COVID fertility II (1)

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<p>A Elsevier concede permissão para fazer todas as suas comunicações relacionadas à COVID-19</p><p>pesquisa disponível no centro de recursos da COVID-19 - incluindo esta</p><p>conteúdo de pesquisa - imediatamente disponível no PubMed Central e outros</p><p>concedido gratuitamente pela Elsevier enquanto o centro de recursos COVID-19 estiver em funcionamento</p><p>19. O centro de recursos COVID-19 está hospedado no Elsevier Connect, o</p><p>site público de notícias e informações da empresa.</p><p>informações gratuitas em inglês e mandarim sobre o novo coronavírus COVID-</p><p>Desde janeiro de 2020, a Elsevier criou um centro de recursos COVID-19 com</p><p>para reutilização irrestrita de pesquisas e análises em qualquer forma ou por qualquer meio</p><p>com reconhecimento da fonte original. Essas permissões são</p><p>repositórios financiados publicamente, como o banco de dados COVID da OMS com direitos</p><p>permanece ativo.</p><p>Machine Translated by Google</p><p>Instituto de Física e Tecnologia de Moscou (Universidade Nacional de Pesquisa), Cidade de Dolgoprudnyj, Moscou,</p><p>Centro de Pesquisa de Classe Mundial ''Biodesign Digital e</p><p>Academia de Saúde da Mulher e Cirurgia Endoscópica, Atlanta,</p><p>Cidade de OM FilatovAI Evdokimov Universidade Estadual de Medicina e Odontologia de Moscou, Moscou, Federação Russa; Hospital Clínico No.</p><p>15, Moscou, Federação Russa; Geórgia; Federação Russa;</p><p>Assistência</p><p>Médica Personalizada,''</p><p>Sechenov First Moscow State Medical University, Moscou, Federação Russa</p><p>OmicsWay Corp., Walnut, Califórnia; e</p><p>''Biodesign Digital e Assistência Médica Personalizada.'' AG não tem nada a revelar. AB relata</p><p>Fertil Steril Sci® Vol. 2, No. 4, novembro de 2021 2666-335X/$36,00</p><p>recebendo uma bolsa do Centro de Pesquisa de Classe Mundial ''Biodesign Digital e Personalização</p><p>para revelar. AD não tem nada a revelar. DD não tem nada a revelar. YA não tem nada a revelar.</p><p>número PRJNA722736.</p><p>Solicitações de reimpressão: Yana Aznaurova, MD, Departamento de Medicina Reprodutiva e Cirurgia, AI Ev-</p><p>dokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, 20b1 Delegatskaya St., Moscou,</p><p>M.So. não tem nada a revelar. M.Su. relata ter recebido uma bolsa do World-Class Research Center</p><p>Recebido em 28 de maio de 2021; revisado em 21 de julho de 2021; aceito em 27 de julho de 2021.</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021</p><p>quadro de apoio estatal para a criação e desenvolvimento de Centro de Pesquisa de Classe Mundial</p><p>LA não tem nada a revelar. VE não tem nada a revelar. VV não tem nada a revelar. AS não tem nada</p><p>Disponibilidade dos dados: Os dados originais de sequenciamento foram depositados no National Center for</p><p>Biotech-nology Information Sequencing Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) com adesão</p><p>''Biodesign Digital e Assistência Médica Personalizada'' No. 075-15-2020-926 (para AB e M.Su.).</p><p>355</p><p>Assistência médica.''</p><p>© 2021 American Society for Reproductive Medicine. Publicado pela Elsevier Inc. Todos os direitos reservados.</p><p>Com o apoio do Ministério da Ciência e Ensino Superior da Federação Russa no âmbito do</p><p>da COVID-19.</p><p>Paciente(s): Dez pacientes que se recuperaram de infecção leve por COVID-19. Oito desses pacientes apresentaram diferentes anormalidades no esperma</p><p>Contágio do covid-19.</p><p>que foram diagnosticados antes da infecção. O grupo de controle consistiu em 5 doadores saudáveis sem anormalidades conhecidas e sem histórico de</p><p>recuperou-se recentemente da infecção por COVID-19. (Fertil Steril Sci 2021;2:355–64. 2021 pela American Society for Reproductive Medicine.)</p><p>Desenho: Estudo de coorte observacional retrospectivo.</p><p>Andrew Garazha, M.Sc.,e e Anton Buzdin, Ph.Dd,e,f</p><p>incluindo genes envolvidos na cadeia de transferência de elétrons e genes envolvidos na sinalização do receptor toll-like. Todos os genes codificadores de proteínas</p><p>Cenário: Hospital da cidade.</p><p>codificados pelo genoma mitocondrial foram significativamente regulados negativamente em amostras de sêmen coletadas de pacientes após a recuperação</p><p>Palavras-chave: COVID-19, análise de expressão genética, vias moleculares, sequenciamento de RNA, esperma</p><p>Yana Aznaurova, MD, Ph.D.,a Maxim Sorokin, Ph.D.,d,e,f Maria Suntsova, Ph.D.,f Alexei Drobyshev, Ph.D.,f</p><p>amostras.</p><p>Assia Stepanian, MD, FACOG,c Anton Dashko, MD, Ph.D.,b Dmitriy Doroshenko, MD, Ph.D.,b</p><p>Objetivo: Investigar alterações transcricionais em amostras de sêmen humano associadas à infecção por COVID-19.</p><p>Resultado(s): Encontramos inibição estatisticamente significativa de genes associados às vias de produção de energia nas mitocôndrias,</p><p>Intervenção(ões): Usamos sequenciamento de RNA para determinar perfis de expressão gênica em todas as bioamostras estudadas. Instrumentos bioinformáticos</p><p>padrão originais foram usados para analisar a ativação de vias moleculares intracelulares.