Texto base aula 05 - Rompimento celular - métodos mecânicos

Prévia do material em texto

<p>3.3 ROMPIMENTO MECÂNICO – Parte do capítulo de Pessoa Jr e colaboradores no livro</p><p>“Purificação de produtos biotecnológicos, operações e processos com aplicação</p><p>industrial”.</p><p>Os métodos mecânicos, de um modo geral, são os mais empregados tanto em es-</p><p>cala piloto quanto em escala industrial no rompimento de células microbianas.</p><p>Tais métodos baseiam-se na ação de forças físicas como a compressão e o</p><p>cisalhamento, ocasionadas, por exemplo, por turbulência e/ou cavitação. Entre os</p><p>equipamentos disponíveis estão aqueles que produzem as ondas ultrassônicas, os</p><p>moinhos de bolas e os homogeneizadores, sendo estes dois últimos os mais</p><p>frequentemente utilizados no rompimento celular, em função de sua maior eficiência em</p><p>termos de percentual de rompimento absoluto.</p><p>3.3.1 ULTRASSOM</p><p>O som é uma onda mecânica que se propaga em diversos materiais na forma de</p><p>ondas sonoras. Ondas ultrassônicas são aquelas cuja frequência é superior a 20 kHz, não</p><p>audíveis por seres humanos. O ultrassom é empregado em exames clínicos baseados em</p><p>imagens para detectar objetos e medir distâncias, detectar falhas em produtos e</p><p>estruturas, limpar, misturar e acelerar processos químicos e como técnica de rompimento</p><p>celular em processos biotecnológicos. O ultrassom apresenta rendimento excelente</p><p>quando aplicado a células que apresentam apenas a membrana celular, como as células</p><p>animais e hibridomas, mas também é frequentemente utilizado no rompimento de células</p><p>que possuem parede celular, como bactérias, leveduras e fungos filamentosos.</p><p>A propagação de ondas de ultrassom num meio líquido causa cavitação, que é a</p><p>formação, crescimento e ruptura de bolhas de ar num curto intervalo de tempo,</p><p>acompanhada de grande quantidade de transferência de energia para o meio na forma de</p><p>força de cisalhamento, a qual, ao chocar-se com a célula, promove sua ruptura parcial, de</p><p>tal forma que choques consecutivos levam ao rompimento da célula e consequente</p><p>liberação do conteúdo intracelular (Figura 3.3).</p><p>Figura 3.3: Esquema de um equipamento de rompimento celular por ultrassom (a) e</p><p>sequência, provocada pelo ultrassom, de deformação de uma bolha simples em colapso</p><p>com a superfície a ser rompida (b).</p><p>Um aspecto negativo a ser considerado no emprego do ultrassom para o rompi-</p><p>mento celular é o aumento da temperatura do meio, com possíveis efeitos deletérios sobre</p><p>a molécula - alvo. A utilização do ultrassom na forma de pulsos, embora não evite aumento</p><p>da temperatura do meio, minimiza esse efeito. Em geral empregam-se equipamentos de</p><p>ultrassom com monitoramento e controle da temperatura do processo por meio de</p><p>refrigeração.</p><p>Durante a operação de equipamentos de ultrassom recomenda-se o uso de potência</p><p>de operação na faixa de 0,2 a 3,0 W/mL, pois valores superiores a essa faixa podem causar</p><p>danos à sonda, reduzindo sua eficiência e tempo de vida. Adicionalmente, o uso de</p><p>ultrassom para o rompimento em larga escala é inviável, pois seria necessário utilizar</p><p>grandes quantidades de sondas, dispostas em série, acopladas a um eficiente sistema de</p><p>refrigeração, tornando o processo economicamente inviável devido a seus impactos nos</p><p>custos fixos e variáveis.