Biologia Molecular na Genética Forense

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Tópico 05
Biologia Molecular e Biotecnologia
Biologia Molecular na Genética
Forense
1. Introdução
As impressões digitais eram as técnicas de identificação
fundamentais para se desvendar crimes. Com a publicação de
um artigo em uma revista científica mundialmente respeitada,
a Nature, a genética forense começou a se desenvolver. Nesse
artigo, os autores afirmavam que existiam regiões do DNA que
permitiam a identificação de uma pessoa com 100% de certeza.
Hoje são essas moléculas biológicas que são analisadas no local
do crime e que permitem chegar a um suspeito – além disso, a
molécula de DNA é estável por anos. A análise pode utilizar
qualquer tipo de tecido ou fluído biológico, pois esse material
contém o DNA. Essas técnicas têm ajudado a justiça a identificar
os criminosos. Vamos entender como elas funcionam nesse
tópico.
2. Perfil Genético
A molécula de DNA é bastante conservada entre os indivíduos, o
que significa que o DNA da espécie humana é 99,9% idêntico
para todos os seres humanos. Apenas 0,1% nos difere uns dos
outros. O 0.1 % corresponde a mais ou menos 3 milhões de pares
de bases, denominadas polimorfismos. Polimorfismo na verdade
são as variações no código genético encontradas intraespécies,
ou seja, dentro de uma mesma espécie (LODISH et al., 2014,
ZAHA et al., 2014). No polimorfismo, as bases que variam
devem ser suficientemente comuns para gerar uma
probabilidade razoavelmente alta, em que os genomas de dois
indivíduos escolhidos ao acaso possam diferir em um sítio
determinado; uma probabilidade de 1%, que é normalmente
usada como ponto de corte. Por exemplo, dois genomas
humanos, escolhidos aleatoriamente da população mundial,
apresentarão diferenças em aproximadamente 2,5 × 10 desses
sítios (1 a cada 1.300 pares de nucleotídeos) (JOHNSON et al.,
2017). O polimorfismo pode ser de um único nucleotídeo (SNPs,
single-nucleotide polymorphisms) e acontece devido a mutações
em um ponto na sequência genômica. Isso significa que, nesse
ponto, uma grande proporção da população humana possui um
nucleotídeo, enquanto outra parte substancial da população
possui outro. Os polimorfismos aparecem em locais específicos
do DNA, os lócus. Dentro dos lócus existem os alelos, que são
formados por mutações de um mesmo gene. Os alelos são
sequências repetidas, elas ocorrem em uma fração de DNA.
Essas repetições aparecem em todos os indivíduos e essas
sequências repetidas estão arranjadas consecutivamente no
genoma (em tandem, repetições adjacentes umas às outras)
(LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). No entanto, as
sequências repetidas diferem entre si, pelo número de repetições
e no comprimento dos arranjos das sequências repetidas. As
diferenças no comprimento dos arranjos são o resultado da
recombinação de material genético durante a meiose. Essa
recombinação leva a perfis desiguais, fazendo com que alguns
arranjos consecutivos sejam únicos em cada indivíduo. Em
humanos, as repetições ocorrem em regiões relativamente
pequenas, de 1 a 5 kb, formadas por 20 a 50 unidades de
repetição, cada uma contendo de 14 a 100 pares repetidos
sequencialmente, em loci cromossômicos específicos, formando
os minissatélites ou repetição em tandem de número variável
(VNTR – “variable number of tandem repeats”). Veja na imagem
abaixo de um gel de eletroforese de fragmentos de DNA que
alelos de região de minissatélites possuem comprimentos
variados mesmo em 6 indivíduos diferentes. Nesta imagem
6 
temos nas laterais os marcadores, padrão de DNA e amostras de
diferentes indivíduos.
Variação no comprimento de alelos em região de minissatélite (VNTR)
de 6 indivíduos.
Outro tipo de polimorfismo é o de sequências curtas repetidas
em tandem (STR-short tandem repeats) ou microssatélites. Eles
são formados por regiões de 1 a 13 pares de bases. Apresentam
repetições com unidade básica de 2-6 pares de base, com
variações. Essas sequências repetidas seriam, por exemplo, CAC.