</p><p>Conclusão(ões): Nossos resultados podem fornecer uma base molecular para o fenômeno observado anteriormente de diminuição da motilidade espermática</p><p>associada à infecção por COVID-19. Além disso, os dados serão benéficos para a otimização do cuidado pré-concepcional para homens que têm</p><p>Leila Adamyan, MD, Ph.D.,a Vladimir Elagin, MD, Ph.D.,a,b Valeriy Vechorko, MD, Ph.D.,b</p><p>Principais medidas de resultado: Análise de rotina do sêmen, níveis de expressão genética e níveis de ativação da via molecular no sêmen</p><p>https://doi.org/10.1016/j.xfss.2021.07.004</p><p>amostras de sêmen humano</p><p>Discutir: Você pode discutir este artigo com seus autores e outros leitores em https://www.fertstertdialog.com/posts/xfss-d-21-00043</p><p>vias de acumulação de energia em</p><p>Inibição associada à COVID-19 de</p><p>As causas da infertilidade masculina são infecções</p><p>genitais, varicocele e</p><p>casos devido à infertilidade masculina. O principal</p><p>oligo-, asteno- e teratozoospermia.</p><p>a saúde reprodutiva é uma questão particularmente</p><p>milhões de casais enfrentam</p><p>o problema da infertilidade, com 40% de</p><p>Organização, mais de 100</p><p>De acordo com a Organização Mundial da Saúde</p><p>casos de fertilidade masculina (1). Assim,</p><p>investigar o impacto potencial da infecção pelo</p><p>novo coronavírus COVID-19 na fertilidade masculina</p><p>As doenças infecciosas são responsáveis por 15% das</p><p>A infecção leve por COVID-19 não está</p><p>associada a comprometimento da função do</p><p>De acordo com Holtmann et al. (2),</p><p>tópico relevante.</p><p>c</p><p>e</p><p>um b</p><p>e</p><p>e</p><p>127473, Federação Russa (E-mail: yanaaznaurova@gmail.com).</p><p>Machine Translated by Google</p><p>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</p><p>https://doi.org/10.1016/j.xfss.2021.07.004</p><p>https://www.fertstertdialog.com/posts/xfss-d-21-00043</p><p>mailto:yanaaznaurova@gmail.com</p><p>MATERIAIS E MÉTODOS</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021356</p><p>A análise de uma ampla gama de anormalidades moleculares no sêmen de</p><p>pacientes com infecção por COVID-19 pode revelar os mecanismos</p><p>potenciais da influência do SARS-CoV-2 na fertilidade masculina e pode ser</p><p>usada para otimizar o plano de tratamento para esses pacientes.</p><p>Hajizadeh Maleki e Tartibian (5) investigaram amostras de sêmen de</p><p>84 pacientes que se recuperaram da infecção por COVID-19 e 105 controles.</p><p>O sêmen dos pacientes foi analisado a cada 10 dias por 2 meses. Os</p><p>pesquisadores encontraram diminuições estatisticamente significativas no</p><p>volume de ejaculação, motilidade espermática</p><p>e concentração de</p><p>espermatozoides e mudanças na morfologia espermática nos pacientes com</p><p>COVID-19. É interessante notar que a análise do sêmen em 30, 40, 50 e 60</p><p>dias após a infecção por COVID-19 revelou um aumento progressivo na</p><p>motilidade espermática. O estudo também descobriu que o volume de</p><p>ejaculação, a morfologia espermática e a concentração de espermatozoides</p><p>no ejaculado não mudaram durante todo o período de observação (5).</p><p>testículos e epidídimo, enquanto pacientes com infecção moderada por</p><p>COVID-19 apresentam alterações nos parâmetros do sêmen: diminuição da</p><p>concentração de espermatozoides, diminuição do número total de</p><p>espermatozoides no ejaculado e diminuição da motilidade dos</p><p>espermatozoides. Ma et al. (3) encontraram os seguintes parâmetros</p><p>anormais do sêmen em pacientes que se recuperaram da infecção por</p><p>COVID-19: aumento da taxa de fragmentação do DNA e diminuição da</p><p>motilidade dos espermatozoides. Vários outros estudos descreveram casos</p><p>de diminuição da libido e perda da ereção matinal em pacientes com infecção</p><p>por COVID-19. Ruan et al. (4) encontraram diminuição da concentração e</p><p>motilidade dos espermatozoides em pacientes com infecção por COVID-19</p><p>a partir da análise dos parâmetros do sêmen de 55 pacientes e 145</p><p>controles.</p><p>Neste estudo, traçamos o perfil da expressão gênica em amostras de</p><p>sêmen obtidas de 10 pacientes após infecção leve por COVID-19.</p><p>O Comitê de Ética Biomédica do World-Class Medical Center, Moscou (Institutional</p><p>Review Board) aprovou todos os procedimentos e métodos de estudo. Consentimento</p><p>informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo. O estudo</p><p>Os critérios de inclusão foram homens sexualmente ativos em idade</p><p>reprodutiva (18 a 65 anos) com recuperação comprovada de infecção leve</p><p>por COVID-19 por 2 swabs nasofaríngeos negativos consecutivos para</p><p>RNA do SARS-CoV-2. A gravidade da infecção por COVID-19 foi classificada</p><p>de acordo com a diretriz da Organização Mundial da Saúde, que define</p><p>infecção leve por COVID-19 como infecção sem evidência de pneumonia</p><p>viral ou hipóxia (6).</p><p>Análises laboratoriais de rotina foram realizadas com kits disponíveis</p><p>comercialmente. Os intervalos de referência do laboratório foram 8,33–30,19</p><p>nmol/L para testosterona, 0,95–11,95 UI/L para FSH e 0,57–12,07 UI/L para</p><p>LH.</p><p>Os pacientes queixaram-se de febre (38,5 °C por 3 dias) e fadiga. Nenhum</p><p>tratamento foi administrado, exceto paracetamol 500 mg. Os critérios de</p><p>exclusão foram distúrbios ejaculatórios, histórico de cirurgia de próstata,</p><p>tratamento com medicamentos anti-hipertensivos e incapacidade de</p><p>expressar consentimento informado. O diagnóstico de infecção por COVID-19</p><p>foi confirmado pela presença de RNA do SARS-CoV-2 em um swab</p><p>nasofaríngeo detectado por teste molecular (reação em cadeia da polimerase</p><p>de transcrição reversa) de acordo com os registros médicos.