2-Métodos em laboratório de análises clínicas

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<p>Métodos em laboratório de</p><p>análises clínicas</p><p>profa. Dra. Enny Fernandes Silva</p><p>• Reação de Aglutinação: São utilizadas partículas ligadas a antígenos ou anticorpos que</p><p>reagem com um analito produzindo uma reação visível a olho nu ou ao microscópio</p><p>(reações positivas = aglutinação).</p><p>• Reação de inibição de aglutinação: reações positivas se manifestam pela ausência de</p><p>aglutinação.</p><p>• Reação de turvação e precipitação: ocorrem por precipitação de um analito, por ação de</p><p>um reagente que pode ser um anticorpo e o precipitado permanece na forma de</p><p>suspensão que será quantificado por espectrofotometria.</p><p>• Reação Colorimétrica: o produto formado tem uma cor e a intensidade da cor é medida</p><p>na faixa visível do espectro (380 - 680 nm).</p><p>• Reação Ultravioleta (UV): produtos formados absorvem luz ultravioleta (340 ou 365 nm).</p><p>• Turbidimetria: medida da diminuição da intensidade da luz transmitida, em relação a</p><p>incidente,</p><p>• Nefelometria: medida do espalhamento, ou luz dispersa em um determinado ângulo</p><p>IMUNOAGLUTINAÇÃO</p><p>TURVAÇÃO</p><p>COLORIMÉTRICA</p><p>TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA</p><p>Cubetas</p><p>ESPECTROFOTOMETRO</p><p>Intervalos de comprimento de onda no espectro</p><p>eletromagnético</p><p>◼ Cores intervalos de onda (nm)</p><p>◼ Ultravioleta (não visível)  380</p><p>◼ Violeta 380-450</p><p>◼ Azul 450-500</p><p>◼ Verde 500-570</p><p>◼ Amarela 570-590</p><p>◼ Alaranjada 590-620</p><p>◼ Vermelha 620-750</p><p>◼ Infravermelha curta 750-2000</p><p>Transmitância e Absorbância:</p><p>Lei de Lambert-Beer</p><p>ABSORVANCIA:</p><p>mede-se a intensidade de luz absorvida por uma</p><p>solução corada pela redução da medida da</p><p>intensidade de luz transmitida</p><p>“ A concentração de uma substancia</p><p>é diretamente proporcional a</p><p>quantidade de luz absorvida ou</p><p>inversamente proporcional ao</p><p>logaritmo da luz transmitida”</p><p>Aplicação da lei de Beer:</p><p>Concentração do padrão = concentração do teste</p><p>Absorbância do padrão absorbância do teste</p><p>Concentração do teste é assim calculada:</p><p>Concentração do teste = abs do teste x conc do padrão</p><p>abs do padrão</p><p>A luz branca da fonte de luz</p><p>entra no elemento</p><p>dispersante que a</p><p>transforma em luz</p><p>monocromática.</p><p>◼A luz monocromática é transmitida através</p><p>da cubeta ou tubo de medição localizado no</p><p>compartimento de amostras e incide no</p><p>detector, onde é convertida em sinal elétrico</p><p>que será amplificado e exposto no medidor</p><p>ou indicador.</p><p>Os instrumentos que</p><p>medem a absorção de</p><p>radiação por soluções</p><p>são denominados</p><p>colorímetros e</p><p>espectrofotômetros.</p><p>Os espectrofotômetros diferem dos colorímetros por</p><p>serem aparelhos que utilizam a radiação proveniente</p><p>de um determinado tipo de monocromador e,</p><p>portanto, operam com uma faixa muito mais estreita</p><p>do espectro.</p><p>• Reação de Ponto Final - reações que formam um produto cuja</p><p>concentração chega a um ponto máximo, permanecendo inalterada</p><p>por um determinado tempo em função da estabilidade do produto</p><p>formado. Estas reações podem ser colorimétrica ou ultravioleta.