01 Principios da Clonagem Genica

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<p>Princípios da Clonagem Molecular</p><p>Michelle Melgarejo da Rosa</p><p>2024</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=NoyeCMmP5tw&t=5s</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=79I8LoGMj50&t=4s</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=sjwNtQYLKeU</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=NoyeCMmP5tw&t=5s</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=79I8LoGMj50&t=4s</p><p>Etapas da clonagem</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA</p><p>1. Escolha do fragmento de DNA que se quer clonar;</p><p>2. Análise por softwares específicos os sítios de ligação de enzimas</p><p>de restrição que contém no fragmento de DNA (através da</p><p>sequência de nucleotídeos do DNA alvo);</p><p>3. Selecionar sítios de restrições compatíveis com o vetor que se</p><p>quer incorporar o DNA a ser clonado;</p><p>4. Escolha do melhor vetor com os sítios de restrição das mesmas</p><p>enzimas do DNA alvo para ligação.</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA - gene alvo</p><p>1. cDNA/DNA amplificado por PCR convencional, utilizando primers seletivos</p><p>(DNA pode ser isolado e purificado - métodos de extração de DNA);</p><p>2. Purificação do gel de agarose banda alvo;</p><p>3. Miniprep para purificação do DNA;</p><p>4. Ou adquirido comercialmente.</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA - Vetores principais</p><p>Plasmídeos : São moléculas de DNA circulares extracromossomais que se replicam autonomamente em</p><p>células bacterianas hospedeiras. O seu limite de clonagem é de 0.1 a 10 kb.</p><p>Fago l : O bacteriófago l infecta células bacterianas e pode ser usado como vetor de clonagem. O DNA</p><p>linear do fago integra o DNA alvo, formando então uma molécula de DNA circular que pode ser injectada</p><p>em células hospedeiras onde se replica autonomamente, resultando muitas partículas fágicas. O limite de</p><p>clonagem é de 8 a 20 kb.</p><p>Algumas características que um vector de clonagem deve</p><p>apresentar:</p><p>*Possuem locais de reconhecimento para enzimas de restrição</p><p>*Permitem a replicação</p><p>*De fácil isolamento</p><p>*Pequenas dimensões</p><p>*Permite a sua multiplicação dentro da célula com um elevado</p><p>número de cópias</p><p>*ORI</p><p>*Precisa ser digerido</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA - Digestão vetor</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA</p><p>Como pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser unidos? Um método comum utiliza dois tipos de</p><p>enzimas: enzimas de restrição e DNA ligase.</p><p>Um enzima de restrição é uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica</p><p>e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele. Muitas enzimas de restrição produzem</p><p>extremidades cortadas com saliências curtas de fita simples. Se duas moléculas tiverem saliências</p><p>correspondentes, elas podem parear bases e permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar</p><p>para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do</p><p>eixo do DNA.</p><p>Enzimas de restrição: São</p><p>provenientes de E. coli</p><p>Existem enzimas de restrição</p><p>específicas para determinados</p><p>sítios.</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA - enzimas de restrição</p><p>Etapas da clonagem - Cortando e colando DNA</p><p>O plasmídeo, que tem um único local de corte</p><p>O fragmento do gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) próximo a cada extremidade</p><p>Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante</p><p>contendo o gene.</p><p>Etapas da clonagem - Transformação e seleção bacteriana</p><p>Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, como as inofensivas E. coli utilizadas</p><p>em laboratório, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por</p><p>exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas especialmente preparadas que as</p><p>encoraja a incorporar DNA estranho.</p><p>*Recipiente com célula e plasmídeo</p><p>juntos: choque térmico ou elétrico</p><p>*Alteração da permeabilidade da</p><p>membrana. + permeável</p><p>*Entrada do plasmídeo</p><p>Etapas da clonagem - Transformação e seleção bacteriana</p><p>Etapas da clonagem - Transformação e seleção bacteriana</p><p>Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias</p><p>sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo</p><p>podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo</p><p>morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria</p><p>sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em</p><p>que todas carregam o mesmo plasmídeo.</p><p>Nem todas as colônias irão</p><p>necessariamente conter o plasmídeo</p><p>certo. Isso acontece porque, durante uma</p><p>ligação, fragmentos de DNA nem sempre</p><p>ficam "colados" exatamente da maneira</p><p>que queremos. Em vez disso, devemos</p><p>coletar o DNA de várias colonias e ver se</p><p>cada uma contém o plasmídeo certo.