</p><p>O grupo 2 consistiu em 5 pacientes que se recuperaram de infecção</p><p>leve por COVID-19 e forneceram amostras de sêmen após recuperação</p><p>comprovada. Quatro pacientes neste grupo também apresentaram diferentes</p><p>anormalidades no esperma antes da infecção. A inclusão desses pacientes</p><p>no estudo nos permitiu determinar se eles precisavam de tratamento adicional</p><p>antes da fertilização in vitro. O grupo 3 consistiu em 5 controles saudáveis.</p><p>Os participantes foram divididos em 3 grupos de acordo com o tempo de</p><p>coleta da amostra. O grupo 1 consistiu em 5 pacientes que se recuperaram</p><p>de infecção leve por COVID-19 e forneceram amostras de sêmen antes da</p><p>infecção e após recuperação comprovada (10 amostras no total). As</p><p>amostras de sêmen desses pacientes foram armazenadas antes da infecção</p><p>por COVID-19, pois estavam se preparando para fertilização in vitro (FIV).</p><p>Quatro pacientes neste grupo apresentaram diferentes anormalidades no</p><p>esperma antes da infecção. A inclusão desses pacientes no estudo nos</p><p>permitiu determinar se eles precisavam de tratamento adicional antes da FIV.</p><p>Informações sobre os níveis séricos de testosterona, hormônio folículo-</p><p>estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH) foram obtidas dos prontuários</p><p>médicos dos pacientes.</p><p>Todos os pacientes tinham diferentes anormalidades no esperma que foram</p><p>diagnosticadas antes da infecção. Também fomos capazes de traçar o perfil</p><p>dos espécimes de sêmen de 5 pacientes obtidos antes da infecção, dando</p><p>assim 5 pares de amostras correspondentes antes e depois da infecção por</p><p>COVID-19. Como grupo de controle, incluímos 5 doadores saudáveis sem</p><p>anormalidades conhecidas ou histórico prévio de infecção por COVID-19.</p><p>Usamos sequenciamento de RNA para estabelecer perfis de expressão</p><p>gênica nessas 20 bioamostras.</p><p>O RNA foi extraído de amostras de sêmen com o QIAGEN</p><p>Kit Mini Universal RNeasy Plus (Qiagen, Germantown, MD)</p><p>A análise de ontologia genética de genes regulados diferencialmente e o</p><p>estudo aprofundado da ativação de vias moleculares revelaram inibição</p><p>estatisticamente significativa de genes associados a vias de receptores Toll-</p><p>like (TLR) e a vias de produção de energia nas mitocôndrias, incluindo genes</p><p>envolvidos na cadeia de transferência de elétrons. Além disso, todos os</p><p>genes codificadores de proteínas codificados pelo genoma mitocondrial</p><p>foram significativamente regulados negativamente em amostras pós-</p><p>infecção. Essa descoberta pode fornecer uma base molecular para o</p><p>fenômeno observado anteriormente de diminuição da motilidade dos</p><p>espermatozoides após a infecção por COVID-19.</p><p>foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, 1975.</p><p>População e desenho do estudo</p><p>Isolamento e sequenciamento de RNA</p><p>Coleta de Bioamostras Os</p><p>participantes receberam instruções claras sobre a coleta de suas amostras</p><p>de sêmen em um recipiente estéril após pelo menos 2 dias de abstinência</p><p>sexual (mas não mais do que 5 a 7 dias). Todos os pacientes incluídos no</p><p>estudo forneceram amostras de sêmen no hospital. Amostras de sêmen de</p><p>pacientes nos grupos COVID-19 foram coletadas em menos de 75 dias após</p><p>a recuperação comprovada da infecção.</p><p>ARTIGO ORIGINAL: BIOLOGIA DOS GAMETAS</p><p>Declaração ética</p><p>Machine Translated by Google</p><p>RESULTADOS</p><p>57 genes significativamente regulados negativamente e, notavelmente, nenhum</p><p>gene regulado positivamente após a infecção (Fig. 1A). Destes</p><p>C1QA, C1QB, CCL2, CCR1, CSF3R, CXCL2, CXCL8, CXCR4,</p><p>(Fig. 1B). Testamos ainda mais a significância desta intersecção cruzando</p><p>repetidamente conjuntos de genes aleatórios do</p><p>Primeiro, realizamos uma análise de expressão gênica diferencial entre réplicas</p><p>do paciente P4. Isso resultou em 5.411 e</p><p>amostras em uma execução de sequenciamento. Concentrações de biblioteca e</p><p>padrões e um maior grau de heterogeneidadeComprimento de leitura de 75 pb, para aproximadamente 30 milhões de leituras brutas</p><p>coletados após a recuperação da infecção por COVID-19 estavam disponíveis</p><p>para análise posterior.</p><p>análise para todos os 5 pares de amostras correspondentes obtidas antes</p><p>milhões. A análise da expressão</p><p>gênica diferencial foi realizada</p><p>para verificar nossos perfis de transcrição quanto à presença de leituras</p><p>específicas do SARS-CoV-2 e não encontramos tais chamadas em nenhuma amostra</p><p>COVID-19 antes da coleta da amostra. Essas amostras foram</p><p>concentração. O número de integridade do RNA foi medido</p><p>(8). Os gráficos de vulcões foram construídos com o uso do pacote R</p><p>''EnhancedVol-cano'' (9). A análise de ontologia genética (GO) foi realizada</p><p>com o pacote R ''enrichgo'' (10). Caminho</p><p>tanto no dendrograma (Fig. 1A suplementar, disponível on-line) quanto nos</p><p>gráficos de análise de componentes principais</p><p>mudança| o corte foi definido como maior que 1. A análise resultou em</p><p>Infecção por COVID-19 (Tabela Suplementar 1, disponível online).