Os polimorfismos utilizados para diferenciar indivíduos em
genética forense são as regiões compostas pelos minis (VNTRs) e
microssatélites (STR). VNTRs e STR estão em lócus específico
nos cromossomos e possuem alelos característicos. Na rotina
laboratorial, os microssatélites são utilizados mais
frequentemente, porque eles possuem unidades de repetição de
menor tamanho, o que auxilia a amplificação de amostras
degradadas.
Para diferenciar indivíduos, é importante selecionar regiões
(lócus) do cromossomo onde elas são hipervariáveis, ou
altamente polimórficas. Assim, vai existir uma pequena
probabilidade de que duas amostras com perfis iguais possam
ter origem em indivíduos diferentes. Como existe uma variedade
de diferentes lócus no genoma, quanto mais lócus testados,
maior a chance de diferenciar os indivíduos com maior certeza.
Os marcadores possuem a qualidade de identificar o indivíduo
por um padrão de fragmentos que lhe será particular. Cada
variação de repetição é chamada de alelo. Herdamos alelos do
pai e alelos da mãe.
Um microssatélite muito comum é do alelo 9.3 dos lócus TH01,
gene tirosina hidroxilase humana. A STR é composta por nove
unidades de repetição completas e uma unidade incompleta,
constituída por três nucleotídeos (TC/AT) com variações no
número de alelos. Veja na tabela abaixo comprimentos de alguns
alelos localizados no cromossomo, lócus TH01.
Lócus Número de Alelos Tamanho em pares de base
THO1 11 203
THO1 10 199
THO1 8 191
THO1 7 187
THO1 5 179
O gene da tirosina hidroxilase humana está localizado no
cromossomo humano número 11, NC_000011.10. No banco de
dados para informação biotecnológica, a identificação desse
marcador é D00269. Os alelos do cromossomo 11, TH01 variam
de 3 a 14 na população e a unidade de repetição é TC/AT
(pubmed, 2020).
Vamos entender um pouco mais como marcadores genéticos
SRT, como os do cromossomo 11, podem ajudar a diferenciar
indivíduos.
3. 3 identificação humana por
microsatélites (str)
Após o sequenciamento do genoma humano ficou evidente que
apenas 0,1% das sequências do DNA pode nos diferir uns dos
outros (LODISH et al., 2014, ZAHA et al., 2014). Dentre esse
0,1% de sequências variáveis, polimorfismo, marcadores do tipo
STR (STR-short tandem repeats), sequências curtas repetidas
em tandem foram escolhidos como critério para diferenciar um
ser humano do outro, como já comentamos aqui. Isso porque
eles preenchem requisitos para isso. Entre esses importantes
requisitos está o fato de que as sequências STRs não foram
associadas a doenças, essas sequências possuem alto nível de
formação de alelos aleatórios, permitem grande poder de
discriminação entre indivíduos, alta frequência de resultados
bem-sucedidos e alta reprodutibilidade. Baseados nesses
critérios, o FBI (Federal Bureau of Investigation) elegeu
marcadores moleculares do tipo STR a serem utilizados como
marcadores para diferenciar os indivíduos. Esses marcadores
foram listados em uma base de dados americana, constituindo o
CODIS – Combined DNA Index System copilados pelo índice
Forense (Brasil). Veja na figura abaixo como esses codis estão
relacionados a seus loci no cromossomo.
Índice forense (CODIS).
O objetivo do CODIS (índice forense) é a identificação de vítimas
e suspeitos quando evidências biológicas (sangue, suor, saliva,
sêmem, etc.) são recuperadas da cena do crime. As
correspondências feitas entre perfis no índice forense podem
vincular cenas de crimes, possivelmente identificando infratores
em série. As correspondências feitas entre os índices forenses
fornecem aos investigadores a identidade dos suspeitos.
Analistas de DNA qualificados, que trabalham em laboratórios
credenciados pela justiça, extraem DNA das amostras recolhidas
nas cenas do crime. O PCR (reação em cadeia da polimerase) é a
técnica utilizada para amplificação dos STRs. Os resultados são
comparados com os bancos de dados que compartilham perfis de
condenados (banco de dados da justiça). 
