ROTEIRO DE AULA PRÁTICA - Esgotamento_Qualitativa_Estria_Picada

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<p>COMPONENTE CURRICULAR: Microbiologia Laboratorial</p><p>TÍTULO DA AULA PRÁTICA Técnicas de Cultivo Microbiano</p><p>- Semeadura por esgotamento</p><p>- Semeadura quantitativa</p><p>- Semeadura em estria</p><p>- Semeadura em picada</p><p>PROFESSOR: Thaisy Pacheco</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>Os laboratórios de microbiologia são capazes de promover o cultivo</p><p>microbiano in vitro utilizando meios de cultura que contêm todos os elementos</p><p>essenciais para a sobrevivência dos microrganismos, além de fornecer as</p><p>condições ideais de incubação, temperatura e ambiente, necessárias para cada</p><p>espécie. Para realizar as análises que levam à identificação de uma espécie, é</p><p>fundamental isolar o microrganismo, obtendo uma cultura pura, ou seja, colônias</p><p>isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros presentes no</p><p>mesmo material. As técnicas de semeadura são métodos utilizados para</p><p>transferir inóculos microbiológicos de um meio de cultura ou material a ser</p><p>analisado para outro meio de cultura.</p><p>i. A semeadura por esgotamento é uma das técnicas mais comuns para</p><p>isolar culturas puras em amostras com culturas mistas, formando colônias</p><p>isoladas e permitindo a identificação dos microrganismos presentes.</p><p>ii. A semeadura quantitativa é utilizada para a contagem de</p><p>microrganismos em placas de Petri com meios de cultura, sendo uma das</p><p>metodologias mais empregadas nos laboratórios, pois possibilita determinar o</p><p>tamanho real de uma população bacteriana. Essa técnica permite quantificar a</p><p>exata quantidade de células vivas presentes, embora a contagem em placas</p><p>geralmente seja feita em unidades formadoras de colônias (UFC), uma vez que</p><p>as bactérias tendem a crescer em cadeias ou grumos.</p><p>iii. A semeadura de estria sinuosa em ágar inclinado, realizada em</p><p>tubos de ensaio, é utilizada para semear microrganismos fazendo estrias na</p><p>superfície do meio de cultura, sendo especialmente útil para provas bioquímicas</p><p>e para o armazenamento de bactérias.</p><p>iv. Outra técnica é a semeadura em picada, na qual o inóculo é inserido</p><p>diretamente no meio de cultura sólido, geralmente em tubos de ensaio, sendo</p><p>útil para a observação de características como a motilidade e a produção de</p><p>substâncias específicas.</p><p>Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são</p><p>empregadas técnicas assépticas, procedimentos que visam evitar a</p><p>contaminação de materiais, meios e culturas.</p><p>OBJETIVO DA AULA</p><p>• Obter colônias isoladas na técnica de semeadura por esgotamento</p><p>• Obter UFC’s para a contagem</p><p>ITENS / EQUIPAMENTOS</p><p>a. Alça de platina</p><p>b. Alça bacteriológica calibrada (1 ou 10 ul)</p><p>c. Bico de Bunsen</p><p>d. Meio de cultura em placa de Petri</p><p>e. Meio de cultura em tubos</p><p>f. Estufa bacteriológica</p><p>g. Amostra (urina)</p><p>COMO FAZER?</p><p>CONFECÇÃO DO ESFREGAÇO POR ESGOTAMENTO</p><p>1. Flambar a alça de platina, mantendo-a em contato com a chama do bico de</p><p>Bunsen até atingir o rubro para esterilizá-la, aguardando, em seguida, até o</p><p>resfriamento da mesma;</p><p>2. Com o auxílio da alça de platina, coletar a amostra e estriar na placa de Petri</p><p>com meio MacConkey estéril, conforme a Figura 1 a seguir.</p><p>* A flambagem da alça entre cada sequência de estrias aumenta a probabilidade</p><p>de obtenção de colônias isoladas.</p><p>Figura 1: Técnica de semeadura por esgotamento.