</p><p>• Reação Cinética - reações onde a velocidade da formação do produto</p><p>é medida durante um intervalo de tempo (horas, minutos ou</p><p>segundos)</p><p>• Reação Cinética Contínua - utilizam medidas contínuas da formação</p><p>de produtos</p><p>• Reação Cinética de Tempo Fixo com medição em Ponto Final – marca-</p><p>se o tempo no momento em que a amostra entra em contato com o</p><p>substrato, e quando o tempo se completar, interromper a reação e</p><p>faz-se a leitura</p><p>• Reação Cinética de Dois Pontos - utilizam a fase inicial da reação com</p><p>uma medição aos 30 segundos, que servirá como branco, e outra</p><p>medição aos 90 segundos e faz-se a conta para calcular a</p><p>concentração do analito.</p><p>• RADIOIMUNOENSAIO: quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac)</p><p>quantifica o Ag ou Ac não marcado na amostra. Pode ser competitivo ou</p><p>por excesso de reagente</p><p>• IMUNOFLUORESCENCIA: anticorpo se liga covalentemente a fluorocromos</p><p>sem perder sua reatividade específica com o antígeno, resultando em</p><p>conjugado especifico em que se deve determinar a concentração da γ-</p><p>globulina, relação fluoresceína/proteína e o título para determinação de</p><p>atividade imunológica.</p><p>• ENZIMAIMUNOENSAIO: reação Ag-Ac é monitorada por medida da</p><p>atividade enzimática.</p><p>• ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):Um dos reagentes é</p><p>imobilizado na fase sólida, enquanto outro pode ser ligado a uma enzima</p><p>• QUIMIOLUMINESCENCIA: reação química produz energia luminosa</p><p>(luminol, acridina, indol).</p><p>Imunoprecipitação:</p><p>quando um Ag proteico solúvel combina com um aC formando complexo Ag-Ac</p><p>insolúvel</p><p>• Ensaios imunoenzimáticos</p><p>ac conjugados com enzimas</p><p>• Observação ou medição da cor</p><p>produzida pela ação da enzima no</p><p>substrato</p><p>YYYYYYY</p><p>(anticorpo)</p><p>+</p><p>●●●●●●</p><p>(antígeno proteico)</p><p>Caso o Ac estiver ligado a uma</p><p>partícula de látex resulta em</p><p>pptados</p><p>Técnicas baseadas em imunoglobulinas</p><p>Ensaios Líquidos</p><p>(ensaios homogêneos)</p><p>• Difração da luz</p><p>• Nefelometria</p><p>• turbidimetria</p><p>• Imunofluorescência</p><p>• Aglutinação</p><p>• Quimioluminescência</p><p>• Ensaios Sólidos</p><p>(ensaios heterogêneos)</p><p>• ELISA</p><p>• Competitivo</p><p>• Não-competitivo indireto</p><p>• RIA (radioimunoensaio)</p><p>Analisando as amostras</p><p>• Analisador automático</p><p>• Kit</p><p>• manual</p><p>A automação é uma saída ?</p><p>• Métodos Manuais em menor escala</p><p>• Forte uso da Automação</p><p>• Automação Operacional do laboratório total</p><p>ou parcialmente</p><p>• Empregando robótica e tecnologias</p><p>sofisticadas nas linhas de produção nas</p><p>etapas pré-analíticas como pós analíticas</p><p>(pipetadores, aliquoter, sorter, etc),</p><p>http://www.motoman.com/applications/labautomation/AutoSorterII.htm</p><p>http://www.motoman.com/applications/labautomation/AutoSorterI.htm</p><p>VANTAGENS DA AUTOMAÇÃO</p><p>• PARA AMPLIAR A VELOCIDADE DE</p><p>ALIQUOTAGEM E DISTRIBUIÇÃO DE</p><p>AMOSTRAS</p><p>• OTIMIZAR A EFICÁCIA NA MONTAGEM DE</p><p>ESTANTES DE TRABALHO E ROTINAS DE</p><p>TRABALHO</p><p>• FACILITANDO O ARMAZENAMENTO</p><p>• FAVORECENDO A RASTREABILIDADE</p><p>http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.pathologyinpractice.com/storyimages/ortho0505Fig2.jpg&imgrefurl=http://www.pathologyinpractice.com/story.asp%3Fid%3D72&h=140&w=250&sz=12&hl=pt-BR&start=2&um=1&tbnid=vm7S1Y2BIyfDHM:&tbnh=62&tbnw=111&prev=/images%3Fq%3Daliquoter%2Bin%2Bclinical%2Blaboratory%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dpt-BR</p><p>http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.torontosurplus.com/sci/DATA4140.JPG&imgrefurl=http://www.torontosurplus.com/sci/sci10.htm&h=481&w=300&sz=32&hl=pt-BR&start=49&um=1&tbnid=QzcRsxASJ6hkPM:&tbnh=129&tbnw=80&prev=/images%3Fq%3Dsystem%2Bpos%2Banalytical%2Bin%2Bclinical%2Blaboratory%26start%3D40%26ndsp%3D20%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DN</p><p>Amplificação