</p><p>www.genenames.org/; versão do banco de dados de 13 de julho,</p><p>amostras biológicas pré e pós-infecção estavam disponíveis em triplicado,</p><p>e ativador da via de transcrição degradação da Janus quinase e alongamento</p><p>da cadeia peptídica como os mais significativos</p><p>(10 amostras no total). Para outros 5 pacientes, apenas bioamostras</p><p>Em seguida, realizamos a expressão diferencial do gene (DEG)</p><p>mostrado na Tabela Suplementar 2. Utilizamos o programa fastv</p><p>para as bioamostras estudadas, com valor médio de 21,66</p><p>Os seguintes genes foram significativamente regulados negativamente em</p><p>ambos os tipos de análise DEG: AIF1, APOC1,</p><p>MT-ATP8, MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3, MT-CYB, MT-</p><p>ser obtido por acaso (P<.001).</p><p>atividade do transportador, atividade do canal iônico, matriz extracelular e</p><p>outros (Fig. 3 suplementar). Análise de ontologia genética</p><p>Os arquivos FASTQ de sequenciamento de RNA foram processados com STAR</p><p>(Agilent, Santa Clara, CA). O sequenciamento de RNA foi feito com</p><p>equipamento Il-lumina NextSeq 550 para sequenciamento de extremidade única,</p><p>para símbolos genéticos do Comitê de Nomenclatura Genética HUGO (HGNC)</p><p>com o uso do conjunto de dados completo do HGNC (https://</p><p>Programa Bcl2fastq2 v 2.17.</p><p>obtidos de doadores saudáveis que não foram afetados por</p><p>O corte do valor P ajustado foi definido em 0,05 e o |log2 vezes</p><p>taxa de descoberta ajustada P<.05 e |log2(mudança de dobra)|>1</p><p>genes obtidos previamente na análise de réplicas P4</p><p>enquanto as amostras pós-infecção mostraram agrupamentos distintos</p><p>somente) foi usado. Diferentes adaptadores foram usados para multiplexação</p><p>amostras de pacientes com diferentes anormalidades espermáticas</p><p>diagnosticadas antes da infecção por COVID-19 e após recuperação</p><p>comprovada. Todos os pacientes nos grupos 1 e 2 sofreram de leve</p><p>(Fig. 4 suplementar). O ensaio quantitativo de ativação da via molecular</p><p>revelou a Janus quinase e o transdutor de sinal</p><p>antes e depois da infecção estavam disponíveis para 5 pacientes</p><p>(Fig. 5 suplementar).</p><p>o número mínimo de leituras mapeadas exclusivamente foi de 5,66 milhões</p><p>obteve 24 perfis de RNAseq; as estatísticas de mapeamento são</p><p>As réplicas das bioamostras P4 formaram aglomerados distintos</p><p>IGSF6, IL1B, LAPTM5, LYZ, MNDA, MPEG1, MT-ATP6,</p><p>genes que se cruzaram aleatoriamente (Fig. 1C). A análise de aleatoriedade</p><p>mostrou que a intersecção real observada não poderia</p><p>A análise da ontologia genética de genes regulados positivamente revelou</p><p>processos biológicos associados à transmembrana de cátions</p><p>(Life Technologies, Eugene, OR) e Agilent TapeStation</p><p>seguindo o protocolo do fabricante. Os kits de ensaio de RNA RNA 6000 Nano</p><p>(Agi-lent, Santa Clara, CA) ou Qubit RNA (Life Technologies, Bleiswijk,</p><p>Holanda) foram usados para medir o RNA</p><p>amostras de sêmen mencionadas. Para um paciente (ID P4), ambos</p><p>Neste estudo, comparamos perfis de expressão gênica no sêmen</p><p>ligação de nucleosídeos e metabolismo energético celular</p><p>anotação GRCh38.89) (7). Os IDs dos genes Ensembl foram convertidos</p><p>por amostra. A demultiplexação foi realizada com o Illumina</p><p>com kit de apagamento de rRNA (KAPA, Cidade do Cabo, África do Sul) (HMR</p><p>57 genes, 52 eram idênticos ao diferencial regulado negativamente</p><p>12). Verificamos todas as amostras biológicas quanto à presença de leituras</p><p>específicas do SARS-CoV-2 com o utilitário fastv (13).</p><p>e amostras de doadores saudáveis também tendem a se agrupar,</p><p>mesmos tamanhos 1.000 vezes e registrando os números de</p><p>3.846 genes significativamente regulados para baixo e para cima,</p><p>respectivamente (Tabela Suplementar 3 e Figura Suplementar 2).</p><p>(Fig. 1 suplementar).</p><p>a qualidade foi medida com o kit Qubit ds DNA HS Assay</p><p>Outras características clínicas dos pacientes, incluindo perfis hormonais, são</p><p>apresentadas na Tabela Suplementar 1. Amostras biológicas coletadas</p><p>Além disso, incluímos 5 amostras de sêmen de arquivo de controle</p><p>Infecção por COVID-19 e após recuperação comprovada da infecção.</p><p>testado (13).</p><p>com o software DESeq2 com os seguintes limites: falso</p><p>FCER1G, FGR, HCK, HLA-DRA, HMOX1, IFI44, IFI44L,</p><p>(Fig. 1B suplementar). Amostras obtidas antes da infecção</p><p>os níveis de ativação e a visualização correspondente foram realizados com o</p><p>software Oncobox e coleta de vias (11,</p><p>Realizamos sequenciamento de RNA (RNAseq) de todos</p><p>com um Agilent 2100 Bio-Analyzer. Para depleção de RNA ribossômico e</p><p>construção de biblioteca, o KAPA RNA Hyper</p><p>alinhador no modo ''GeneCounts'' com a anotação do transcriptoma humano</p><p>Ensembl (versão de compilação GRCh38 e transcrição</p><p>de genes regulados negativamente identificaram processos associados a</p><p>2017). Os níveis de expressão foram estabelecidos para 36.596 genes</p><p>anotados com os identificadores HGNC correspondentes.</p><p>e realizamos RNAseq para todas as bioamostras. No total,</p><p>vias reguladas para cima e para baixo, respectivamente, em amostras pós-</p><p>infecção P4 normalizadas em amostras antes da infecção</p><p>usado como coorte de referência para as análises moleculares.</p><p>Análise pareada</p><p>Análise de DEGs comuns</p><p>Análise Bioinformática</p><p>Fertil Estéril Sci®</p><p>357VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021</p><p>Machine Translated by Google</p><p>https://www.genenames.org/</p><p>https://www.genenames.org/</p><p>Adamyan. COVID-19 e expressão genética no sêmen. Fertil Steril Sci 2021.