
reconhecimento. Elas podem possuir cunho semântico – conhecimentos gerais e linguísticos –
ou cunho episódico – conteúdos informacionais autobiográficos, adquiridos por meio da
própria vivência, usados para, dentre outras finalidades, estabelecer a identidade e a história
pessoal, reconhecer estímulos, como lugares, pessoas e objetos, bem como para formar mapas
mentais que permitam a localização espacial. As implícitas ou não declarativas, por outro
lado, são aquelas impossíveis de serem demonstradas de forma linguística, descritiva ou por
meio do reconhecimento, sendo indisponíveis à contemplação consciente. Elas são
demonstradas através da performance do corpo e incluem os aprendizados motores,
operacionais, de reflexos, de hábitos e de respostas emocionais (Sweatt, 2010).
17
Características Subclassificação Características
Memórias explícitas
ou declarativas
Disponíveis a
contemplação
consciente, expressas
por meio da fala ou
acessadas por meio
do reconhecimento
Semânticas Conhecimentos
gerais e linguísticos
Episódicas
Conteúdo
autobiográfico usado
na formação da
identidade e no
reconhecimento de
estímulos
Memórias implícitas
ou não declarativas
Indisponíveis à
consciência e
responsáveis pelos
aprendizados
motores,
operacionais, de
reflexos, de hábitos e
de respostas
emocionais
Tab. 1. Classificação das memórias segundo seu conteúdo (Sweatt, 2010).
Acerca do tempo de duração, as memórias ainda podem ser de três tipos: sensoriais, de curta
duração (MCD) ou de longa duração (MLD) (Tab. 2). As sensoriais dizem respeito a uma
retenção transitória curtíssima, na ordem de segundos, do conteúdo sensorial captado pelos
órgãos dos sentidos após estes pararem de receber estímulos. As de curta duração persistem
por horas e têm como característica a manutenção de pouca informação e o esquecimento da
informação quando se encerra a atenção dada a ela. As de longa duração persistem por dias,
meses, anos ou por toda uma vida. Elas têm como característica a capacidade de armazenar
um grande volume de conteúdo e o aprendizado por meio do estabelecimento de associações
múltiplas entre informações recentes e antigas (Sweatt, 2010).
]
18
Durabilidade Características
Memórias sensoriais Curtíssima, segundos
Retenção do conteúdo
sensorial captado pelos
órgãos dossentidos após
estes pararem de receber
estímulos
Memórias de curta duração
(STM) Poucas horas
Retenção de pouca
informação, a qual pode ser
esquecida se a atenção a ela
for cessada
Memórias de longa duração
(MDL)
Dias, meses, anos ou por
toda uma vida
Retenção de grande
capacidade que resulta de
associações múltiplas entre
aprendizados recentes e
antigos
Tab. 2. Classificação das memórias segundo seu tempo de duração (Sweatt, 2010).
2.2. Substratos neurais
No tocante às circuitarias encefálicas, as memórias podem ser referidas quanto às estruturas
necessárias ao seu processamento. Portanto, fala-se em memórias hipocampo dependentes ou
estriado dependentes ou amígdala dependentes, entre outros exemplos, categorizando-as em
sistemas mnemônicos, os quais são criados para pormenorizar as circuitarias envolvidas no
processamento dos diferentes tipos de memória. Sabe-se, por exemplo, que o lobo temporal
medial é essencial para o processamento de memórias explícitas e que o estriado, cerebelo e
amígdala estão envolvidos no processamento de tipos específicos de memórias implícitas
(Sweatt, 2010).
O hipocampo, estrutura estudada neste trabalho de doutorado, é de interesse comum a muitos
estudiosos da memória. Esse interesse pode ser traçado desde o caso do paciente Henry
Molaison (Fig. 1), o qual ficou amplamente conhecido como caso H.M. Tudo teve início
quando Henry, aos 27 anos, passou por uma lobotomia bilateral do lobo medial temporal (Fig.
2), incluindo a retirada dos dois hipocampos, para tratar sua epilepsia altamente recorrente, a
19
qual era refratária à medicação e o impossibilitava de levar uma vida funcional. Essa cirurgia
pioneira, sugerida e executada pelo neurocirurgião William Scoville (Fig. 3), entretanto,
resultou em uma catástrofe para a vida de Henry. Após a intervenção cirúrgica, ele tornou-se
incapaz de formar novas memórias explícitas, condição conhecida como amnésia anterógrada.
Esse novo caso trouxe à tona a importância do hipocampo no processo de formação das
memórias (Scoville & Milner, 1957). Adicionalmente, Brenda Milner (Fig. 4), psicóloga que
ficou responsável por acompanhar o caso de Henry, descobriu por meio de experimentação
que ele ainda era capaz de formar memórias implícitas. Esse achado levou ao entendimento de
que existem diferentes sistemas neurais para o processamento das memórias (Scoville &
Milner, 1957). Hoje, sabe-se também que o hipocampo é necessário para o processamento das
memórias do tipo explícita (Debiec et al., 2002; Gonzalez et al., 2019; Radiske et al., 2017;
Rossato et al., 2007).
Fig 1. Henry Molaison, o paciente H.M. (Dossani et al., 2015). Henry na idade de 49 anos na cidade
de Hartford, Connecticut, Estados Unidos da América do Norte.
Fig. 2. Ressonância magnética do cérebro de Henry Molaison (Dossani et al., 2015). Feita no ano
de 1992 quando Henry tinha 66 anos, pode observar-se a lesão bilateral do lobo temporal medial.
20
Fig. 3. William Scoville (Dossani et al., 2015). Neurocirurgião que propôs e executou a lobotomia
bilateral do lobo temporal medial do paciente Henry Molaison.
Fig. 4. Brenda Milner (Dossani et al., 2015). Psicóloga que acompanhou Henry Molaison e estudou
sua condição de amnésia anterógrada.
O hipocampo, à primeira vista, é uma massa saliente de substância branca localizada no
interior do lobo medial temporal. Ao ser dissecado, entretanto, descobre-se que ele é
composto por uma circuitaria intrincada, com grupos neuronais projetando tanto para regiões
intra-hipocampais quanto para regiões externas (Fig. 5). A maior parte da entrada de
informações para o hipocampo se dá através do córtex entorrinal pela via perforante. No
interior do hipocampo, essas projeções direcionam-se para o giro denteado, que as projeta
para CA3 (Cornua Ammonis) que por sua vez, projeta para CA1 através da via colateral de
Schaffer. CA1 projeta para o subículo, o qual é a maior saída de informações do hipocampo
para regiões corticais. A maior interconexão entre o hipocampo e as regiões subcorticais, com
o hipotálamo, amígdala e núcleo accumbens, por exemplo, se dá via fórnix e fímbria (Dudai,
2002; Tannenholz, 2014).
