Extração e Purificação do Material Genômico

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Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
-Manipulaçãodomaterialgenético
-NecessidadedoDNAlivredecontaminações
-RNA,proteínaseinibidoresdePCR
-Padronizaçãodaconcentraçãodomaterialdepartida
Necessidades
Utilidades
-DiagnósticomolecularporPCR,hibridizaçãoou
sequenciamento
-Identificaçãogenética(paternidadeeforense)
-Clonagemesubclonagem degenesparapesquisaeindústria
-Isolamentodegenesparatransgenia
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Desafiostécnicos
-Rupturadamatriztecidualedamembrana/paredecelular
-Remoçãodeproteínasfirmementeassociadasaosmaterialgenético
-Separaçãodosdiferentesácidosnucléicos– DNAeRNA
-Purificaçãodomaterialgenéticodeaçúcaresecompostosorgânicos
-Manutençãodaintegridadedomaterialgenético(DNAses,RNAses...)
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Materialdepartida
-Microorganismos
-Culturamicrobiana:colônia,precipitadodecélulas,etc.
-Amostrasambientais:águacentrifugada,solo,vegetais,
etc.
-Amostrasclínicas:escarro,fezes,swab,etc.
-Vegetais
-Endospermadesementes
-Partesassépticasdefolhas,caules,etc.
-Culturaslaboratoriais
-Animaisehumanos
-Sangue
-Célulasmucosas
-Pelos
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Rupturatecidualedamembrana/paredecelular
-Agentesfísicos
-Trituração,moagem,etc...
-Congelamentoedescongelamento(freeze and taw)
-Fervura
-Agentesquímicos
-Detergentes:SDS,CTAB
-Bioquímicos:proteinasek,lisozima,etc.
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Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
- Trituraçãoemoagem
N2 líquido(-150oC)
Sílica(areialavada)
Esferasdevidro(glass beads)
Tampãodelise
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Tampãodelise
TENS:Tris,EDTA.NaCl,SDS
- Tris,pH8:manutençãodopH
- EDTA:quelante deíonsdivalentes (Mg2+)necessáriospara
atividadeDNÁsica.
- NaCl:EstabilizaçãodoDNAporaumentodaforçaiônica.
- SDS:detergentedesestabilizadordemembranasbiológicas.
Métodos:
Físico+químico
Detergentes+congelamento
Detergentes+atritomecânico
Detergente+aquecimento(fervura)
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Precipitaçãodeproteínas
-Agentesdesnaturantes pararemoçãodasproteínas
- cloridrato deguanidina
- uréia
- fenol
- solventesorgânicos(clorofórmio)
Oprecipitadodeproteínasdesnaturadas
particiona comafaseorgânicainferior
ODNApermanecesolubilizado nafase
aquosasuperior
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Precipitaçãodomaterialgenético
- Isopropanol
- Etanol50%+acetatodesódio5M(-20oC)
-PurificaçãodoDNAdecompostos
orgânicossolúveis,sais,etc.
-ConcentraçãodeamostrasdiluídasdeDNA
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Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Ressuspensão eanálisedaamostra
TE,TAEouTBE
Tris,EDTA
Tris,acetato,EDTA
Tris,borato,EDTA
Usodeágualivredenucleases:
-Recémpurificada
-Autoclavada
-TratadacomDEPC– dietilpirocarbonato (inibidordeDNAse)
*EventualmentesetrataaamostracomDNAse quandosequerisolarRNAe
comDNAse quandosequerisolarRNA.
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Kitscomerciais– IsolamentodeDNAdesangue
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
DosagemespectrométricadoDNA
0,571000
1,06955
1,329010
1,737030
1,943070
1,981090
1,99595
20100
260:280%proteína%ácidonucléico
[DNA](mg/mL)=(A260 – A320).50
A=ε .b.C
A260=1eq.50mg/mLdeDNA
Relação280/260
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Eletroforeseemgeldeagarose
- Agarose
- Tampãodeamostra
TE,azuldebromofenoleglicerol
- Revelador
Brometodeetídio,sybersafe,sybergreen
- Padrãodepesomolecular(DNAladder) 
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Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
Brometodeetídio
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico
SYBRsafe
Extraçãoepurificaçãodomaterialgenômico