</p><p>Diagrama de Venn mostrando a intersecção de DEGs regulados negativamente de 2 análises: amostras correspondentes de pacientes P1–P5 antes da COVID-19 e</p><p>após recuperação comprovada, e triplicatas de bioamostras de pacientes P4 antes e depois da infecção pela COVID-19. (C) Distribuição de genes sobrepostos para</p><p>grupos selecionados aleatoriamente (1.000 permutações aleatórias). A linha tracejada vermelha denota o número real de DEGs regulados negativamente interseccionados.</p><p>(D) Termos GO significativamente enriquecidos para o conjunto interseccionado de DEGs regulados negativamente (n ¼ 52). Todos os termos passaram pelo limite de</p><p>valor P ajustado de Benjamini-Hochberg de 0,05. DEG ¼ gene expresso diferencialmente; FC ¼ alteração de dobra; GO ¼ ontologia genética; NADH ¼ nicotinamida</p><p>adenina dinucleotídeo; NAD(P)H ¼ nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; RAGE ¼ receptor específico do produto final de glicosilação avançada.</p><p>(A) Distribuição de DEGs entre amostras P1, P2, P3, P4 (média) e P5 antes da COVID-19 e após recuperação comprovada</p><p>por alteração de log2 vezes e valor de P</p><p>log10. O corte do valor de P ajustado foi definido em 0,05, e o corte de |alteração de log2 vezes| foi definido maior que 1. (B e C) Intersecção de DEGs. (B)</p><p>FIGURA 1</p><p>ARTIGO ORIGINAL: BIOLOGIA DOS GAMETAS</p><p>358 VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021</p><p>Machine Translated by Google</p><p>expressão não significativa de ACE2 e TMPRSS2 nestes</p><p>porque coexpressa os receptores para ACE2 e TMPRSS2,</p><p>RNA do SARS-CoV-2 em nossas amostras pós-infecção.</p><p>Os termos GO foram associados à redução da nicotinamida adenina</p><p>infecção. Calculamos as mudanças de dobra nos níveis hormonais</p><p>níveis de ativação para 3.044 vias moleculares. Usando o</p><p>que a expressão cumulativa foi significativamente menor em</p><p>Wang e Xu (21) descobriram que a expressão dos genes responsáveis pela</p><p>espermatogênese diminuiu nas espermatogônias</p><p>Anteriormente, a expressão de NRF2 (NFE2L2), ROPN1I, CA-BYR, FAM71D,</p><p>RBMY1 (RBMY1A1) e sNHE (SLC9A1)</p><p>a via de sinalização do interferon gama (IFN-g) (Fig. 2B),</p><p>teste) (Fig. 4N).</p><p>MT-ND6, MT1A, NDUFB8, PI3, POLR2K, RGS1, RPL39,</p><p>regulado negativamente em amostras pós-infecção em comparação comsubvias continham conjuntos de genes idênticos, o que explica</p><p>pacientes com infecção por COVID-19, possivelmente devido à</p><p>Huang et al. (23), coexpressão de ACE2 e TMPRSS2 em</p><p>genes entre amostras pós-infecção vs. doadores saudáveis e</p><p>encontrado entre a expressão cumulativa de todos os genes mitocondriais e</p><p>LH, testosterona, prolactina ou estradiolamostra de infecção, um padrão específico de ativação da via foi</p><p>De acordo com a literatura, o novo coronavírus SARS-CoV-2</p><p>a expressão cumulativa de 13 genes mitocondriais somando os logaritmos</p><p>das contagens de genes normalizadas. Nós encontramos</p><p>descobriram que ACE2 era predominantemente expresso em espermatogônias,</p><p>células de Leydig e células de Sertoli e TMPRSS2 era predominantemente</p><p>expresso em espermatogônias e espermátides.</p><p>associado à motilidade dos espermatozoides, de acordo com estudos anteriores.interrogado. A via mais fortemente regulada foi</p><p>O tecido testicular também pode ser um alvo para o SARS-CoV-2</p><p>a expressão também foi detectada em células espermatogênicas e células</p><p>somáticas dos testículos, o que indica uma alta suscetibilidade</p><p>expressão dos 13 genes mitocondriais em comparação com os níveis pré-</p><p>infecção. No entanto, tanto a linha de base quanto a pós-infecção</p><p>amostras coletadas após recuperação da infecção por COVID-19</p><p>pacientes e diminuiu em 5 pacientes após a infecção por COVID-19. No</p><p>entanto, nenhum dos níveis de FSH antes ou depois da infecção excedeu os</p><p>intervalos de referência. Curiosamente, observamos</p><p>Em seguida, usamos o software Oncobox para calcular o caminho</p><p>Fig. 6). Vale ressaltar que não foram encontradas correlações</p><p>amostra de infecção normalizada na média pré-COVID-19</p><p>teste) (Fig. 4N) e amostras de doadores saudáveis (P ¼ .001, t</p><p>Pan et al. (22) não detectaram SARS-CoV-2 no sêmen de</p><p>enquanto a expressão de TP53 e HIF1A foi negativamente correlacionada</p><p>com a motilidade dos espermatozoides (14–19). CABYR e FAM71D foram</p><p>os grupos para outros genes (Fig. 7C a H suplementar).</p><p>Características de pacientes que se recuperaram da COVID-19</p><p>concordando com o estudo de Pan et al. (22), não detectamos</p><p>para este conjunto de genes são mostrados na Figura 1D. Os mais significativos</p><p>Em seguida, comparamos a expressão de todas as mitocôndrias</p><p>pelo genoma mitocondrial.