Veja na tabela abaixoas atuais STR utilizadas para identificação
e separação entre os indivíduos:
Marcador (STR) Repetições
D2S1338 [TGCC][TTCC]
D3S1358 [TCTG][TCTA]
D5S817 AGAT
No Brasil, existe uma rede de laboratórios de referência
que fazem a comparação dos resultados de PCR com o
banco de dados de suspeitos.
Você pode ler um pouco mais sobre o assunto na página
oficial do governo brasileiro no site que separamos
abaixo:
Clique aqui

https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-content-1560344233.12
Marcador (STR) Repetições
D7S820 GATA
D8S1179 [TCTA][TCTG]
D13S317 TA/TC
D16S539 GATA
D18S51 AGAA
D19S433 AAGG
D21S11 [TCTA][TCTG]
CSF1P0 TAGA
FGA CTTT
TH01 TCAT
TPOX GAAT
VWA [TCTG][TCTA]
D1S1656* CCTA[TCTA]
D2S441* A[TCTA]
D2S1338* GGAA
D10S1248* [GGAA]GTAA
D12S391* AGAT
D19S433* CCTT
D22S1045* [ATT]ACT
Amilogenina 106pb/112pb
Os marcadores STRs são marcadores autossômicos, ou seja, que
não são responsáveis pela determinação do sexo. O marcador
sexual utilizado é o do gene da amilogenina, que está expresso na
polpa dentária. Esse gene permite discriminação de gênero,
sendo AMEL X para indivíduo feminino (106 pb), e AMEL Y
para indivíduo masculino (112 pb). Assista ao vídeo abaixo para
entender como a genética forense ajuda a desvendar crimes:
Os mesmos marcadores utilizados na genética forense podem ter
outras aplicações, como determinação de paternidade,
diferenciar gêmeos (zigozidade), rastreabilidade de
descendência. Vamos aprender um pouco sobre como esses
testes funcionam!
4. Teste de paternidade
As sequências das repetições curtas de microssatélites (STR
short tandem repeted) são usadas para determinação da
paternidade. Os indivíduos herdam um número diferente de
repetições, pela recombinação dos cromossomos, a partir de sua
mãe e de seu pai. Sendo assim, essa herança pode ser um
marcador genético para exclusão de paternidade ou
probabilidade de paternidade, porque dois indivíduos sem
parentesco raramente terão o mesmo par de sequências (STR)
em um determinado lócus (LODISH et al., 2014, ZAHA et al.,
2014). Para fazer o teste de paternidade, amostras de sangue ou
saliva da mãe, da criança e dos possíveis pais são retiradas. A
PCR utiliza iniciadores que são generalizados, ou seja,
reconhecem sequências únicas em cada lado de um determinado
lócus STR usado para identificação humana. Então, na PCR
haverá amplificação dos alelos, sendo característicos para cada

Genética Forense - Perícia Criminal - ASBAC Genética Forense - Perícia Criminal - ASBAC ……
https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM
indivíduo. Veja no esquema abaixo como um suposto teste de
paternidade pode parecer.
Esquema de comparação de alelos em teste de paternidade
Vamos analisar o esquema acima. A primeira coluna
corresponde aos alelos amplificados da mãe. Irá funcionar como
padrão positivo. A mãe é adotada como certeza, pois ela gera o
filho. A segunda coluna representa os alelos da criança. As
colunas 1, 2 e 3 possuem perfis de supostos pais. Após
comparação dos fragmentos na eletroforese, e sabendo que os
alelos são doados pelo pai e pela mãe, podemos concluir que o
possível pai, nesse caso, é o do perfil 1, pois possui 4 bandas
(alelos) semelhantes ao filho. Esse mesmo princípio funciona
para determinar relações entre parentes. Parentes apresentam
perfis de alelos semelhantes. A probabilidade estatística é uma
ferramenta que ajuda na definição dessas relações (LODISH et
al., 2014, ZAHA et al., 2014).
Marcadores genéticos são muito importantes também para
diferenciar indivíduos com genomas com maior identidade,
como no caso dos gêmeos. Vamos entender como isso funciona!