21
Fig. 5. O hipocampo, adaptado de Dudai (2002). A) Esquema do hipocampo de coelho in situ e em
corte sagital. CA1 e CA3: células piramidais do hipocampo; GD, giro denteado; FM, via das fibras
musgosas; VP, via perfurante; SC, via colateral de Schaffer; Sub, subículo. B) Esquema da formação
hipocampal e de suas áreas corticais subjacentes em corte horizontal (à direita) e esquema do fluxo de
passagem da informação hipocampal (à esquerda). CE, córtex entorhinal; FF, fímbria-fórnix (medeia a
transferência de informação para as áreas subcorticais); Hip, hipocampo; COF, córtex orbito-frontal;
CPi, córtex piriforme; CPe, córtex perirrinal; GD, giro denteado.
Um crescente número de evidências sugerem que o sistema hipocampal é responsável por
processar a recordação e a percepção de familiaridade (Opitz, 2014; Smith & Bulkin, 2014).
A saber, a recordação diz respeito às informações contextuais das lembranças, incluindo
detalhes referentes às características de entes, de itens e do ambiente, como também de dados
acerca do que, como, quando e onde algo aconteceu. A familiaridade, por outro lado,
concerne à percepção que o indivíduo tem ao reencontrar com um estímulo (Opitz, 2014;
Smith & Bulkin, 2014).
2.3. Consolidação
A capacidade de armazenar informações na forma de memórias de longa duração (MLDs)
confere aos seres um meio para o aprendizado contínuo e a adaptabilidade constante,
habilidades necessárias à solução de tarefas do cotidiano e, consequentemente, à
sobrevivência (Epstein, 1993; Glenberg, 1997; Kang et al., 2008). Ao processo responsável
por essa capacidade de armazenar informações na forma de MLDs dá-se o nome de
consolidação.
22
A consolidação age sobre informações adquiridas de maneira a armazená-las em uma forma
duradoura, MLDs. Essa ação, contudo, não é instantânea, mas paulatina. Ela requer algumas
horas para ser concluída, quando, por fim, as informações adquiridas são estabilizadas
(McGaugh, 1966). O processo de estabilização das MLDs requer necessariamente a síntese de
proteínas e a expressão de genes por parte de estruturas encefálicas envolvidas no
processamento das informações a serem consolidadas, como o hipocampo e o córtex
pré-frontal, no caso de memórias do tipo semântica ou do tipo episódica (Gonzalez et al.,
2013; Leon et al., 2010), ou como o estriado e o córtex motor, no caso de memórias
musculares, procedurais ou de hábitos (LeDoux, 2007; McGaugh, 2000). Essas etapas
bioquímicas de síntese proteica e expressão gênica são indispensáveis para o estabelecimento
dos engramas, os quais são requisitados durante o ato de lembrar (Asok et al., 2019;
Burnham, 2013; Davis & Squire, 1984; Dudai, 2004; Ortega-de San Luis & Ryan, 2022).
O processo consolidatório não é possível de ser observado diretamente, senão inferido ao ser
impedido por meio de intervenções (LeDoux, 2007). Essas intervenções são de ocorrência
experimental e foram, inicialmente, físicas, por meio de concussões ou choques
eletroconvulsivos, mas, atualmente, são moleculares, feitas com uso de inibidores de síntese
proteica, inibidores de expressão gênica, inibidores de cinases, entre outros (Davis & Squire,
1984; McGauch, 2000). A aplicação dessas intervenções após o período de aprendizado,
muitas vezes não afeta o estabelecimento de memórias de curta duração, mas impede com que
elas sejam posteriormente estabilizadas na forma de memórias de longa duração, achado que
evidencia a existência fisiológica do processo consolidatório.
Além da importância da síntese de proteínas e da expressão gênica no processo de
consolidação das memórias, estudos demonstram que mudanças duradouras nos receptores de
glutamato e a atividade de proteínas cinases são fundamentais para que as informações
adquiridas possam ser armazenadas em MLDs (Katche et al., 2013). Diante desses
23conhecimentos, é certo que ainda muitas moléculas e cascatas neuroquímicas precisam ser
estudadas na busca pelo melhor entendimento do processo consolidatório.
2.4. Reconsolidação
Por muito tempo, pensou-se que a ocorrência do processo consolidatório resultava na
formação de memórias permanentes e imutáveis (Kandel, 2001; McGauch, 1966, 2000;
McGauch & Dawson, 1969). Hoje, no entanto, sabe-se que memórias consolidadas podem ser
desestabilizadas durante o momento em que são evocadas, período em que podem ser
alteradas e tornam-se susceptíveis à ação de intervenções, portanto, para persistirem, precisam
passar por um novo processo dependente de síntese proteica e expressão gênica, semelhante
àquele observado durante a consolidação, no entanto diverso, conhecido como reconsolidação
(Lee et al., 2004; Misanin et al., 1968; Nader, 2015; Nader et al., 2000, 2004; Nader & Hardt,
2009; Sara, 2000; Sara & Deweer, et al., 1980).
O fato de as memórias não serem necessariamente permanentes e imutáveis, como se pensava,
possibilita novas formas de entendimento acerca de sua natureza. A proposta de Lewis (1979)
de que as memórias transitam entre um estado ativo, antes de serem consolidadas ou quando
são evocadas, e um estado inativo, após serem consolidadas ou quando não estão em uso, tem
sido adotada atualmente entre os estudiosos e estudiosas da reconsolidação. Justifica-se o uso
dessas terminologias por melhor se adequarem aos achados mais atuais que demonstram que
as memórias, depois de consolidadas, podem se tornar novamente suscetíveis à ação de
agentes moduladores, incluindo amnésicos (Misanin et al., 1968; Nader et al., 2000). Assim,
convencionou-se dizer que as memórias podem ser reativadas ao serem evocadas, bem como
dizer que elas retornam ao estado inativo após serem restabilizadas por meio do processo
reconsolidatório.
O estudo da reconsolidação reforça a proposta de que a memória é um processo dinâmico e
que novas memórias são formadas com base em informações já consolidadas. A evocação
pode iniciar um período no qual os conteúdos informacionais mnemônicos podem ser
24
atualizados. Logo, do ponto de vista neurobiológico, compreende-se que a memória tem uma
natureza dinâmica, o que confere ao sistema nervoso central uma propriedade adaptativa
(Gonzalez et al., 2021; Sara, 2000).