</p><p>A serina protease transmembrana tipo 2 é amplamente expressa em</p><p>espermatogônias e espermátides. De acordo com</p><p>Expressão do gene MT-ND6 em amostras pós-infecção em comparação com</p><p>doadores saudáveis (Fig. 4M). Também calculamos</p><p>Padrões de expressão de ACE2 e TMPRSS2 em pacientes do sexo masculino</p><p>Por fim, investigamos os níveis de expressão dos genesfoi maior do que a extensão da regulação positiva das vias</p><p>,</p><p>ramos da via de sinalização endógena TLR: regulação da produção de</p><p>interleucina-1-beta, regulação da proliferação celular e regulação da</p><p>apoptose. Os últimos 3</p><p>vírus (21). Receptor da enzima conversora de angiotensina tipo 2</p><p>de 13 (100%) genes codificadores de proteínas codificados no genoma</p><p>mitocondrial foram significativamente regulados negativamente após a</p><p>infecção. Em todas as 5 amostras pareadas, observamos diminuição</p><p>(Tabela Suplementar 1). O nível de FSH foi aumentado em 5</p><p>ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5,</p><p>ligação e ligação de ácidos graxos.</p><p>A segunda via mais fortemente regulada negativamente no sêmen</p><p>(Fig. 3B).</p><p>os nós Complexo I e Complexo IV (Fig. 3A). Esses complexos contêm 7 e 3</p><p>genes, respectivamente, que são codificados</p><p>conjunto de 52 genes interseccionados na média pós-COVID-19</p><p>alteração de dobra e a expressão cumulativa de todos os genes mitocondriais</p><p>(P ¼ .067, teste de Spearman) (Suplemento</p><p>perfil de transcrição.</p><p>TGFBI, TNFRSF1B e TYROBP. Os resultados da análise GO</p><p>genes mitocondriais foram associados às características clínicas</p><p>células. No entanto, os investigadores não excluíram a possibilidade da</p><p>presença de SARS-CoV-2 no sêmen de pacientes na fase aguda da infecção</p><p>por COVID-19. Em</p><p>Fig. 7A e B). Não houve diferenças significativas entre</p><p>com os resultados da análise dos termos GO (Fig. 1D).</p><p>Em seguida, analisamos os genes mitocondriais e descobrimos que 13</p><p>antes e depois da infecção por COVID-19 em 10 pacientes</p><p>atividade da dinucleotídeo desidrogenase, seguida pela citocina</p><p>para</p><p>amostras de pré-infecção (Fig. 4). Todas as comparações de grupos foram</p><p>significativas (Fig. 4A–L), exceto pela significância limítrofe de</p><p>pós-infecção do que em amostras de pré-infecção (P ¼ 7,1*105</p><p>foi demonstrado que está positivamente correlacionado com a motilidade dos espermatozoides,</p><p>e as vias mais fortemente reguladas negativamente foram 3</p><p>com alta expressão de ACE2.</p><p>que são necessárias para a invasão e posterior replicação do</p><p>a identidade dos seus níveis de ativação da via (Fig. 2C). No entanto, a</p><p>próxima via regulada negativamente foi para a cadeia de transferência de</p><p>elétrons respiratória, o que está em bom acordo</p><p>níveis antes da infecção e em doadores saudáveis (Suplemento</p><p>dos testículos aos danos causados pelo SARS-CoV-2 e à espermatogênese</p><p>prejudicada, o que por sua vez pode ter um impacto na produção de espermatozoides</p><p>S100A8, S100A9, SAMSN1, SDS, SOCS3, SPN, SRGN,</p><p>uma correlação negativa significativa limítrofe entre FSH</p><p>entra nas células através da interação com o receptor da enzima conversora</p><p>de angiotensina tipo 2 (ACE2) e a serina protease transmembrana tipo 2</p><p>(TMPRSS2) (20). Análise de</p><p>níveis.obtido (Fig. 2A). No geral, a extensão da regulação negativa</p><p>foi a via de transporte de elétrons respiratórios. A visualização detalhada da</p><p>via mostrou que os genes mais regulados negativamente em amostras pós-</p><p>infecção estavam envolvidos em</p><p>os níveis eram altamente heterogêneos entre os diferentes pacientes</p><p>Além disso, levantamos a hipótese de que o nível de expressão de</p><p>DISCUSSÃO</p><p>Expressão gênica mitocondrial</p><p>Fertil Estéril Sci®</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021 359</p><p>Machine Translated</p><p>by Google</p><p>Adamyan. COVID-19 e expressão genética no sêmen. Fertil Steril Sci 2021.</p><p>(A) As 10 principais vias reguladas positivamente e inibidas, classificadas por valores PAL estatisticamente significativamente diferentes para comparação</p><p>entre amostras obtidas antes e depois da infecção por COVID-19. As vias reguladas positivamente após a recuperação da infecção por COVID-19 são</p><p>mostradas na parte superior, as vias reguladas negativamente após a recuperação na parte inferior. O valor P do teste t e o valor PAL para cada via são</p><p>mostrados à direita. (B) Esquema de ativação da via de sinalização do interferon gama do reactome. A cor indica a razão transformada em log2 dos valores</p><p>médios de expressão gênica para cada nó da via em amostras após a recuperação da infecção por COVID-19 normalizada em níveis de expressão em</p><p>amostras antes da infecção. (C) Esquema de ativação da via de sinalização TLR endógena NCI (regulação da produção de interleucina-1-b, regulação da</p><p>proliferação celular e regulação da apoptose). A cor indica a razão transformada em log2 dos valores médios de expressão gênica para cada nó da via em</p><p>amostras após a recuperação da infecção por COVID-19 normalizada em níveis de expressão em amostras antes da infecção. ATP ¼ adenosina trifosfato;</p><p>FC ¼ alteração de dobra; IFNG ¼ interferon gama; IFNGR ¼ receptor de interferon gama; IL ¼ interleucina; JAK ¼ Janus quinase; KEGG ¼ Enciclopédia</p><p>de Genes e Genomas de Kyoto; NCI ¼ Instituto Nacional do Câncer; PAL ¼ nível de ativação da via; PKC ¼ proteína quinase C; SHP ¼ fosfatase-1</p><p>contendo domínio da região de homologia Src 2; SOCS ¼ supressor da sinalização de citocina; STAT ¼ transdutor de sinal e ativador da transcrição; TLR</p><p>¼ receptor do tipo toll.</p><p>FIGURA 2</p><p>ARTIGO ORIGINAL: BIOLOGIA DOS GAMETAS</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021360</p><p>Machine Translated by Google</p><p>Adamyan. COVID-19 e expressão genética no sêmen. Fertil Steril Sci 2021.