5. Polimorfismos de nucleotídeo
único (snp)
Os marcadores de polimorfismo STR são suficientes para
diferenciar todos os indivíduos (LODISH et al., 2014, ZAHA et
al., 2014). No entanto, essa regra tem uma exceção, os gêmeos
monozigóticos. Nesse caso, marcadores usados são os de
polimorfismos de nucleotídeo único (SNP- Single Nucleotide
Polymorphism), devido à baixa frequência de polimorfismo
desses indivíduos. Veja na figura abaixo o que seria
polimorfismo de nucleotídeo único. Observe que na sequência
em destaque apenas um dos nucleotídeos é diferente.
Polimorfismo de nucleotídeo único
Os marcadores de repetição simples (STR) apenas confirmam a
monozigozidade (MZ) desses indivíduos. Se aparecer um único
nucleotídeo diferente entre as bases do genoma desses
indivíduos, será suficiente para diferenciá-los. A identificação
por SNP se faz quando os indivíduos possuem o mesmo gênero,
monozigóticos (MZ), pois gêmeos de gênero diferentes são
consequentemente dizigóticos (DZ) (LODISH et al., 2014). Para
isso, se faz necessária a análise de todo o genoma dos gêmeos. A
técnica mais empregada é o de microarranjos. O DNA genômico
(DNA completo) será analisado para identificar uma única base
nucleotídica diferente. Na rotina, essa técnica só é utilizada em
casos específicos, por exemplo, gêmeos suspeitos de um crime,
porque os SNPs possuem somente 2 alelos, em contraste com os
vários alelos encontrados nos STRs. Seria necessário o estudo de
pelo menos 50 SNPs para se ter o poder estatístico
discriminatório conseguido pelas análises de STRs. A análise de
SNP também pode ser complicada pela contaminação das
amostras, e da possibilidade de muitos SNPs não serem
informativos.
Veja um pouquinho sobre o relato de um crime verídico
envolvendo gêmeos idênticos (MZ) no site da revista BBC Brasil:
Até agora vimos como os marcadores podem diferenciar
indivíduos usando DNA nuclear, vamos entender quando usar
DNA mitocondrial para análise forense de DNA!
6. Marcadores de dna
mitocondrial
Quando o material biológico recolhido na cena de um crime se
encontra degradado, ou, principalmente, quando não apresenta
Veja um pouquinho sobre o relato de um crime verídico
envolvendo gêmeos idênticos (MZ) no site da revista
BBC Brasil:
Clique aqui

https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dna_gemeos_criminosos_teste_fn
DNA nuclear suficiente, como nos fragmentos de cabelo sem
bulbo, o DNA mitocondrial é usado para identificação humana.
A mitocôndria possui DNA próprio, constituído de uma molécula
circular (ZAHA et al., 2014). Esse DNA possui 37 genes. Destes,
13 codificam para proteínas, 2 codificam moléculas de rRNA e 22
genes para tipos de tRNA. No entanto, existe uma região não
codificante, conhecida como região D-loop. Essa região contém
aproximadamente 1.122 pares de bases, sendo dividida em
regiões hipervariáveis I, II e III (HV I, II e III), constituindo
essas regiões hipervariáveis os polimorfismos usados para
identificação de indivíduos. Veja na imagem como os genes estão
representados no cromossomo mitocondrial.
DNA mitocondrial
Nesse caso, também a identificação de marcadores
polimorfismos de nucleotídeo único SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) é útil para separar os genótipos dos indivíduos.
Geralmente, na genética forense, a análise de DNA mitocondrial
se dá por extração do DNA, amplificação via PCR (reação em
cadeia da polimerase) de fragmentos, seguida de
sequenciamento dos fragmentos de DNA. A avaliação do DNA
mitocondrial ainda permite rastrear a origem materna do
indivíduo. Isso porque ele é transmitido às gerações seguintes
pela chamada herança citoplasmática, exclusiva das mulheres,
formando uma matrilinhagem (ZAHA et al., 2014). Sendo assim,
é possível montar a árvore filogenética de populações ou de
indivíduos usando o DNA mitocondrial. A interpretação dos seus
perfis permite determinar a genealogia materna e, em maior
abrangência, determinar a origem da população, pois esse DNA
permite remontar a um ancestral único comum feminino,
conhecido como “Eva mitocondrial”. Hoje é possível encontrar
esse tipo de análise disponível para qualquer um, por um preço
bem razoável.