A reconsolidação consiste de dois processos dissociáveis, a desestabilização e a
restabilização. A desestabilização se refere ao processo iniciado pela reativação da memória,
no qual o traço mnemônico original torna-se novamente lábil e, portanto, sensível à ação de
agentes amnésicos. Esse estado de maleabilidade da memória permite com que ela possa ser
modificada por intervenções farmacológicas e/ou comportamentais. Para retornar ao estado
estável e persistente, a memória desestabilizada deve passar por um processo de restabilização
dependente de expressão gênica e síntese proteica por parte das estruturas envolvidas em seu
processamento. (Fig. 6 - Ben Mamou et al., 2006; Ferrer Monti et al., 2016; ; Milton et al.,
2013; Radiske et al., 2021).
Fig. 6. Modelo da reconsolidação da memória de reconhecimento de objetos, adaptado de
Gonzalez et al (2019). Após o aprendizado, as memórias são gradualmente estabilizadas através da
consolidação. Memórias consolidadas são ativadas durante a evocação e, dependendo das condições
(p. ex. percepção de novidade), podem ser desestabilizadas, o que permite que possam ser
modificadas. Para persistirem, essas memórias precisam ser restabilizadas através da reconsolidação.
Embora o processo de desestabilização tenha início com a evocação das memórias, ele não
ocorre sempre que uma memória é evocada. Estudos apontam que é preciso o atendimento de
determinadas circunstâncias para que ele seja deflagrado. A idade e a força da memória no
25
momento em que são evocadas podem, por exemplo, ser características decisivas para definir
se uma memória pode ser desestabilizada ou não (Kida, 2020; Winters et al., 2009). Além
disso, a necessidade de incorporar novas informações à memória evocada pode também ser
decisiva (Gonzalez et al., 2019; Kida, 2020; Rossato et al., 2007; 2015; Winters et al., 2009).
A restabilização, assim como a consolidação, configura-se em um processo que só pode ser
inferido a partir de sua interrupção ou melhoramento, o que pode ser feito por meio do uso de
agentes amnésicos ou pró-mnésicos, respectivamente (Nader, 2015).
O estudo dos mecanismos moleculares da reconsolidação demonstram que a atualização das
memórias acontece mediante a atividade e a regulação do tráfego dos receptores de glutamato,
mediante a atividade dos receptores de dopamina e das proteínas cinases, além de síntese de
proteínas e de expressão gênica (Bellfy & Kwapis, 2020). Entretanto, muito do que se sabe
sobre esse processo mnemônico foi fundamentado em pesquisas utilizando tarefas
comportamentais baseadas em memórias motivadas por medo, explorando muito menos
outros tipos de memória.
2.5. Memórias de reconhecimento
A memória de reconhecimento (MR) é um componente central das memórias declarativas. Ela
possibilita a discriminação de características, elementos, situações e entes conhecidos ou
desconhecidos, uma capacidade obviamente significativa no que diz respeito à sobrevivência
(Wan et al., 1999). De fato, o declínio no processamento desse tipo de memória é comum na
senescência e é um dos principais sintomas incapacitantes da doença de Alzheimer (O’Bryant
et al., 2009; Walf, 2018).
Um importante paradigma comportamental para o estudo da memória de reconhecimento em
roedores é a tarefa de reconhecimento do objeto novo (TRON). A TRON é baseada na
tendência natural dos animais em explorar por mais tempo objetos desconhecidos quando
apresentados simultaneamente a um familiar (Antunes & Biala, 2012). Algumas das
26
principais vantagens dessa tarefa residem no fato de que os animais não necessitam de reforço
positivo ou negativo para desempenhá-la (Berlyne, 1950; Ennaceur, 2010; Ennaceur &
Delacour, 1988; Ennaceur et al., 2009).
Experimentos comportamentais envolvendo o treino de roedores na TRON indicam que,
assim como ocorre com os humanos, a integridade funcional dos lobos temporal e frontal é
essencial para codificar, armazenar e expressar as memórias de reconhecimento (Antunes &
Biala, 2012; Baxter, 2010; Broadbent et al., 2009; Clark et al., 2000; Cruz-Sanchez et al.,
2021; Goulart et al., 2010; Grayson et al., 2015; Hammond et al., 2004; Kenser & Holbrook,
1987; Mitchell e Laiacona, 1998; Kesner e Hopkin, 1994; Reger et al., 2009; Riesenhuber &
Poggio, 2002). Em particular, estudos farmacológicos e neuroanatômicos têm elucidado que o
hipocampo é necessário para a aquisição e armazenamento desse tipo de memória mediante o
processamento da ordem temporal e dos detalhes contextuais das experiências passadas
(Balderas et al., 2008; Smith & Bulkin, 2014; Fuhs & Touretzky, 2007).
Ademais, os estudos têm demonstrado que a reativação de uma memória de reconhecimento
de objetos (MRO), que ocorre com a apresentação concomitante de um objeto novo
juntamente com o familiar, inicia um processo reconsolidatório dependente de síntese proteica
hipocampal e que integra a memória do novo objeto ao engrama da memória reativada
(Gonzalez et al., 2021; Rossato et al., 2007; Winters et al., 2010).
Nosso grupo de pesquisa tem acumulado conhecimento acerca da participação do hipocampo
no processamento da MRO (Gonzalez et al., 2019, 2021, 2022; Radiske et al., 2017; Rossato
et al., 2007, 2013, 2019, 2022, 2023; De Jaeger et al., 2013; Clarke et al., 2008). A respeito
disso, reportou-se que a sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro
(BDNF), um importante agente na formação de novas conexões sinápticas (Baltaci et al.,
2019; Begni et al., 2017; Kandel et al., 2014; Radiske et al., 2015) é essencial tanto para a
consolidação como para a reconsolidação da MRO (Furini et al., 2010; Radiske et al., 2017),
enquantoque a sinalização via PKMzeta é fundamental para a reconsolidação (Bernabo et al.,
27
2021; da Silva et al., 2020; Rossato et al., 2019). Reportou-se também que Zif268
hipocampal, um fator de transcrição expresso em resposta à atividade dos receptores NMDA
(NMDAr) na indução da LTP (do inglês, long term potentiation) e comumente relacionado
aos processos cognitivos, é necessário para atualizar as MRO, mas não para evocá-las ou
preservá-las (Gonzalez et al., 2019) e que receptores dopaminérgicos D1/D5 controlam a
atualização da MRO através de incorporação da nova informação ao traço reativado
(Gonzalez et al., 2021; Rossato et al., 2015). Apesar destes antecedentes, vias de sinalização
mediadas por cinases fundamentais no processamento cognitivo, ainda não é claro.
