Aula prática 1 - Coloração de gram

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<p>Aula Prática - Coloração de Gram</p><p>Coloração</p><p>O exame microscópico de um esfregaço colorido, além de facilitar sua observação,</p><p>permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o</p><p>micro-organismo deve ser fixado à lâmina, através de exposição ao ar ou secagem na</p><p>chama do bico de Bunsen.</p><p>Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um</p><p>desses íons, o que dá a cor, é chamado de radical cromóforo. Os corantes</p><p>conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo, enquanto que os corantes</p><p>ácidos têm a cor do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada,</p><p>portanto atrai corantes básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta,</p><p>azul de metileno e safranina.</p><p>A introdução dos vários métodos de coloração contribuiu substancialmente com</p><p>o avanço da Microbiologia, por quatro razões principais: 1) Permitiu uma melhor</p><p>visualização das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas</p><p>o contorno e a conformação dos arranjos; 2) Permitiu a caracterização de alguns</p><p>componentes intracelulares; 3) Podem levar à diferenciação entre os grupos de micro-</p><p>organismos e 4) Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.</p><p>Quanto aos tipos de coloração temos:</p><p>1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura</p><p>básica das células mais visíveis.</p><p>2) Coloração diferencial - nessa coloração o corante reage diferentemente</p><p>com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente</p><p>são exemplos de colorações diferenciais.</p><p>3) Coloração especial - são aquelas utilizadas para corar e identificar partes</p><p>específicas dos micro-organismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença</p><p>de cápsulas.</p><p>No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a</p><p>cor por aumentarem a afinidade do corante com o micro-organismo. Essas</p><p>substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo (ou lugol) na coloração de</p><p>Gram. Outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de</p><p>visualizar após a coloração.</p><p>Coloração pelo método de Gram</p><p>A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido</p><p>pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no</p><p>tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os seguintes</p><p>compostos: cristal violeta, iodo (lugol), etanol-acetona e safranina. Essa técnica</p><p>permite a visualização ao microscópio de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas</p><p>e a determinação da morfologia e do tamanho das células analisadas.</p><p>O mecanismo da coloração de Gram se refere à estrutura e composição da</p><p>parede celular. Basicamente, as Gram-positivas possuem uma espessa camada de</p><p>peptideoglicano coberta por uma fina camada de ácido teicóico e as Gram-negativas,</p><p>uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta</p><p>por lipoproteínas, fosfolipídios, proteínas e lipopolissacarídeos (figura ).</p><p>Figura 4. Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram-positivas (a) e Gram-</p><p>negativas (b)</p><p>Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona extrai os</p><p>lipídeos, resultando numa porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular</p><p>das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser</p><p>retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. Estas células são então</p><p>contracoradas pelo segundo corante, a safranina e aparecem vermelhas (Figura 5 a).</p><p>A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição</p><p>diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool e com isso a</p><p>porosidade diminui, diminuindo a permeabilidade e assim o complexo CV-I não pode</p><p>ser extraído, permanecendo a célula na cor roxa (Figura 5 b). Esta coloração é o ponto</p><p>de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um</p><p>(a)</p><p>(b)</p><p>diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será</p><p>um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada.</p><p>Figura 5. Bactéria Gram positiva (a) e bactéria Gram-negativa (b).</p><p>OBJETIVO: Visualização das células microbianas fixadas na aula anterior por meio da</p><p>coloração de Gram (microscopia)</p><p>1. Caracterização microscópica</p><p>1.1 A partir do preparo do esfregaço realizar a coloração de Gram</p><p>1.2 Coloração</p><p>1) Tenha em mãos um relógio para contar o tempo de contato com os corantes.</p><p>Quando for lavar a lâmina, abra apenas um filete de água na torneira (ou usar pisseta).</p><p>2) Colocar na lâmina quantidade suficiente do corante cristal violeta para cobrir o</p><p>esfregaço e deixar em repouso por 1 minuto.</p><p>3) Desprezar o corante na bandeja e lavar rapidamente com água corrente.</p><p>4) Colocar a mesma quantidade de lugol, deixar em repouso por mais 1 minuto.</p><p>5) Desprezar na bandeja e lavar rapidamente com água corrente.</p><p>6) Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona até que não haja desprendimento de</p><p>corante (cerca de 30 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.</p><p>7) Cobrir o esfregaço com o contra-corante safranina para Gram e deixar em</p><p>repouso por 30 segundos.</p><p>8) Lavar com água, deixar a lâmina secar e examinar ao microscópio, sob imersão.</p><p>Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de</p><p>Gram:</p><p> A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada.</p><p> A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada</p><p>rapidamente. Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser</p><p>completada.</p><p> Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de descorar e</p><p>suas observações mais trabalhosas.</p><p>(a) (b)</p><p> Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração, com</p><p>bactérias G (+) apresentando-se como G (-) e bactérias G (-) corando-se</p><p>fracamente.</p><p>1.3 Microscopia</p><p>Observe ao microscópio utilizando óleo de imersão e a objetiva com 100X de</p><p>aumento, as culturas que você corou utilizando a técnica de coloração de Gram. Anote</p><p>as características na tabela abaixo e desenhe o que observar.</p><p>CULTURA GRAM FORMA ARRANJO</p><p>Micro-organismo 1</p><p>Micro-organismo 2</p><p>Micro-organismo 3</p><p>Micro-organismo 4</p><p>Micro-organismo 1 Micro-organismo 2</p><p>Micro-organismo 3 Micro-organismo 4</p>