Vamos ver que marcadores sexuais também podem ser usados
para identificação de pessoas.
7. Marcadores situados nos
cromossomos sexuaisOs cromossomos sexuais são denominados X e Y. As mulheres
possuem dois cromossomos X, (XX). O gênero masculino possui
somente um, XY. O nível de atividade gênica produzida por um
único cromossomo X é suficiente para a espécie humana.
Homens têm essa dosagem normal, pois eles possuem apenas
um cromossomo X. As mulheres têm a mesma dosagem por um
motivo diferente, elas desligam um de seus dois cromossomos X
em um processo chamado inativação do X. Nesse processo, um
cromossomo X é compactado para formar uma estrutura
pequena e densa chamada de corpúsculo de Barr, durante o
período embrionário (JOHNSON et al., 2017). Essa
característica de inativação é transferida a todas as células
femininas. O cromossomo X possui regiões polimórficas que
podem ser usadas como marcadores para identificação de
indivíduos, para diferenciar, por exemplo, entre duas possíveis
genitoras, nos casos mais complicados de identificação humana.
Esses marcadores do cromossomo X também possuem a
característica de serem sequências curtas repetidas em tandem
(STRs). Os STRs de cromossomo X possuem maior poder de
exclusão entre candidatos do que os STR autossômicos. Alguns
marcadores STRs do cromossomo X são: DXS6809 e
GATA172D05, DXS8378, DXS7133 e DXS7423.
Já os indivíduos masculinos possuem dois alelos em cada
marcador autossômico, mas somente um alelo em cada
marcador sexual do seu cromossomo X, porque o pai transfere
para sua filha 100% do seu perfil haplotípico do cromossomo X.
Indivíduos do sexo masculino não herdam o cromossomo X do
pai, e sim, da mãe, aumentando o poder de exclusão desses
marcadores quando comparado aos autossômicos em indivíduos
masculinos.
Da mesma forma, o cromossomo Y possui regiões polimórficas
que podem ser usadas como marcadores. As STRs do
cromossomo Y (SRY) são herdadas exclusivamente do pai,
servindo, por isso, como marcador para determinar a
ancestralidade paterna. Além disso, o cromossomo Y é incapaz
de se recombinar com o cromossomo X, e possui uma região que
é chamada de região não recombinante do cromossomo Y
(NRY). Adicionalmente, as STRs do cromossomo Y, o
polimorfismo de nucleotídeo único da região não recombinante,
Y (NRY), também ajudam a traçar as linhas ancestrais paternas
(LODISH et al, 2001, JOHNSON et al., 2017). Os marcadores do
cromossomo Y são usados para obtenção de perfil
exclusivamente masculino, quando há vários doadores de
esperma. Eles também ajudam a melhorar a separação
dificultada de frações de amostras masculina e feminina em
casos de crimes sexuais, em que há misturas de diversos tipos de
fluidos corporais que não sejam sêmen.
Separamos uma leitura sobre a utilização do cromossomo X na
genética forense.
Agora que já vimos os STRs autossômicos, os polimorfismos de
DNA mitocondrial e os marcadores da região não codificadora
do cromossomo Y, você poderá aprofundar esse conhecimento
lendo o estudo que separamos. Nesse estudo, a ancestralidade
brasileira foi estudada utilizando esses marcadores.
A comprovação de ancestralidade é possível graças às técnicas de
biologia molecular. Vamos estudar agora um pouco sobre
algumas das técnicas empregadas na genética forense.
8. Polimorfismo de restrição (rflp)
A primeira técnica de análise de DNA foi baseada no perfil de
restrição de um fragmento de DNA. Esse DNA era tratado com
enzimas de restrição. Com isso, se o DNA for digerido com uma
Aplicabilidade do cromossomo X no DNA forense 
Clique aqui
(LEITE; MACHADO; BARCELOS, 2017).

Brasil e a idiossincrasia da miscigenação, leia o artigo
para entender a ancestralidade brasileira:
Clique aqui
(TARAZONA-SANTOS et al., 2016).