2.6. Atividade oscilatória neuronal
A memória, além de ser estudada a nível molecular e neuronal ou por casos clínicos, é
também estudada por meio da atividade oscilatória das circuitarias neurais. A atividade
oscilatória é um fenômeno intrínseco do sistema nervoso e concerne ao estabelecimento de
padrões rítmicos e sincrônicos de fluxo de corrente observado entre neurônios, grupos de
neurônios ou regiões cerebrais de uma dada rede neural. Esses padrões podem ser captados
por meio de eletrodos e determinados quanto às suas características de frequência, amplitude
e fase (Buzsák, 2002; Buzsák & Wang, 2012).
Os padrões de oscilação são resultantes da cooperação de neurônios individuais integrantes de
uma rede neural. As oscilações podem se encontrar em diferentes faixas de frequência e estar
associadas a diferentes tipos de comportamentos e processos biológicos. Foram encontradas
no sistema nervoso a existência das faixas oscilatórias delta (1-4 hertz), teta (4-8 hertz), alfa
(8-12 hertz), beta (13-30 hertz), e gama (30-70 hertz ou 70-150 hertz - Fig. 7), as quais ainda
não se atribuiu conclusivamente um papel fisiológico. A respeito destas possíveis funções,
foram encontradas correlações, por exemplo, entre a banda delta e o sono profundo, entre a
banda teta e o aprendizado e a atividade locomotora, entre a banda alfa e o relaxamento
muscular e a vigília, entre a banda beta e o estado de alerta e concentração, entre a banda
gama e a percepção e aprendizado (Buzsák, 2015; Engel & Fries, 2010; Roopun et al., 2008).
28
Fig. 7. Exemplos de padrões oscilatórios encefálicos, adaptado de Abhang (2016).
O hipocampo demonstra padrões oscilatórios proeminentes nas faixas de frequência teta e
gama, as quais acoplam-se e juntas parecem desempenhar papel importante no processamento
das memórias (Buzsák, 2002; Jensen e Colgin, 2007; Lisman e Jensen, 2013). Nosso grupo
demonstrou que é deflagrado um acoplamento de fase teta-gama hipocampal no hipocampo
de ratos machos adultos quando a memória de reconhecimento de objetos é evocada na
presença de um objeto novo, mas não na presença de um objeto familiar ou quando a
desestabilização da memória é impedida por meio do bloqueio dos receptores dopaminérgicos
D1/D2 (Gonzalez et al., 2022). Ademais, nesse mesmo trabalho, os autores demonstraram que
a indução artificial do acoplamento das bandas teta e gama no hipocampo é suficiente para dar
início ao processo de desestabilização (Gonzalez et al., 2022).
2.7. CaMKII
Algumas moléculas envolvidas no processamento mnemônico são reguladas pelos níveis
intracelulares dos íons Ca2+ (Davis & Bauer, 2012; Power e Sah, 2005). A proteína cinase
dependente de cálcio e calmodulina, CaMKII, é uma dessas moléculas, está principalmente
expressa no cérebro e particularmente enriquecida no hipocampo (Erondu e Kennedy, 1985;
29
Hernández et al., 2013; Hudmon & Schulman, 2002), tem capacidade autofosforilante e
desempenha importante papel no aprendizado (Cammarota et al., 1998; Coultrap e Bayer,
2012; Elgersma, et al., 2004; Giese e Mizuno, 2013; Irvine et al., 2011; Lisman et al., 2002;
Lucchesi et al., 2011; Yasuda e Mayford, 2006) e na LTP, mecanismo sináptico comumente
associado à formação e à persistência das MLDs (Morgan et al., 2010; Nicoll, 2017; Sacktor e
Fenton, 2018).
A CaMKII é uma holoenzima composta por 12 subunidades proteicas de 56-60 Kda
distribuídas em dois anéis contendo 6 subunidades cada (Fig 8B - GAERTNER et al, 2004).
Essas subunidades são compostas por: um domínio catalítico amino terminal, um domínio
regulatório contendo uma região autoinibitória e um sítio de ligação para o complexo
Ca2+/calmodulina (CaM), uma sequência variável e, na porção carboxiterminal, um domínio
associativo, que serve para a ligação entre as diferentes subunidades (Fig. 8A - Coultrap &
Bayer, 2012; Schulman et al., 1995).
A entrada de cálcio no meio intracelular, via NMDAr, desencadeia a formação do complexo
CaM, o qual se liga ao domínio regulatório da CaMKII e gera nessa cinase uma mudança
conformacional. Essa mudança, por sua vez, permite à CaMKII não apenas fosforilar seus
substratos como também autofosforilar uma de suas subunidades internas, na treonina 286 na
isoforma alfa ou na treonina 287 nas isoformas beta e gama (Fig. 8B). A autofosforilação
dessas subunidades impede a CaMKII de voltar a sua forma inativa e reduz a dissociação da
calmodulina, o que faz com que permaneça ativa mesmo após a redução dos níveis
intracelulares de Ca2+. Dessa maneira, a CaMKII desenvolve uma atividade parcialmente
autônoma e independente de Ca2+ (Hanson et al., 1989, 1994; Hudmon e Schulman, 2002), a
qual pode persistir mesmo após a degradação ou a desfosforilação de suas subunidades, uma
vez que essas subunidades podem ser refosforiladas por subunidades vizinhas (Fig. 7C -
Irvine et al., 2011; Lisman et al., 2002).
30
Fig. 8. Diagrama da estrutura e do mecanismo de ativação da CaMKII, adaptado de Zhang et al
(2021). A) A estrutura da CaMKII é formada por (1) um domínio catalítico N-terminal, (2) um
domínio regulatório que contém uma região autoinibitória, um sítio de ligação para o complexo
Ca2+/CaM e sítios de modificações pós-traducionais, incluindo a treonina 286 e 287, e (3) um
domínio associativo C-terminal que intermedia a conexão entre as subunidades e contém uma região
variável que difere entre os diferentes subtipos de CaMKII. B) Esquema da estrutura multimérica da
CaMKII. C) Mecanismo de ativação do monômero da CaMKII pela ligação do complexo Ca2+/CaM e
autofosforilação da treonina 286.
A CaMKII é translocada para o terminal sináptico ao ser ativada (Bayer et al., 2001, 2006;
Hudmon et al., 2005; Lee et al., 2009; Otmakhov et al., 2004; Shen et al., 2000; Shen &
Meyer, 1999; Zhang et al., 2008), onde se liga a densidade pós-sináptica (PSD - do inglês,
post-synaptic density) (Dosemeci et al., 2001; Otmakhov et al., 2004; Strack et al., 1997).
Uma das interações que a CaMKII faz na PSD é com os receptores NMDARs (Bayer et al.,
2001; Leonard et al., 1999, 2002; Strack et al., 2000; Strack e Colbran, 1998), podendo
formar um complexo CaMKII/NMDAR, o qual ocorre em condições basais, mas que aumenta
durante a indução da LTP (Leonard et al., 1999).