</p><p>(A) Esquema de ativação da via de transporte de elétrons respiratórios. A cor indica a razão transformada em log2 dos valores médios de expressão gênica em amostras</p><p>após a recuperação da infecção por COVID-19 normalizada na expressão gênica em amostras antes da infecção por COVID-19. (B) Mapa de calor de genes mitocondriais</p><p>que foram expressos diferencialmente na análise pareada de amostras P1, P2, P3, P4 (média) e P5. O marcador de cor à esquerda indica IDs de pares de pacientes</p><p>correspondentes e status de infecção pré/pós-COVID-19 das amostras. COX ¼ citocromo c oxidase; ETF ¼ flavoproteína de transferência de elétrons; ETFDH ¼</p><p>flavoproteína desidrogenase de transferência de elétrons; FADH ¼ flavina adenina dinucleotídeo; FC ¼ alteração de dobra; NADH ¼ nicotinamida adenina dinucleotídeo.</p><p>FIGURA 3</p><p>Fertil Estéril Sci®</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021 361</p><p>Machine Translated by Google</p><p>Adamyan. COVID-19 e expressão genética no sêmen. Fertil Steril Sci 2021.</p><p>do hipotálamo estimula a produção de FSH e</p><p>em nosso estudo.</p><p>pacientes tiveram análise de esperma pior após infecção por COVID-19</p><p>enquanto o LH estimula a liberação de testosterona pelo Leydig</p><p>células podem potencialmente contribuir para a interrupção da produção</p><p>de testosterona pelos testículos. No entanto, apenas 5 de 10 pacientes</p><p>Normalmente, o hormônio liberador de gonadotrofina é liberadoBasigin e protease catepsina L, que podem mediar a invasão de células</p><p>pelo SARS-CoV-2, também foram encontrados em células de Leydig</p><p>(23). Portanto, a replicação do SARS-CoV-2 em células de Leydig</p><p>espermatogônias e células de Leydig podem ser um fator de risco para</p><p>degeneração testicular e infertilidade masculina. Receptor alternativo</p><p>então estimula a espermatogênese nas células de Sertoli,</p><p>LH pela hipófise anterior. Hormônio folículo-estimulante</p><p>contagens de genes) em amostras de pacientes antes da infecção por COVID-19, pacientes após a recuperação da infecção por COVID-19 e doadores saudáveis.</p><p>Expressão de 13 genes codificadores de proteínas codificados no genoma mitocondrial e sua expressão cumulativa (soma de log-transformados normalizados</p><p>FIGURA 4</p><p>ARTIGO ORIGINAL: BIOLOGIA DOS GAMETAS</p><p>VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021362</p><p>Machine Translated by Google</p><p>LIMITAÇÕES</p><p>363VOL. 2 Nº 4 / NOVEMBRO 2021</p><p>De acordo com esta observação, Ma et al. (3) relataram níveis</p><p>aumentados de LH em pacientes do sexo masculino com infecção por</p><p>COVID-19, e Cayan et al. (26) relataram diminuição da testosterona e níveis</p><p>elevados de LH e FSH em pacientes do sexo masculino com infecção por</p><p>COVID-19 e até mostraram que a diminuição dos níveis de testosterona</p><p>células. Por sua vez, o nível crescente de testosterona inibe a liberação do</p><p>hormônio liberador de gonadotrofina, FSH e LH por meio de um ciclo de</p><p>feedback negativo. Em casos de hipogonadismo primário, quando o nível</p><p>de testosterona é insuficiente, os níveis de hormônio liberador de</p><p>gonadotrofina, FSH e LH aumentam para compensar.</p><p>foram associados à gravidade da infecção por COVID-19.</p><p>A produção de FSH foi associada à diminuição da expressão de genes</p><p>mitocondriais em amostras pós-infecção.</p><p>Neste momento, até onde sabemos, nosso estudo de expressão genética</p><p>em amostras de sêmen é o primeiro e o maior realizado em pacientes com</p><p>histórico de infecção por COVID-19.</p><p>No entanto, estudos adicionais em grupos maiores de pacientes com e sem</p><p>histórico de infecção por COVID-19 são necessários para obter resultados</p><p>mais precisos.</p><p>Pacientes que se recuperaram de uma infecção leve por COVID-19</p><p>Em 2 pacientes que se recuperaram da infecção por COVID-19, a</p><p>análise do sêmen encontrou resultados completamente normais</p><p>(normozoospermia), incluindo motilidade normal dos espermatozoides. No</p><p>entanto, nossos resultados demonstraram expressão estatisticamente</p><p>significativamente diminuída de genes mitocondriais em suas amostras de</p><p>sêmen. Como em outras células, os principais papéis das mitocôndrias em</p><p>células espermáticas incluem produção de energia, absorção de cálcio e</p><p>início de apoptose, enquanto a energia gerada é usada para motilidade</p><p>espermática, capacitação e reação acrossômica (37, 38). Numerosos</p><p>estudos mostraram que a expressão de genes mitocondriais está claramente</p><p>correlacionada com parâmetros importantes do esperma, incluindo motilidade</p><p>e contagem de espermatozoides (39).</p><p>Neste estudo, também encontramos inibição estatisticamente</p><p>significativa de genes associados a vias de produção de energia nas</p><p>mitocôndrias, incluindo genes envolvidos na cadeia de transferência de</p><p>elétrons, em amostras de sêmen de pacientes que se recuperaram da</p><p>infecção por COVID-19. Além disso, todas as proteínas</p><p>Além disso, a disfunção mitocondrial pode estar associada ao estresse</p><p>oxidativo, que causa danos ao esperma mediados por espécies reativas de</p><p>oxigênio (40). Nossas descobertas indicam que, mesmo no caso de</p><p>parâmetros normais de esperma determinados pela análise de sêmen de</p><p>rotina em pacientes que se recuperaram da infecção por COVID-19, a</p><p>expressão de genes mitocondriais pode ser significativamente</p><p>diminuída.