Aula 5 - Extracao de DNA

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<p>CENTRO UNIVERSITÁRIO DA AMAZÔNIA – UNAMA</p><p>CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA– 4º SEMESTRE</p><p>DISCIPLINA: BIOLOGIA CELULAR, TECIDUAL E MOLECULAR</p><p>Santarém-PA, 03 de Setembro de 2024</p><p>Aula 5 –</p><p>Extração de</p><p>DNA</p><p>Docente: Me. Antônio Júnior</p><p>Santarém-PA, 03 de Setembro de 2024</p><p>33</p><p>O que a Biologia Molecular faz...</p><p>A biologia molecular tem sido uma ferramenta aliada a medicina humana na pesquisa, diagnóstico e</p><p>monitoramento de diferentes tipos de doenças.</p><p>44</p><p>Possibilidades...</p><p>55</p><p>Possibilidades...</p><p>66</p><p>Mais antes de tudo isso, é preciso o principal...</p><p>⚫ Unidade básica informacional do</p><p>DNA é o gene.</p><p>⚫ Ser humano possui em torno de</p><p>30mil genes</p><p>⚫ Tamanho do genoma dos</p><p>organismos é relativo a sua</p><p>complexidade.</p><p>Virus 5-10 pb</p><p>E. coli 4,640 pb</p><p>Humano 2,900,000 pb</p><p>77</p><p>Onde se localiza o DNA na célula?</p><p>88</p><p>Onde se localiza o DNA na célula?</p><p>99</p><p>Onde se localiza o DNA na célula?</p><p>DNA</p><p>■no interior das células de procariotos</p><p>■no núcleo celular em eucariotos</p><p>1010</p><p>Aspectos básicos sobre os ácidos nucleicos</p><p>• DNA (acido desoxirribonucleico) e RNA (ácido</p><p>ribonucleico) estoca e transfere a informação</p><p>genética dos organismos vivos.</p><p>• DNA:</p><p>• – maior constituinte do núcleo</p><p>• – representação estável de completa composição genética de um</p><p>organismo</p><p>• RNA:</p><p>• – encontrado no núcleo e citoplasma</p><p>• – chave para o fluxo de informação dentro de uma célula</p><p>1111</p><p>Aspectos básicos sobre os ácidos nucleicos</p><p>DNA eucariótico</p><p>■Proteínas Básicas</p><p>Histonas + DNA=</p><p>Cromatina</p><p>1212</p><p>Extração dos ácidos nucleicos</p><p>⚫ Extração de DNA é um procedimento de rotina para</p><p>isolar e coletar o DNA.</p><p>⚫ É a primeira etapa para subsequente análise molecular</p><p>ou forense.</p><p>⚫ DNA pode ser extraído de quase qualquer tecido</p><p>celular intacto:</p><p>−Pele</p><p>−Sangue</p><p>−Saliva</p><p>−Sêmen</p><p>−Muco</p><p>−Músculo</p><p>−Osso</p><p>−Outros...</p><p>1313</p><p>Lise das Células</p><p>Lise dos Núcleos</p><p>Precipitação das Proteínas</p><p>Precipitação do DNA</p><p>Hidratação do DNA</p><p>Extração dos ácidos nucleicos</p><p>1414</p><p>⚫ Existem 3 etapas básicas na extração de DNA, os detalhes vão</p><p>depender do tipo de amostra e de qualquer substância que pode</p><p>interferir com a extração e análise:</p><p>Etapas básicas para extração de DNA</p><p>1- Romper as</p><p>células e remover a</p><p>membrana lipídica</p><p>2 - Remover</p><p>proteínas celulares</p><p>ligadas ao DNA</p><p>3 - Precipitar o</p><p>DNA em etanol</p><p>frio ou isopropanol</p><p>1515</p><p>Etapas básicas para extração de DNA</p><p>1616</p><p>⚫ A lise celular é o processo</p><p>de ruptura ou dissolução da</p><p>membrana celular que leva</p><p>à morte da célula e</p><p>liberação de seu conteúdo.</p><p>⚫ Em seguida, a adição de um detergente</p><p>que rompem as membranas celulares</p><p>− Os detergentes são capazes de romper</p><p>as membranas devido à sua natureza</p><p>anfipática (tendo ambas as regiões</p><p>hidrofílicas e hidrofóbicas). As</p><p>moléculas de detergente são capazes</p><p>de separar as membranas.