2.8. NMDAr
Os NMDAr são canais iônicos permeáveis ao íon Ca2+ ativados pelo neurotransmissor
glutamato e pelo aminoácido glicina. Eles encontram-se bloqueados pelo íon Mg2+ nas
condições basais, mas uma despolarização inicial é capaz de desbloqueá-los. Assim, a
permeabilidade desse receptor depende tanto da ativação pelo glutamato e pela glicina como
31
da saída do Mg2+, característica que faz com que esse receptor seja chamado de detector de
coincidência. Sua atividade controla a expressão de BDNF e Zif2638 (Caldeira et al., 2007;
Farina & Commins, 2016) bem como controla a síntese hipocampal de proteínas
(Charriaut-Marlangue et al., 1994; Conde-Dusman et al., 2021). Experimentos têm
demonstrado que o papel desse receptor é essencial para o aprendizado e processamento
mnemônico (Li & Tsien, 2009).
Os NMDAr são diversos no que diz respeito a suas subunidades formadoras (Paoletti et al.,
2013). A saber, sete diferentes subunidades desse receptorforam descritas: GluN1; quatro
GluN2 (GluN2A, GluN2B, GluN2C e GluN2D) e duas GluN3 (GluN3A e GluN3B)
(Cull-Candy e Leszkiewicz, 2004; Paoletti et al., 2013; Paoletti, 2011; Traynelis et al., 2010),
as quais apresentam diferenças em sensibilidade e em afinidade ao glutamato. Eles são
receptores heterotetrâmicos compostos obrigatoriamente por uma associação entre duas
subunidades GluN1 e duas subunidades GluN2 ou GluN3 (Fig. 9 - Dingledine et al., 1999).
As diferentes associações dessas subunidades formam os diferentes subtipos de NMDAr.
Esses podem diferir em permeabilidade e tempo de abertura, bem como ligam-se a diferentes
proteínas da PSD e ativam cascatas intracelulares distintas (Ivanov et al., 2006; Kim et al.,
2005; Zhang et al., 2008). Nesse sentido, experimentos demonstram que os NMDAr contendo
GluN2A (NMDAr-GluN2A) têm uma maior probabilidade de abertura do canal, mas
permanecem abertos por menos tempo do que os NMDAr contendo GluN2B
(NMDAr-GluN2B - Hansen et al., 2018; Paoletti et al., 2013; Wyllie et al., 2013; Vieira et al.,
2020). Esses dois subtipos de receptor NMDA são os mais encontrados no córtex e no
hipocampo (Lee et al., 2014; Sun et al., 2018, Traynelis et al., 2010).
32
Fig. 9. O Receptor NMDA. Esquematização de um receptor NMDA do tipo GluN1/GluN2, com suas
características funcionais.
Evidências sugerem que as diferentes subunidades dos NMDAr podem ter papéis distintos
nos processos de aprendizado e de memória (Bevilaqua et al., 2005; Fox et al., 2006; Migues
et al., 2019; Santini et al., 2001; Yang et al., 2022). A ativação dos NMDAr pode em alguns
casos induzir LTP, mas em outros induzir depressão de longa duração (LTD - do inglês long
term depression) e isso se deve a suas distintas composições. A esse respeito, existem estudos
que demonstram um papel dissociável entre os NMDAr-GluN2A e os NMDAr-GluN2B, com
os primeiros promovendo a LTP e os últimos a LTD (Dalton et al., 2012; Liu et al., 2004).
Existem estudos que apontam para um papel duplo dos NMDAr-GluN2A e dos
NMDAr-GluN2B, ambos agindo tanto na promoção da LTP quanto na promoção da LTD
(Fox et al., 2006; Shipton & Paulsen, 2013).
As subunidades GluN2A e GluN2B são marcadamente diferentes em seus domínios
C-terminais intracelulares, o que resulta em afinidades distintas às moléculas sinalizadoras
presentes no citosol (Ryan et al, 2008). Relativo a isso, sabe-se que a CaMKII compete com a
proteína 95 da densidade pós-sináptica (PSD-95) pelo sítio de ligação C-terminal das
subunidades GluN2A e GluN2B (Gardoni et al., 2001). A ligação CaMKII/GluN2B tem
maior afinidade do que a ligação CaMKII/GluN2A e forma um complexo CaMKII/GluN2B
que mantém a CaMKII em uma conformação ativa, que pode ser necessário para a
consolidação das memórias (Bayer et al., 2001; Halt et al., 2012). O complexo
33
CaMKII/NMDA aumenta a atividade da CaMKII por facilitar sua autofosforilação no sítio
T286/T287 e por inibir sua desfosforilação (Lisman & Raghavachari, 2015).
2.9. Atividade da CaMKII e dos NMDAr na consolidação e reconsolidação
Numerosos estudos têm demonstrado que a ativação da CaMKII desempenha um papel
central no processamento da consolidação e da reconsolidação das memórias aversivas e de
medo condicionado (Cao et al., 2008; Jarome et al., 2016; Lisman et al., 2002; Vigil & Giese,
2018; Zalcman et al., 2018). Achados recentes apontam para uma relação CaMKII/GluN2B
NMDA que parece desempenhar importante papel na desestabilização desses tipos de
memória por meio de um mecanismo que envolve degradação proteica via sistema
ubiquitina-proteassoma (Bingol et al., 2010; Crestani et al., 2015; Lee et al., 2008; Ferrer
Monti et al., 2016; Jarome et al., 2016; Mamou et al., 2006; Milton et al., 2013; Wang et al.,
2009). Com respeito a esses achados, foi demonstrado que o uso de inibidores da CaMKII ou
de antagonistas dos GluN2B no momento da reativação desses tipos de memória é capaz de
impedir a amnésia causada pela administração de inibidores de síntese proteica (Crestani et
al., 2015; Jarome et al., 2016; Milton et al., 2013; Monti et al., 2016). Adicionalmente, o fato
de a CaMKII ser ativada pelo influxo de Ca2+ sugere uma possível interação entre a atividade
dos GluN2B na indução da desestabilização por meio da promoção de degradação proteica
(Ferrara et al., 2019; Hong et al., 2013; Torquantto et al., 2018).
Apesar destes antecedentes, o estudo do papel da CaMKII na consolidação e na
reconsolidação das MRO permanece inconclusivo. Mais ainda, o conhecimento acumulado
sobre quais são os sistemas de neurotransmissores e neuromoduladores que controlam a
ativação da CaMKII ou que são controlados por ela durante a consolidação e a reconsolidação
da MRO ainda é escasso. Tampouco se sabe muito sobre quais eventos bioquímicos regulados
por ela são capazes de determinar o destino da memória após sua reativação.