de DNA pela reação em</p><p>cadeia da polimerase (PCR)</p><p>Amplificação de segmentos específicos de</p><p>DNA a partir de RNA-mensageiro (RT- PCR)</p><p>Detecção de seqüências específicas de</p><p>ácidos nucléicos –hibridização: é o</p><p>pareamento de bases entre fitas</p><p>complementares de DNA e RNA</p><p>Southern blotting: detecção de genes</p><p>específicos no DNA</p><p>Northern blotting: a detecção de RNA</p><p>Identificação de proteínas específicas</p><p>através de anticorpos: Estudos da</p><p>expressão e função gênica</p><p>tubo eppendorf colocado em</p><p>um aparelho termociclador</p><p>Seqüência específica do segmento de</p><p>DNA a ser amplificado, definida pelos</p><p>primers (B);</p><p>Primeira etapa da reação de PCR,</p><p>determinada pela temperatura entre</p><p>94º C e 98º C que promovem abertura</p><p>da fita de DNA (C);</p><p>o anelamento dos primers ocorre a</p><p>uma temperatura entre 50º C 60º C</p><p>(D);</p><p>a extensão de novos segmento de</p><p>DNA ocorre a 72º C, pela Taq DNA</p><p>polimerase (E);</p><p>produto final da reação de PCR após</p><p>30 a 40 ciclos (F).</p><p>Marcadores tumorais selecionados</p><p>• hormônios</p><p>• gonadotrofina coriônica humana: tumores trofoblásticos; tumores testiculares não-seminomatosos,</p><p>• calcitonina: carcinoma medular da tireóide,</p><p>• catecolamina e metabólitos: Feocromocitoma e tumores correlatos</p><p>• hormônios ectópicos: Síndromes paraneoplásicas</p><p>• Antígenos oncofetais alfa-fetoproteína:</p><p>• Câncer hepatocelular, tumores de células germinativas não-seminomatosos do testículo,</p><p>• antígeno carcinoembriônico, Carcinomas do cólon, pâncreas,</p><p>pulmão, estômago e mama</p><p>• isoenzimas</p><p>• fosfatase ácida prostática: câncer de próstata</p><p>• enolase neurônio-específica: câncer de pulmão de células pequenas, neuroblastoma</p><p>• proteínas específicas</p><p>• Imunoglobulinas: mieloma múltiplo e outras gamopatias</p><p>• antígeno próstata-específico: Câncer de próstata</p><p>Drogas de Abuso na Urina</p><p>• Analitos ou aplicações clínicas:</p><p>• - Anfetaminas e estimulantes</p><p>• - Barbitúricos</p><p>• - Cocaína e metabolitos</p><p>• - Canabinóides</p><p>• - Tranquilizantes menores (benzodiazepinas)</p><p>• - Drogas não – opiáceas</p><p>• - Opiáceos</p><p>• -Testes de integridade da amostra (creatinina, pH, densidade especifica e</p><p>• osmolalidade)</p><p>•</p><p>• Material distribuído:</p><p>• Alíquotas de 5 ou 15 ml de urina</p><p>High-performance liquid chromatography (or</p><p>High pressure liquid chromatography, HPLC)</p><p>http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hplc.JPG</p><p>http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a0/HPLC_apparatus.svg</p><p>http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hplc-perfume-chromatogram.png</p><p>http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hplc-perfume-chromatogram.png</p><p>Slide 1: Métodos em laboratório de análises clínicas</p><p>Slide 2</p><p>Slide 3</p><p>Slide 4</p><p>Slide 5: Intervalos de comprimento de onda no espectro eletromagnético</p><p>Slide 6</p><p>Slide 7</p><p>Slide 8</p><p>Slide 9</p><p>Slide 10</p><p>Slide 11: Imunoprecipitação: quando um Ag proteico solúvel combina com um aC formando complexo Ag-Ac insolúvel</p><p>Slide 12: Técnicas baseadas em imunoglobulinas</p><p>Slide 13: Analisando as amostras</p><p>Slide 14: A automação é uma saída ?</p><p>Slide 15: VANTAGENS DA AUTOMAÇÃO</p><p>Slide 16</p><p>Slide 17</p><p>Slide 18</p><p>Slide 19</p><p>Slide 20: Marcadores tumorais selecionados</p><p>Slide 21: Drogas de Abuso na Urina</p><p>Slide 22: High-performance liquid chromatography (or High pressure liquid chromatography, HPLC)</p><p>Slide 23</p>