https://portalseer.ufba.br/index.php/cmbio/article/view/15078
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/26745/2/Santos%20ET%20Brasil%20e%20a%20....pdf
enzima de restrição, que corte dentro das sequências vizinhas
dos loci da região hipervariável, teremos comprimentos de
fragmentos de DNA diferentes. Esse comprimento depende do
número de repetições nos loci, que varia entre 15 e 70. Mutações
que alterem as sequências no DNA de um indivíduo acabam
levando à perda de sítios de restrição (ZAHA et al., 2014,
JOHNSON et al., 2017). Esse perfil de restrição dos fragmentos é
chamado de impressão digital do DNA. Veja na imagem abaixo
um perfil de restrição do DNA.
Impressão digital do DNA
Observe na figura que foram testados 6 loci. Como existe uma
variedade de diferentes loci no genoma, o padrão de fragmentos
produzidos por eles é essencialmente único para cada indivíduo.
Quanto mais loci testados, maior a chance de se diferenciar os
indivíduos com maior certeza (porque esses testes também
contam com análises de estatística, avaliação de probabilidades).
Existe na figura um padrão de peso molecular para distinguir o
tamanho dos fragmentos. Além disso, os alelos de uma amostra
conhecida servem como um padrão de referência para se
comparar com uma amostra questionável, porque esses alelos
tomados como padrão migram no gel com tamanho conhecido.
Os primeiros mapas genéticos baseados em DNA foram de
marcadores de RFLP no ano de 1989. Análises por RFLP de DNA
mitocondrial e ribossômico têm sido utilizadas para avaliar a
genética de populações, levantamentos biogeográficos e
filogenéticos. Essa técnica permite resultados estáveis e
reprodutíveis, cobertura ampla do genoma e a possibilidade de
utilização de sondas (ZAHA et al., 2014). No entanto, ela tem
sido substituída por técnicas mais modernas, uma vez que o
desenvolvimento de sondas requer estudo prévio, acaba sendo
caro e não permite automatização das etapas. Não existe uma
biblioteca (banco) de sondas. Vamos entender um pouco sobre
as modernas técnicas empregadas em genética forense.
9. Pcr multiplex para detecção de
SRTs
A PCR é o padrão ouro da genética forense. Para isso, os
iniciadores (primers) são escolhidos baseados em sequências
que estão ao lado das sequências STRs (sequências curtas
repetidas em tandem). Além dos primers, sondas marcadas com
fluoróforos são utilizadas. Quando as sondas hibridizam com a
sequência amplificada de interesse, emitem um sinal que será
captado por um detector acoplado ao PCR quantitativo em
tempo real (qPCR) (ZAHA et al., 2014). A partir de DNA extraído
da amostra previamente, é realizada a PCR seguindo os passos
padrão que são desnaturação, anelamento do primer,
alongamento do fragmento e repetição dos ciclos. Várias
sequências STR poderão ser detectadas ao mesmo tempo.
Empregando-se várias sondas ao mesmo tempo, esse PCR passa
a se chamar de PCR multiplex. Veja na imagem abaixo como
uma sonda permite a emissão de fluorescência.
Sonda para PCR.
Vamos entender como a emissão de fluorescência ocorre. As
reações de qPCR envolvem sondas marcadas com corante
fluorescente, que complementam e reconhecem a sequência de
DNA de interesse, que fica entre os dois iniciadores. Um corante
“repórter” (R) é fixado na extremidade 5“ da sonda fluorescente
enquanto um corante ”extintor“ (Q) é fixado na extremidade 3”.
Antes de as cadeias de DNA serem estendidas pela polimerase, o
inibidor absorve completamente a fluorescência do repórter. À
medida que a polimerase começa a estender a fita, a extremidade
5“ da sonda é degradada pela polimerase, devido à sua atividade
de exonuclease. O corante repórter é liberado a partir da
extremidade 5” e não é mais extinto, permitindo assim a
detecção de fluorescência (ZAHA et al., 2014).