</p><p>Métodos como digestão por enzima de</p><p>restrição e PCR/RCP são comumente</p><p>usados para checar os plasmídeos.</p><p>Etapas da clonagem - Produção de proteína</p><p>Uma vez que encontramos uma colônia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma</p><p>grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal</p><p>químico que as instrui a produzir a proteína alvo.</p><p>As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se</p><p>nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e</p><p>a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana.</p><p>Uma vez que a proteína tenha sido produzida,</p><p>as células bacterianas podem ser abertas</p><p>para liberá-la. Existem muitas outras</p><p>proteínas e macromoléculas flutuando nas</p><p>bactérias além da proteína alvo (por exemplo,</p><p>a insulina). Devido a isso, a proteína alvo</p><p>deve ser purificada, ou separada dos outros</p><p>conteúdos das células por técnicas</p><p>bioquímicas. A proteína purificada pode ser</p><p>usada para experimentos ou, no caso de</p><p>insulina, administrada aos pacientes.</p><p>https://pt.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnolo</p><p>gy/a/overview-dna-cloning</p><p>Etapas da clonagem - Produção de proteína</p><p>https://www.mdpi.com/2409-9279/4/1/3</p><p>Usos da clonagem</p><p>Biofarmacêuticos.</p><p>A clonagem do DNA pode ser usada para produzir proteínas humanas com aplicações biomédicas, como a insulina.</p><p>Outros exemplos de proteínas recombinantes incluem o hormônio do crescimento humano, que é ministrado a</p><p>pacientes incapazes de sintetizá-lo, e o ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt), que é usado para tratar</p><p>derrames e prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas. frequentemente são produzidas</p><p>em bactérias.</p><p>Terapia genética.</p><p>Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia</p><p>genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. Por exemplo, a clonagem</p><p>do DNA foi usada para construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística.</p><p>Quando os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar</p><p>deteriorou menos rapidamente.</p><p>Análise genética.</p><p>Em laboratórios de pesquisa básica , os biólogos geralmente usam a clonagem de DNA para construir versões</p><p>artificiais, recombinantes dos genes que os ajudam a compreender como é a função normal dos genes num</p><p>organismo.</p><p>Pesquisa e descoberta de sinalizações ou influências terapêuticas.</p><p>Usos da clonagem</p><p>Ovelha Dolly - clonagem reprodutiva - transferência nuclear de células</p><p>somáticas</p><p>https://boom-pics.click/animal-cloning-dolly-the-sheep</p><p>1)Discorra sobre produção de Biofármacos com foco naqueles que</p><p>utilizaram a tecnologia do DNA recombinante.</p><p>- O que existe na literatura</p><p>- O que já está em comercialização</p><p>- O que ainda está em fase de pesquisa</p><p>- Produção</p><p>2)Fazer um desenho esquemático sobre uma tentativa de clonagem</p><p>molecular para alguma patologia de sua escolha.</p><p>Referências</p><p>https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/278102/1/DOC191.pdf</p><p>https://experiments.springernature.com/articles/10.1038/nprot.2016.055</p><p>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/</p><p>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18359830/</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_te</p><p>rm=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&</p><p>hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=</p><p>dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847</p><p>lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=h9BFBJJl3pg</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=NoyeCMmP5tw</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=79I8LoGMj50</p><p>https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/278102/1/DOC191.pdf</p><p>https://experiments.springernature.com/articles/10.1038/nprot.2016.055</p><p>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/</p><p>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18359830/</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_term=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_term=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_term=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_term=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://blog.addgene.org/plasmids-101-transformation-transduction-bacterial-conjugation-and-transfection?utm_term=&utm_campaign=Primary+Ad+Group:+Website,+blog,+collections.&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=3245806047&hsa_cam=112133441&hsa_grp=63724608643&hsa_ad=320492093642&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-596073738363&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIidrj847lgwMVtURIAB3pYA1JEAAYAiAAEgLGjfD_BwE</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=h9BFBJJl3pg</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=NoyeCMmP5tw</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=79I8LoGMj50</p>