</p><p>3.3.2 HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO</p><p>A homogeneização sob pressão elevada é a operação de rompimento celular mais</p><p>frequentemente utilizada na indústria biotecnológica. O equipamento é constituído de</p><p>pistões projetados para aplicar altas pressões (da ordem de 350 Mpa) e forçar a passagem</p><p>da suspensão celular por um orifício estreito. Através deste orifício a suspensão passa em</p><p>alta velocidade, é submetida a uma brusca despressurização e colisão contra uma</p><p>superfície rígida e imóvel dentro de uma câmara à pressão atmosférica. A redução</p><p>instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular. Além disso,</p><p>sob elevada velocidade de escoamento ocorre cavitação e elevada tensão de</p><p>cisalhamento e, portanto, a torção e deformação das células que causam o rompimento.</p><p>Os homogeneizadores a altas pressões, HAP, foram originalmente projetados para</p><p>uso na indústria de laticínios e, posteriormente, adaptados para o rompimento celular,</p><p>sendo atualmente os mais populares nas indústrias biotecnológicas. Na Figura 3.4 estão</p><p>representados os esquemas genéricos de homogeneizadores de alta pressão do tipo</p><p>horizontal e do tipo vertical.</p><p>Os modelos de homogeneizadores a alta pressão disponíveis no mercado</p><p>apresentam características similares àquelas apresentadas na Figura 3.4, variando em</p><p>tamanho, capacidade de produção (volume de células rompidas por unidade de tempo),</p><p>tipo de válvula de homogeneização, pressão de trabalho e número de pistões. Esses</p><p>equipamentos são indicados para romper, principalmente, bactérias e algumas</p><p>leveduras.</p><p>Figura 3.4: Esquema genérico de homogeneizadores a alta pressão com câmara horizontal</p><p>(a) e vertical (b). Destaque para a válvula de passagem da suspensão contendo as células</p><p>a serem rompidas.</p><p>No homogeneizador a alta pressão, o rompimento celular é afetado por fatores</p><p>como: pressão de operação; velocidade de alimentação; temperatura; frequência de</p><p>oscilação do pistão e sua distância em relação à base. De forma geral, a fração de células</p><p>rompidas é proporcional à pressão na alimentação. Na prática utilizam-se pressões que</p><p>variam de 5.000 a 20.000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e</p><p>concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida). O rompimento ocorre sob</p><p>condições de alta pressão e, portanto, há aumento da temperatura do meio durante o</p><p>processamento, sendo fundamental que o equipamento possua um sistema eficiente de</p><p>refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível. Para se</p><p>ter uma ideia da variação da temperatura em processos que utilizam esse tipo de</p><p>equipamento, o calor gerado no processo pode aumentar a temperatura da suspensão em</p><p>1,5 ºC para cada 1.000 psi (ou aproximadamente 68 atm) na pressão de operação, o que</p><p>significa que se o equipamento for operado a 10.000 psi, a temperatura da suspensão</p><p>aumentará em cerca de 15 ºC em apenas um ciclo de rompimento. Para processos de</p><p>recuperação de conteúdo intracelular proteico, recomenda-se a redução da temperatura</p><p>de operação (0 ºC</p><p>que o homogeneizador nem sempre é o equipamento mais adequado</p><p>para realizar o rompimento celular, principalmente quando se objetiva recuperar</p><p>bioprodutos intracelulares em fungos filamentosos, pois as hifas bloqueiam a válvula de</p><p>descarga. Nesse caso, o equipamento mais adequado é o moinho de bolas.