Como as sequências STR foram determinadas em estudos
prévios, já existem no mercado kits com as sondas que se
hibridizam a sequências STRs. Esses kits possuem também os
outros componentes para PCR como a enzima polimerase, para
tornar a técnica mais rápida. Para cada STR, um fluoróforo é
utilizado, permitindo a identificação específica destes. A
hibridização é detectada em tempo real, qPCR, por possuir
várias sondas de uma vez, esse PCR é conhecido como multiplex,
pois gera vários sinais. Veja na imagem abaixo um perfil de PCRmultiplex.
Identificação humana por PCR multiplex.
O gráfico é construído para o DNA da amostra, comparando a
presença de fluorescência (eixo y) com o número do ciclo (eixo x)
do processo qPCR. Isso é então comparado a uma curva padrão
do limiar de fluorescência do ciclo (eixo y) versus o log das
concentrações conhecidas de DNA (eixo x). Ao comparar os
dados da amostra com a curva padrão, pode-se extrapolar a
concentração de DNA na amostra (ZAHA et al., 2014).
Foram analisados para esse perfil da imagem DNA de três
indivíduos. Os marcadores utilizados para esse PCR multiplex
foram: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO (marcados com
sonda azul, abaixo há o número de alelos). D3S1358, TH01,
D13S317, D16S539, D2S1338 (marcados em verde, com número
de alelos abaixo). D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D6S818, FGA
(marcados em cinza, com respectivos números de alelos). Ainda,
marcadores para determinação de gênero, cromossomos X e Y
(marcados em vermelho, com respectivos alelos). Cada pico
corresponde ao alelo amplificado.
Essa técnica é muito mais precisa que a impressão digital
cromossômica. Existem no Brasil 18 laboratórios credenciados
pela justiça para fazerem os testes de perfis genéticos nos
estados de AM, AP, BA, CE, ES, GO, MA, MG, MS, MT, PA, PB,
PE, PR, RJ, RS, SC e SP, e o laboratório distrital (Distrito
Federal) e o laboratório da Polícia Federal fazem parte da rede
de laboratórios autorizados (BRASIL, 2020). Esse perfil de
suspeitos obtido no qPCR é comparado com perfis de
condenados em banco de dados para obtenção do candidato
mais provável. Vamos entender como os bancos de dados
funcionam!
10. Banco nacional de perfis
genéticos
O banco de dados serve de apoio para a genética forense, porque
nele estão contidos perfis de condenados. No Brasil, o Banco
Nacional de Perfis Genéticos possui atualmente 17.361 perfis de
condenados cadastrados. Em relação ao número de perfis
cadastrados em 2020, houve um crescimento de 165% se
comparado ao de 2018. Isso se deve ao avanço de aplicações de
técnicas de biologia molecular automatizadas (BRASIL, 2020).
Veja na figura abaixo a representação dos perfis genéticos
brasileiros cadastrados por estado.
Contribuição relativa (%) de cada laboratório para o Banco Nacional de
Perfis Genéticos (BNPG), (2020).
Os dados podem também fornecer a distribuição dos perfis
genéticos brasileiros por categoria. Veja na imagem abaixo.
Distribuição das categorias de perfis genéticos existentes no Banco
Nacional de Perfis Genéticos (BNPG), (2020).
As evidências biológicas (sangue, fluidos corporais como suor,
sêmem, cabelo, ossos, dentes) devem ser coletadas de forma a
garantir o adequado manuseio e acondicionamento. A
quantidade de DNA na amostra pode ser pequena, mas com as
técnicas adequadas elas serão amplificadas para sua
identificação. No entanto, as evidências biológicas podem vir a
ser degradadas por fungos e bactérias (BORZANI et al., 2001).
Normalmente, a umidade é um fator que pode favorecer esse
tipo de degradação. Portanto, seu manuseio deve ser o melhor
possível para evitar o levantamento de dúvidas a sua correta
identificação. Além disso, deve ser levado em consideração o fato
de que amostras de DNA adicionais também podem estar
presentes no local do crime, sendo estranhas ao criminoso ou à
vítima, e devem ser evitadas cuidadosamente. Isso porque sendo
as técnicas de biologia molecular muito sensíveis, elas também
vão ampliar os fragmentos das amostras que não são dos
criminosos, podendo ter implicações graves se forem
interpretadas de maneira incorreta.