Diante do exposto, estudar a regulação dos processos de consolidação e reconsolidação da
MRO promovidos pela atividade da CaMKII é de extrema importância para o melhor
34
entendimento dos processos fisiológicos e, logo, para a melhor compreensão de como as
desordens psíquicas associadas ao deterioro cognitivo se desenvolvem.
35
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Estudar o papel da CaMKII hipocampal no processamento da memória de reconhecimento de
objetos.
3.2. Objetivos específicos
1. Estudar o papel da CaMKII hipocampal na consolidação da MRO, avaliando diferenças e
semelhanças no processamento cognitivo de machos e fêmeas.
2. Examinar o papel da CaMKII hipocampal no ciclo noturno.
3. Avaliar se inibição da CaMKII afeta aprendizados passados ou futuros.
4. Investigar a participação da CaMKII hipocampal no processo de reconsolidação da MRO,
avaliando as distintas etapas: desestabilização e restabilização.
5. Analisar o papel da CaMKII hipocampal no perfil elétrico hipocampal durante a
desestabilização e restabilização da MRO.
36
4. Metodologia
4.1 Animais experimentais
Utilizamos ratos Wistar machos adultos (3 a 3,5 meses de idade pesando 300 - 350 g) e ratas
Wistar fêmeas adultas (3 a 3,5 meses de idade pesando entre 230 - 260 g). Os animais foram
obtidos do Biotério do Instituto do Cérebro – UFRN e mantidos em caixas moradias, cinco
animais por caixa, em ambiente climatizado (temperatura 21-23°C) submetidos a um ciclo
claro escuro de 12 h e com água e comida ad libitum. Os animais foram tratados conforme a
Lei número 6638 de 8/5/79, que regulamenta o uso dos animais para a prática
didático-científica. O protocolo experimental foi desenvolvido de acordo com as diretrizes da
Lei AROUCA (Lei número 11.794, de 08 de 10 de 2008), que estabelece procedimentos para
uso científico de animais. Projeto aprovado pela CEUA – UFRN, número 242.006/2021.
4.2 Cálculo amostral
Para o cálculo do tamanho da amostra, consideramos estudos prévios que utilizaram
metodologia semelhante (Clarke, et al., 2010, Rossato, et al., 2007, Rossato, et al., 2019).
4.3 Implantes de cânulas
Os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implante de cânulas na região CA1
do hipocampo dorsal. Para tanto, os animais foram anestesiados com quetamina (80 mg/kg) e
xilazina (10 mg/kg) e depois implantados bilateralmente com cânulas guia de 0,2 mm de
calibre direcionadas a região CA1 do hipocampo dorsal (coordenadas estereotáxicas, em mm:
AP -4.2; ML ±3.0; DV -3.0, para machos e: AP -3.8; ML ±2.0; DV -2.0, para fêmeas). Após
a cirurgia, os animais receberam meloxicam (0.2 mg/kg) como analgésico, permanecendo em
recuperação por 7 dias até o início dos experimentos.
4.4. Implantes de eletrodos
Ratos machos foram implantados com um conjunto de eletrodos no hipocampo dorsal (AP
-3.6; ML +2.4; DV -3.6). As coordenadas seguiram Paxinos e Watson (2006). Foram 16
37
eletrodos de tungstênio (50 μm; A-M Mycrosystems) organizados em duas fileiras espaçadas
por 250 μm. O aterramento foi feito com parafusos colocados no osso parietal. Meloxicam
(0.2 mg/kg) foiadministrado subcutaneamente ao final da cirurgia para ação analgésica. Os
ratos implantados com os eletrodos foram mantidos individualmente nas gaiolas e passaram
por um período de recuperação de no mínimo 7 dias. Durante esse período os animais foram
manuseados diariamente por 1-2 minutos.
4.5. Análises eletrofisiológicas
O potencial de campo local (LFP) foi gravado usando um sistema de processamento de sinal
neural (Blackrock Microsystems). Os sinais foram amplificados, digitalizados, filtrados em
ponto de corte de frequências de 0.3 e 250 Hz, e testados a 1 KHz. Os dados foram analisados
off-line usando o programa (Signal Processing Toolbox) e rotinas customizadas no Matlab
(RRID:SCR_001622). Para avaliar a atividade oscilatória hipocampal durante o período de
exploração dos objetos, LFPs (do inglês local field potential) foram continuamente gravados
durante todo o tempo das sessões de treino e teste na TRON. Câmeras fixadas acima das
arenas foram usadas para acompanhar os trajetos dos animais. Os vídeos foram gravados em
30 frames/s. A exploração ativa foi considerada quando os animais cheiraram ou tocaram os
objetos estímulo com o focinho ou patas e foi computada usando o software ObjectScan
System (CleverSys).
4.6. Fármacos
Os fármacos utilizados foram administrados no volume de 1 μL/lado. As doses utilizadas
foram as seguintes:
● ANI (anisomicina, inibidor de síntese proteica; 160 μg/μl);
● AIP (peptídeo inibitório da CaMKII; 5 nmol);
● AIP sc (peptídeo scrambled; 5 nmol);
● TCN-201 (antagonista Glu2NA dos receptores NMDA; 0,05 μg/μl);
38
● KN-93 (methoxybenzenesulfonamide inibitória da CaMKII; 10 nmol);
● KN-92 (Derivado inativo de KN-93 usado como controle; 10 nmol).
Todas as doses das drogas utilizadas foram baseadas em estudos prévios e/ou pilotos do
laboratório (Gonzalez et al., 2019, 2021, 2022; Radiske et al., 2021; Rossato et al., 2007,
2019, 2023).
4.7. Paradigma de reconhecimento de objetos
Quando roedores são apresentados a um objeto familiar e a um desconhecido, eles despendem
mais tempo explorando o objetivo desconhecido. Este comportamento típico tem sido
utilizado no desenho de um paradigma comportamental conhecido como tarefa de
reconhecimento do objeto novo (TRON) (Antunes & Biala, 2012), o qual vem sendo
amplamente utilizado para avaliar os mecanismos envolvidos na formação de memórias
declarativas (Moses, et al., 2005, Reed & Squire, 1997). O aparato para estudar o
reconhecimento de objetos consiste de um campo aberto retangular (60 cm2) localizado em
uma sala com baixa luminosidade e isolamento acústico. Os objetos-estímulo utilizados na
tarefa possuem igual significância comportamental para os animais experimentais. Durante a
tarefa comportamental, analisamos a exploração dos objetos pelos animais. A contagem da
exploração é feita quando os animais cheiram ou tocam os objetos-estímulo com o focinho ou
patas dianteiras, o que é computado através da ferramenta computacional TopScan Lite. Os
vídeos gravados podem ser analisados posteriormente para outras medidas comportamentais.