</p><p>⚫ O resultado final da lise é que o conteúdo das células são</p><p>distribuídos em solução.</p><p>1 - Lise das membranas lipídicas</p><p>1717</p><p>1 - Lise das membranas lipídicas</p><p>1818</p><p>2 – Purificação do DNA</p><p>⚫ Etapa em que o DNA é separado do</p><p>restante dos componentes celulares.</p><p>⚫ A primeira parte usa fenol/clorofórmio</p><p>para remover as proteínas do DNA.</p><p>Fenol-Clorofórmio</p><p>■Estabiliza a interface entre o solvente e a fase</p><p>aquosa</p><p>■A proteína desnaturada forma uma camada</p><p>entre as duas fases</p><p>■DNA na fase aquosa</p><p>1919</p><p>2 – Purificação do DNA</p><p>⚫ A segunda parte é a adição de sais, que interrompem as</p><p>ligações de hidrogênio entre a água e a molécula de DNA</p><p>2020</p><p>⚫ O DNA é então precipitado separando das</p><p>proteínas usando isopropanol ou etanol.</p><p>⚫ Com o uso de uma microcentrífuga, o DNA</p><p>forma um pellet no fundo do recipiente;</p><p>3 – Precipitação do DNA</p><p>⚫ A) DNA é solúvel em água, mas insolúvel em álcool</p><p>a)Usa-se etanol para precipitar o DNA</p><p>b)Quanto mais gelado o etanol menos solúvel o DNA</p><p>vai estar</p><p>⚫ B)Retira-se o álcool para formação do pellet</p><p>Etanol</p><p>■O DNA é insolúvel no etanol gelado</p><p>■Quando o etanol é lentamente adicionado ao filtrado, o DNA se precipita</p><p>2121</p><p>4 – Reidratação do DNA</p><p>22</p><p>Extração de DNA</p><p>➢ Extração do DNA com fenol</p><p>O método mais utilizado para purificação do DNA é a extração com fenol tamponado, que provoca a</p><p>desnaturação das proteínas de maneira eficiente. O clorofórmio também é usado como agente desnaturante das</p><p>proteínas contidas na amostra. A mistura de fenol e de clorofórmio é muito eficiente para desproteinizar e sua</p><p>ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos.</p><p>23</p><p>Extração de DNA</p><p>➢ Purificação do DNA por meio de precipitação com etanol</p><p>A precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta</p><p>concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se</p><p>agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA,</p><p>ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra.</p><p>24</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>O sangue é composto de plasma e de células. O plasma é constituído, em sua maioria, de água e</p><p>proteínas. As células do sangue são: os glóbulos vermelhos (eritrócitos ou hemácias), os</p><p>glóbulos brancos (leucócitos) e as plaquetas.</p><p>As hemácias medem cerca de 7,5 am de</p><p>diâmetro, 2,6 am de espessura e não</p><p>possuem núcleo nem DNA, portanto</p><p>ausentes de material genético.</p><p>25</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>➢ Centrifugação para separação dos glóbulos brancos</p><p>2626</p><p>Kit comercial</p><p>27</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais</p><p>28</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais</p><p>29</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais</p><p>30</p><p>Extração de DNA de amostras de sangue</p><p>➢ Extração do DNA dos leucócitos – Kits Comerciais</p><p>➢ Solução de precipitação de proteínas</p><p>A Proteinase K é uma serino-protease de elevada</p><p>atividade enzimática, isolada do fungo Tritirachium album.