</p><p>Isso pode estar associado à disfunção do esperma e à fertilidade masculina.</p><p>Nossos resultados fornecem uma base molecular para o fenômeno observado</p><p>anteriormente de diminuição da motilidade do esperma associado à infecção</p><p>por COVID-19. Acreditamos que nossas descobertas serão benéficas para</p><p>a otimização do cuidado pré-concepcional para homens que se recuperaram</p><p>recentemente da infecção por COVID-19.</p><p>Além disso, a via da interleucina 10 foi regulada positivamente em amostras</p><p>obtidas após a infecção por COVID-19. Kurkowska et al. (36) mostraram que</p><p>a interleucina 10 elevada estava associada à motilidade reduzida dos</p><p>espermatozoides no sêmen normal, o que está de acordo com descobertas</p><p>anteriores.</p><p>As vias mais fortemente reguladas negativamente após a recuperação</p><p>da infecção por COVID-19 estão associadas à regulação da produção de</p><p>interleucina-1-beta, proliferação celular e apoptose (3 ramos da via de</p><p>sinalização TLR endógena). Os receptores Toll-like desempenham um papel</p><p>crítico na imunidade inata, incluindo a proteção de células espermáticas</p><p>contra infecções.</p><p>Os genes CABYR e FAM71D, que anteriormente demonstraram estar</p><p>correlacionados com a motilidade dos espermatozoides, apresentaram</p><p>expressão diminuída em amostras pós-infecção no estudo atual.</p><p>Saedi et al. (35) relataram a expressão dos genes para TLRs 1–10 nos</p><p>testículos, vasos deferentes, próstata, epidídimo e células espermáticas</p><p>(35). No entanto, mais pesquisas precisam ser feitas para investigar o</p><p>impacto dos TLRs nos parâmetros espermáticos.</p><p>No entanto, não encontramos nenhuma menção à diminuição da expressão</p><p>gênica em amostras de sêmen pós-infecção por COVID-19 na literatura.</p><p>Propomos que esse fenômeno pode estar associado à diminuição da</p><p>motilidade das células espermáticas após a infecção por COVID-19.</p><p>e amostras de sêmen fornecidas antes da infecção e após recuperação</p><p>comprovada foram incluídas neste estudo. Oito pacientes apresentaram</p><p>diferentes anormalidades no esperma antes da infecção. Amostras de sêmen</p><p>desses pacientes foram armazenadas antes da infecção por COVID-19,</p><p>enquanto se preparavam para a fertilização in vitro. A inclusão desses</p><p>pacientes no estudo nos permitiu determinar se eles precisavam de</p><p>tratamento adicional antes da fertilização in vitro. Estudos adicionais em</p><p>grupos maiores de pacientes com e sem anormalidades no sêmen antes</p><p>da infecção por COVID-19 fornecerão resultados mais precisos.</p><p>genes codificadores do genoma mitocondrial foram significativamente</p><p>regulados negativamente nessas amostras.</p><p>Amostras de sêmen de pacientes nos grupos de COVID-19 foram</p><p>coletadas dentro de 75 dias após a recuperação comprovada da infecção, o</p><p>que representa a duração da espermatogênese.</p><p>A análise comparativa das vias de sinalização mostrou que a via mais</p><p>fortemente regulada positivamente em amostras de sêmen coletadas após</p><p>a recuperação da infecção por COVID-19, quando comparada com amostras</p><p>de sêmen dos mesmos pacientes coletadas antes da infecção, foi a via de</p><p>sinalização IFN-g. Como outros vírus, o SARS-CoV-2 induz a liberação de</p><p>quimiocinas e citocinas de células imunes (27). O interferon gama é uma</p><p>citocina pró-inflamatória que pode ser elevada em amostras de sêmen</p><p>durante o estado inflamatório e em pacientes com infertilidade (28–30).</p><p>Estudos recentes revelaram um nível elevado de IFN-g no soro de pacientes</p><p>com infecção por COVID-19 (31, 32). Além disso, níveis elevados de IFN-g</p><p>junto com outras citocinas podem causar estresse oxidativo e aumentar a</p><p>peroxidação lipídica da membrana, o que resulta em motilidade espermática</p><p>prejudicada, capacitação e reação acrossômica (33, 34). Nossos resultados</p><p>fornecem evidências moleculares de atividade elevada de IFN-g em amostras</p><p>de sêmen coletadas após infecção por COVID-19, o que pode estar</p><p>associado à diminuição da motilidade dos espermatozoides em tais pacientes.</p><p>O hormônio luteinizante e o FSH aumentam significativamente com a</p><p>idade em homens (24). Além disso, resultados anteriores mostraram</p><p>aumentos estatisticamente significativos nos níveis médios de FSH e LH em</p><p>homens inférteis em comparação com controles férteis (25). Neste estudo,</p><p>encontramos elevações leves dos níveis de FSH em 50% dos pacientes que</p><p>se recuperaram da infecção por COVID-19 (5 de 10 pacientes), que não</p><p>foram correlacionados com os níveis de testosterona. Esta elevação</p><p>Fertil Estéril Sci®</p><p>Machine Translated by Google</p><p>O receptor SARS-CoV-2 ACE2 e TMPRSS2 são expressos principalmente em</p><p>células secretoras transitórias brônquicas. EMBO J 2020;39:e105114.</p><p>Estudos futuros, incluindo análises de amostras de sêmen obtidas em diferentes momentos</p><p>após a recuperação, fornecerão dados adicionais sobre a consistência das alterações</p><p>moleculares associadas à COVID-19 em amostras de sêmen.</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>2. 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