Antes de serem submetidos ao protocolo experimental, os animais são habituados ao aparato
comportamental. A habituação consiste em expor os animais ao campo aberto por vinte
minutos durante quatro dias, onde os animais são colocados individualmente no aparato para
que possam explorar livremente.
Após o término da habituação os animais são submetidos ao protocolo experimental que varia
de acordo com o que está sendo avaliado. O treino na tarefa de reconhecimento de objeto
novo (TRON) consiste em expor os animais ao aparato comportamental na presença de dois
39
objetos diferentes (objetos A e B) mas igualmente significantes. No dia seguinte, na sessão de
reativação, os animais são reexpostos ao aparato na presença de um dos objetos apresentados
na sessão de treino (objeto familiar A ou B) e um objeto desconhecido (objeto C). A retenção
da MRO é avaliada em um teste realizado 1 ou 7 dias mais tarde, onde os animais são
reexpostos ao aparato na presença do objeto familiar apresentado durante a sessão de treino e
reativação e um novo objeto desconhecido (objeto D). Durante todas as sessões os animais
podem explorar livremente o aparato comportamental e os objetos por cinco minutos (Fig.
12).
Fig. 10. Protocolo experimental da tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON). Dia 1:
Treino com dois objetos diferentes; Dia 2: Reativação com um objeto familiar e um novo; Dia 3:
Teste.
Figura 11. Objetos estímulos da tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON). Exemplo de
objetos estímulos utilizados para a realização dos experimentos farmacológicos/comportamentais na
TRO.
Figura 12. Aparato da tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON). Na imagem capturada
do experimento em execução vê-se o rato explorando um dos objetos estímulo.
40
4.8. Tarefas comportamentais complementares
Utilizamos como tarefa complementar a tarefa da esquiva inibitória (TEI). A TEI foi utilizada
para avaliar a funcionalidade hipocampal dos animais submetidos previamente à TRO.
Resumidamente, na TEI os animais passam por uma sessão de treino e uma sessão de teste 24
horas depois. O aparato da TEI é uma caixa retangular (50 x 25 x 25) contendo uma
plataforma em uma das extremidades e um chão de barras metálicas ligadas à corrente
elétrica. Na sessão de treino os animais são colocados sobre a plataforma e têm a latência de
descida para a grade cronometrada; ao descerem, com as quatro patas na grade metálica,
recebem um choque (0.4 mA por 2 s). Na sessão de teste a latência de descida para a grade é
novamente mensurada, servindo de medida para o estudo da memória de medo, nesta sessão
os animais não recebem choque.
4.9. Histologia
Para a verificação do posicionamento das cânulas, os animais receberam logo após os
procedimentos comportamentais, 1 μl de uma solução de azul de metileno 0,1% através das
mesmas cânulas utilizadas para a aplicação das drogas. Quinze minutos após a infusão, os
animais foram eutanasiados por decapitação e seus encéfalos removidos e colocados em uma
solução de formol 4% por um período de 4 a 7 dias, e, então, foram realizadas as análises
histológicas através da análise de cortes coronais da região correspondente ao hipocampo
dorsal (Radiske et al., 2017). Os animais que apresentaram coloração por azul de metileno
fora de um volume de 2 mm3 da região de interesse foram excluídos da análise estatística.
4.10. Análise estatística dos dados
A análise estatística dos resultados foi feita concomitante à execução dos experimentos
comportamentais e farmacológicos através programa computacional GraphPad Prism. Para
comparações cuja distribuição de dados obedece uma distribuição normal foram empregados
o teste-t para amostra única (valor fixo=0 para o ID) para avaliar aprendizado e teste-t de
Student para comparação entre dois grupos. Para comparações entre três ou mais grupos, foi
41
empregada ANOVA de uma ou duas vias seguida de teste de Bonferroni. O nível de
significância adotado é de 5%. O tamanho de amostra foi de 10-12 animais por grupo,
permitindo a detecção de uma diferença de magnitude relevante nos testes comportamentais.
42
5. Resultados
5.1. Consolidação
Para avaliar o possível envolvimento da CaMKII hipocampal na consolidação da MRO em
detalhes implantamos cânulas de infusão na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos Wistar
machos adultos e os treinamos na tarefa de reconhecimento de objeto novo (TRON) com dois
objetos distintos (objs A e B). Cinco minutos ou 3 h após o treinamento os animais receberam
injeções bilaterais (1 µl) de veículo (VEH; 0,1% de DMSO em solução salina estéril) ou do
inibidor de CaMKII permeável às células, o peptídeo inibidor relacionado ao autocamtide-2
miristoilado (AIP; 5 nmol/µl). A retenção da memória de longo prazo (MLP) foi avaliada 24 h
depois do treino onde os animais foram reexpostos ao objeto familiar A juntamente com o
objeto novo C (Fig 13A).
Os animaisque receberam VEH discriminaram o objeto novo C do objeto familiar A durante
a sessão de teste, não obstante do tempo decorrido entre o treinamento e a infusão. Em
contraste, os animais que receberam AIP 5 minutos após o treinamento, mas não 3 horas
depois, foram incapazes de discriminar entre os objetos A e C (Fig 13B; F(1,38) = 4.587,
p=0.0387 para tempo de infusão; F(1,38) = 5.762, p=0.0214 para tratamento e F(1,38) =
13.12; p=0.0009 para interação em uma ANOVA de duas vias; p<0.001 para AIP 5min vs
VEH 5min, p<0.05 para AIP 5min vs VEH 3h e p<0.01 para AIP 5min vs AIP 3h no teste de
Bonferroni de comparações múltiplas). O AIP não teve efeito no tempo total de exploração
(Fig. 13C), distância total percorrida (Fig. 13D) ou no número total de eventos de exploração
durante a sessão de teste (Fig. 13E).
43
Fig. 13. A inibição da CaMKII imediatamente após o treino impede a formação da memória de
reconhecimento de objetos de longa duração. A) Protocolo experimental. Ratos foram treinados na
TRON, usando dois objetos diferentes (A e B) e imediatamente ou 3 horas depois receberam infusões
bilaterais intra-CA1 (1 μl/lado) de VEH ou AIP (5 nmol/lado). Um dia mais tarde os animais foram
testados na presença de um objeto familiar (A) e um objeto desconhecido (C). B) Índice de
discriminação dos grupos VEH ou AIP durante o teste. C) Tempo total de exploração (s) dos objetos
durante a sessão de teste. D) Painéis superiores: trajetórias representativas de exploração durante o
teste para os grupos VEH e AIP; Painel inferior: Distância total percorrida (m) pelos animais durante a
sessão de teste. E) Eventos totais de exploração durante a sessão de teste. Os dados (média ± SEM)
estão apresentados como índice de discriminação, tempo de exploração, distância percorrida ou
número de eventos de exploração durante TESTE; n = 10-11 animais por grupo. As linhas pontilhadas
marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de Student com média teórica = 0. ***p<0.001,
**p<0.01 e *p<0.05 em uma ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de
Bonferroni.