</p><p>Apresenta um tamanho molecular de 28,904 KDa.</p><p>Apresenta atividade de clivagem específica em proteínas</p><p>nativas ou desnaturadas, sendo largamente utilizada na</p><p>purificação de DNA e RNA.</p><p>31</p><p>Extração de DNA de amostras de saliva e sêmen</p><p>➢ Os Kits de extração comercial se aplicam também para amostras de saliva e</p><p>sangue.</p><p>32</p><p>Extração de DNA de amostras de saliva</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=Un2C6iTSrgk</p><p>33</p><p>Extração de DNA de amostras de saliva</p><p>https://eaulas.usp.br/portal/video?idItem=5253</p><p>3434</p><p>Próximos passos –Amplificação do DNA</p><p>3535</p><p>Separação dos fragmentos para visualização</p><p>3636</p><p>Mas...</p><p>3737</p><p>Referências Bibliográficas</p><p>ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula 4a ed. Porto Alegre, Editora Artes</p><p>Médicas, 2004.</p><p>LEWIN, B. Genes IX. Porto Alegre, Editora Artes Médicas, 2009.</p><p>BIZZO, N. Novas bases da Biologia: O ser humano e o futuro. 1ª ed. São Paulo: Editora</p><p>Ática, 2011. Vol. 3.</p><p>SONIA, L.; SERGIO, R. Bio. 1ª ed. São Paulo: Editora Saraiva, 2010. Vol. 2.</p><p>AMABIS, J. M.; MARTHO, G. R. Biologia: Biologia das populações. 3ª ed. São Paulo:</p><p>Editora Moderna, 2010. Vol. 3.</p><p>MAYR, E.; Biologia, Ciência única: Reflexões sobre a autonomia de uma disciplina</p><p>científica. São Paulo: Companhia Das Letras, 2009.</p><p>3838</p><p>Referências Bibliográficas</p><p>3939</p><p>Atenção para a</p><p>FREQUÊNCIA</p><p>4040</p><p>Atividade 4 – Estudo Dirigido</p><p>1. Quais as etapas básicas para a obtenção do DNA de células vegetais e humanas? Porque a</p><p>metodologia tem diferenças dependendo do tipo de célula? Justifique sua resposta.</p><p>2. Qual a função do detergente e do sal (NaCl) no processo de extração de DNA?</p><p>3. Para extração de DNA do sangue humano, é necessário a centrifugação do mesmo. Porque</p><p>essa etapa é necessária? Justifique sua resposta.</p><p>4. Porque o DNA recém extraído é considerado impuro? O que é necessário para purificá-lo?</p><p>Justifique sua resposta.</p><p>5. Disserte em poucas palavras sobre a importância da extração de DNA e quais as</p><p>possibilidades disso.</p><p>6. Descreva</p><p>as etapas para extração de DNA de sangue.</p><p>7. Qual a importância e função da enzima proteinase K?</p><p>8. Descreva como funciona a extração de DNA, utilizando um kit comercial.</p><p>OBS: FAÇA NO CADERNO E ENTREGUE EM SALA</p><p>DE AULA, DIA 01/10/2024!</p><p>OBRIGADO</p><p>Slide 1</p><p>Slide 2</p><p>Slide 3</p><p>Slide 4</p><p>Slide 5</p><p>Slide 6</p><p>Slide 7</p><p>Slide 8</p><p>Slide 9</p><p>Slide 10</p><p>Slide 11</p><p>Slide 12</p><p>Slide 13</p><p>Slide 14</p><p>Slide 15</p><p>Slide 16</p><p>Slide 17</p><p>Slide 18</p><p>Slide 19</p><p>Slide 20</p><p>Slide 21</p><p>Slide 22</p><p>Slide 23</p><p>Slide 24</p><p>Slide 25</p><p>Slide 26</p><p>Slide 27</p><p>Slide 28</p><p>Slide 29</p><p>Slide 30</p><p>Slide 31</p><p>Slide 32</p><p>Slide 33</p><p>Slide 34</p><p>Slide 35</p><p>Slide 36</p><p>Slide 37</p><p>Slide 38</p><p>Slide 39</p><p>Slide 40</p><p>Slide 41</p>