11. Conclusão
Este tópico procurou mostrar que, como humanos, somos 99.9%
idênticos quando comparamos nossas sequências de DNA, ou
seja, o que nos faz diferentes é apenas 0.1%. As bases
nitrogenadas do DNA que constituem as sequências diferentes
formam os polimorfismos e estes são usados como marcadores
para identificação de indivíduos na genética forense. Os
marcadores podem estar localizados em regiões de repetição em
tandem de número variável (VNTR), minissatélites, ou em
sequências curtas repetidas, (SRTs), os microssatélites. Os STR
são os marcadores mais comuns para identificação humana. Eles
possuem grande poder de discriminação entre indivíduos, alta
frequência de resultados bem-sucedidos e alta reprodutibilidade.
Baseados nesses critérios, esses marcadores estão listados em
uma base de dados o índice Forense (Brasil).
Os mesmos marcadores utilizados na genética forense podem ter
aplicações como determinação de paternidade, identificar
marcadores para diferenciar gêmeos (zigozidade), determinação
de gênero, rastreabilidade de descendência.
Os indivíduos normalmente herdam um número diferente de
repetições em cada lócus proveniente de sua mãe e de seu pai.
Sendo que o DNA mitocondrial permite rastrear a origem
materna do indivíduo.
Já para diferenciar os gêmeos monozigóticos, os marcadores
devem ser o polimorfismo de nucleotídeo único SNP (Single
Nucleotide Polymorphism), pois esses indivíduos possuem baixa
frequência de polimorfismo.
Os cromossomo X e Y possuem regiões polimórficas STR que
podem ser usadas como marcadores para identificação de
indivíduos. O polimorfismo de nucleotídeo Y (NRY) é utilizado
para traçar as linhas ancestrais paternas.
Os marcadores combinados, STRs autossômicos, os
polimorfismos de DNA mitocondrial e região não recombinante
do cromossomo Y (NRY) permitem rastrear a origem
populacional.
Laboratorialmente, a primeira técnica de análise de DNA foi
baseada no perfil de restrição de um fragmento de DNA.
Hoje, o PCR é o padrão ouro da genética forense. Várias
sequências STR poderão ser amplificadas ao mesmo tempo no
qPCR multiplex.
Os perfis obtidos nas amplificações dos marcadores polimórficos
são comparados com perfis de criminosos condenados,
guardados em banco de dados.
12. Referências
BORZANI, Walter et al. Biotecnologia industrial: volume I:
fundamentos. São Paulo, SP: E. Blücher, 2001. xxix, 254 p. ISBN
8521202784 (v.1).
JOHNSON, Alberts et al. Biologia molecular da célula. 6 ed.
Porto Alegre RS: Artmed, 2017. 1464 p., ISBN 978-85-8271-423-
2.
LODISH, Harvey F et al. Biologia celular e molecular. 7.ed. Porto
Alegre, RS: Artmed, 2014. xxxiv, 1210 p., ISBN 9788582710494.
TARAZONA-SANTOS, E. et al. Brasil E a Idiossincrasia Da
Miscigenação. Revista da Universidade Federal de Minas Gerais,
v. 22, n. 1.2, p. 232–249, 2016.
ZAHA, Arnaldo et al. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto
Alegre: Artmed, 2014. 407 p. ISBN 978-85-8271-058-6.
Base de dados para informação biotecnológica (ncbi), (National
Center for Biotechnology Information Search database), 2020.
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome>.
YouTube. (2015). Genética Forense – Perícia Criminal. Perícia
Criminal ASBAC Sindicato. 15min41. Disponível em:
<https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM>.
BRASIL. Ministério da justiça e segurança pública [2020].
Disponível em: https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-
content-1560344233.12.
BBC NEWS BRASIL. Novo teste “diferencia” gêmeos e pode
solucionar casos de estupro e paternidade. Disponível em:
https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dn
a_gemeos_criminosos_teste_fn.
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome
https://www.youtube.com/watch?v=8CHuDpdBDuM
https://www.justica.gov.br/news/collective-nitf-content-1560344233.12
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https://www.bbc.com/portuguese/noticias/2014/01/140115_dna_gemeos_criminosos_teste_fn
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