A infusão de AIP imediatamente após o treino também induz amnésia quando os animais são
treinados e testados no ciclo invertido (fase escura: Fig. 14B: t(17) = 3.446, p=0.0031 em um
44
teste t não pareado). O tratamento não altera comportamentos exploratórios e de ambulação
dos animais (Fig. 14C e 14D).
Fig. 14. A inibição da CaMKII durante o ciclo escuro também impede a formação da MRO de
longa duração. A) Protocolo experimental. Ratos foram treinados na TRON durante a fase escura do
ciclo, usando dois objetos diferentes (A e B) e imediatamente depois receberam infusões bilaterais
intra-CA1 (1 μl/lado) de VEH ou AIP (5 nmol/lado). Um dia mais tarde, também na fase escura do
ciclo, os animais foram testados na presença de um objeto familiar (A) e um objeto desconhecido (C).
B) Índice de discriminação dos grupos VEH ou AIP durante o teste. C) Tempo total de exploração (s)
dos objetos durante a sessão de teste. D) Distância total percorrida (m) pelos animais durante a sessão
de teste. Os dados (média ± SEM) estão apresentados como índice de discriminação, tempo de
exploração e distância percorrida durante o TESTE; n = 9-10 animais por grupo. As linhas pontilhadas
marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de Student com média teórica = 0. **p<0.01 em um
teste t de Student.
A amnésia causada por AIP durou pelo menos 7 dias (Fig. 15B: t(20) = 3.024, p=0.0067 em
um teste t não pareado). Os tratamentos não modificam os comportamentos exploratórios e de
ambulação dos animais (Fig. 15C, 15D e 15E).
45
Fig. 15. A amnésia causada pela inibição da CaMKII é persistente. A) Protocolo experimental.
Ratos foram treinados na TRON usando dois objetos diferentes (A e B) e imediatamente depois do
treino receberam infusões bilaterais intra-CA1 (1 μl/lado) de VEH ou AIP (5 nmol/lado). Sete dias
mais tarde os animais foram testados na presença de um objeto familiar (A) e um objeto desconhecido
(C). B) Índice de discriminação dos grupos VEH ou AIP durante o teste. C) Painéis superiores:
trajetórias representativas de exploração durante o teste para os grupos VEH e AIP; Painel inferior:
Distância total percorrida (m) pelos animais durante a sessão de teste. E) Eventos totais de exploração
durante a sessão de teste. Os dados (média ± SEM) estão apresentados como índice de discriminação,
tempo de exploração, número de eventos de exploração ou distância percorrida durante o teste (TT); n
= 11 animais por grupo. As linhas pontilhadas marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de
Student com média teórica = 0. **p<0.01 em um teste t de Student.
O AIP não prejudicou a retenção da MRO quando os animais foram testados 3 h após o treino
(Fig. 16B).
46
Fig. 16. A inibição da CaMKII não afeta a MRO de curta duração. A) Protocolo experimental.
Ratos foram treinados na TRON usando dois objetos diferentes (A e B) e imediatamente depois do
treino receberam infusões bilaterais intra-CA1 (1 μl/lado) de VEH ou AIP (5 nmol/lado). Três horas
depois do treino os animais foram testados na presença de um objeto familiar (A) e um objeto
desconhecido (C). B) Índice de discriminação dos grupos VEH ou AIP durante o teste. C) Tempo total
de exploração (s) dos objetos durante a sessão de teste. D) Painéis superiores: trajetórias
representativas de exploração durante o teste para os grupos VEH e AIP; Painel inferior: Distância
total percorrida (m) pelos animais durante a sessão de teste. E) Eventos totais de exploração durante a
sessão de teste. Os dados (média ± SEM) estão apresentados como índice de discriminação, tempo de
exploração, número de eventos de exploração ou distância percorrida durante o teste (TT); n = 11
animais por grupo. As linhas pontilhadas marcam o nível de chance. # p<0.05 em um teste t de Student
com média teórica = 0.
Após o retreinamento na TRON, os ratos amnésticos pelo tratamento com AIP foram capazes
de adquirir e recordar a memória de um novo objeto, bem como formar uma resposta de
evitação motivada pelo medo quando treinados em um paradigma de aprendizagem de
evitação inibitória, ambas memórias dependentes do hipocampo (Fig. 17B e 17C).
47
Fig. 17. A inibição da CaMKII não afeta futuros aprendizados dependentes do hipocampo. A) Os
animais que receberam AIP ou VEH 5 min após o treinamento foram retreinados na TRON usando um
diferente par de objetos de estímulo (Objs E e F). A retenção da memória de reconhecimento de
objetos foi avaliada 24 horas depois. B) Os animais que receberam AIP ou VEH 5 min após o treino
na tarefa de reconhecimento de objeto novo TRON foram treinados na tarefa de esquiva inibitória
(TEI). A retenção da memória IA foi avaliada 24 horas depois. Os dados são apresentados como média
± SEM, n=10-11 por grupo para a TRON e como mediana ± intervalo interquartil para a TEI,
n=10-11animais por grupo.
A amnésia causada por AIP foi mimetizada pelo inibidor competitivo da CaMKII, KN-93,
(Fig. 18B, painel da esquerda: VEH vs KN-93: t(16) = 3.233, p=0.0052 em um teste t não
pareado) mas não pelo análogo inativo, KN-92 (Fig. 18B, painel do meio), ou por
AIP-scrambled (Fig. 18B, painel da direita). Nenhum dos tratamentos mencionados acima
altera a exploração total e a distância percorrida durante a sessão de treino (Fig. 18C e 18D).
48
Fig. 18. A amnésia causada por AIP é mimetizada pelo inibidor competitivo KN-93 mas não pelo
análogo inativo ou pela sequência não codificante de AIP. A) Protocolo experimental. Ratos foram
treinados na TRON usando dois objetos diferentes (A e B) e imediatamente depois do treino
receberam infusões bilaterais intra-CA1 (1 μl/lado) de VEH, KN-93 (10 nmol/lado), KN-92 (10
nmol/lado) ou AIPsc (5 nmol/lado). Um dia mais tarde os animais foram testados na presença de um
objeto familiar (A) e um objeto desconhecido (C). B) Índice de discriminação durante o teste. C)
Tempo total de exploração (s) dos objetos durante a sessão de teste. D) Exemplos de trajetórias e
distância total percorrida

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