</p><p>RESULTADO ESPERADO</p><p>Com o cultivo utilizando técnica de semeadura por esgotamento é</p><p>esperado que os microrganismos cresçam de forma mais concentrada no</p><p>primeiro quadrante (A) e sua concentração vai sendo reduzida ao longo das</p><p>estrias (B, C e D). Como resultado, ao final do esgotamento será possível</p><p>observar colônias microbianas isoladas, conforme observado na Figura 2. O</p><p>isolamento de colônias é uma importante ferramenta para identificação de</p><p>espécies e detecção de contaminação na cultura.</p><p>Figura 2: Colônias isoladas ao final da técnica de semeadura por esgotamento.</p><p>CONFECÇÃO DA SEMEADURA QUANTITATIVA</p><p>1. Verificar o volume da alça bacteriológica calibrada</p><p>2. Pegar a amostra com a alça bacteriológica calibrada</p><p>3. Estriar a placa de Petri em meio ágar Cled estéril, conforme a Figura 1 a</p><p>seguir:</p><p>Figura 3: Técnica de semeadura quantitativa</p><p>RESULTADOS ESPERADOS</p><p>Com o cultivo utilizando técnica de semeadura quantitativa podemos</p><p>observar o crescimento de UFCs pela placa.</p><p>Figura 4: UFCs crescidas em placa.</p><p>Em A não é possível fazer a contagem, enquanto em B observa-se 6 UFCs.</p><p>Contagem: É protocolo liberar UFC/mL – É preciso verificar qual o volume da</p><p>alça bacteriológica calibrada para fazer a contagem.</p><p>CONFECÇÃO DA TÉCNICA ESTRIA SINUOSA EM ÁGAR INCLINADO</p><p>1. Flambar a alça de platina, mantendo-a em contato com a chama do bico de</p><p>Bunsen até atingir o rubro para esterilizá-la, aguardando, em seguida, até o</p><p>resfriamento da mesma.</p><p>2. Com o auxílio da alça de platina, coletar a amostra e fazer estrias na superfície</p><p>de um tubo de ensaio contendo meio de cultura sólido, aplicando a técnica de</p><p>estria. Para isso, insira a alça na amostra e, em seguida, faça movimentos leves</p><p>na superfície do meio de cultura dentro do tubo, criando uma sequência de linhas</p><p>paralelas ou ziguezague para distribuir os microrganismos.</p><p>3. Após finalizar, flambar novamente a alça de platina para esterilizá-la.</p><p>Dica: A semeadura é feita somente na superfície do ágar. Não ocorre perfuração</p><p>do meio de cultura.</p><p>Figura 5: Técnica de semeadura de estria sinuosa</p><p>em tubo inclinado</p><p>RESULTADOS ESPERADOS</p><p>i. Crescimento ao Longo das Estrias: Espera-se que os microrganismos</p><p>cresçam ao longo das estrias feitas na superfície do meio de cultura no tubo.</p><p>Esse crescimento será visível como linhas de colônias ao longo dos trajetos</p><p>traçados pela alça de platina.</p><p>ii. Provas Bioquímicas: Se o meio de cultura no tubo for preparado para</p><p>detectar certas reações bioquímicas (como a fermentação de açúcares,</p><p>produção de gás, ou hidrólise de compostos), espera-se que os resultados</p><p>dessas provas possam ser observados onde os microrganismos cresceram.</p><p>CONFECÇÃO DA TÉCNICA SEMEADURA EM PICADA</p><p>1. Flambar a agulha de platina, mantendo-a em contato com a chama do bico de</p><p>Bunsen até atingir o rubro para esterilizá-la, aguardando, em seguida, até o</p><p>resfriamento da mesma.</p><p>2. Com o auxílio da agulha platina, coletar a amostra e introduzi-la diretamente</p><p>no meio de cultura semi-sólido dentro do tubo de ensaio. A inserção deve ser</p><p>feita de maneira vertical, perfurando o ágar de forma reta e profunda, desde o</p><p>topo até próximo ao fundo do tubo, mas sem atravessar completamente o meio.</p><p>3. Após finalizar, flambar novamente a agulha platina para esterilizá-la.</p><p>Figura 6: Técnica de semeadura em picada em meio</p><p>ágar semi-sólido</p><p>RESULTADOS ESPERADOS</p><p>i. Crescimento ao Longo da Picada: Espera-se que os microrganismos</p><p>cresçam ao longo da linha de perfuração feita pela alça de platina no meio de</p><p>cultura. O crescimento será visível como uma linha de colônias que segue o</p><p>trajeto da picada, desde a superfície até o fundo do tubo.</p><p>ii. Observação de Motilidade: Caso o microrganismo seja móvel, o crescimento</p><p>pode se espalhar a partir da linha de picada para o meio circundante, criando</p><p>uma zona difusa de crescimento ao redor do trajeto original.</p>