</p><p>3.3.3 PRENSA FRANCESA - EXTRUSÃO POR PRESSÃO</p><p>A extrusão por pressão (processo mecânico em que o material é forçado a passar</p><p>através de uma matriz e ter sua forma alterada) se realiza com auxílio de um equipamento</p><p>que consiste em um cilindro de aço inoxidável (ou "célula de pressão”) contendo um</p><p>êmbolo/pistão situado em um de seus extremos e uma válvula de saída com um pequeno</p><p>orifício no outro extremo. Esse equipamento também pode ser denominado prensa</p><p>francesa (Figura 3.5). A suspensão celular (da ordem de 10 % a 15 % - massa úmida) é</p><p>pressurizada (na faixa de 1.400 a 2.800 bar – ou 1380 a 2760 atm) por um pistão utilizando</p><p>prensa hidráulica, dentro de um cilindro de aço inoxidável. No instante em que a pressão</p><p>atingir o valor desejado, abre-se a válvula ou orifício de saída para permitir a liberação lenta</p><p>(menos que 1 mL/min) da suspensão de células. A repentina redução da pressão na saída,</p><p>somada às forças de cisalhamento geradas pela válvula de saída, fazem com que as</p><p>células e as organelas se rompam.</p><p>Figura 3.5 Esquema do equipamento de extrusão por pressão (a); prensa francesa,</p><p>utilizada para rompimento celular em escala de laboratório (b).</p><p>Esse tipo de rompimento pode atingir rendimento de até 90 %, mas, apesar da</p><p>elevada eficiência, não é uma operação que possa ser utilizada em grande escala, não</p><p>somente porque os volumes de trabalho são pequenos, como por operar na forma</p><p>descontínua. É um método que deve ser utilizado em escala de laboratório e, em geral,</p><p>recomenda-se a realização de várias extrusões da mesma amostra para se obter uma</p><p>ruptura mais uniforme e completa. Um aspecto prático importante para preservar a</p><p>qualidade do produto liberado é evacuar o ar presente no cilindro para minimizar a</p><p>oxidação das proteínas. Também é primordial manter o controle da temperatura mediante</p><p>um pré e pós resfriamento da amostra.</p><p>3.3.4 MOINHOS DE BOLAS</p><p>A cominuição (o despedaçamento) de sólidos em moinhos de bolas constitui</p><p>operação unitária tradicional na indústria de processamento de pós, na mistura de</p><p>diferentes materiais, no processamento de fármacos, minérios, alimentos, tintas,</p><p>materiais refratários, materiais da construção civil e catalisadores, entre outros.</p><p>A aplicação dos moinhos de bolas em processos biotecnológicos data de 1969, com</p><p>a descrição do rompimento de células de Aspergillus sp., um fungo filamentoso. Em 1972,</p><p>se deu o rompimento de leveduras, quando o equipamento ainda não era adaptado para</p><p>operar com microrganismos. A partir de então, novos equipamentos foram projetados com</p><p>o objetivo de romper células microbianas, principalmente leveduras, fungos</p><p>filamentosos e microalgas. Esse tipo de rompimento é utilizado em aproximadamente</p><p>10% das plantas industriais de processos biotecnológicos. Geralmente, os moinhos de</p><p>bolas são compostos por uma câmara cilíndrica fecha- da, horizontal ou vertical,</p><p>denominada câmara de rompimento, por vezes acoplada a um sistema de refrigeração,</p><p>cujo conteúdo é agitado ou por agitadores internos ou pela rotação da própria câmara. A</p><p>Figura 3.6 apresenta um esquema simplificado de um moinho de bolas.</p><p>Figura 3.6 Esquema simplificado de um moinho de bolas.</p><p>Na câmara de rompimento são adicionadas esferas de vidro, metal ou cerâmica, e</p><p>as células em suspensão. Ao longo do eixo de rotação podem estar distribuídos discos ou</p><p>hastes (Figura 3.7 e 3.8) que giram e provocam atrito entre as esferas e as células intactas.</p><p>Esse atrito ocasiona o rompimento celular graças à força de cisalha- mento gerada entre</p><p>as esferas de vidro contra a parede celular. Esse processo pode gerar grande quantidade</p><p>de calor, que deve ser monitorada ou mesmo controlada por meio de sistema de</p><p>refrigeração.</p><p>Figura 3.7: Esquemas de discos rotativos usados em moinhos de bolas: disco com fendas</p><p>fechadas (a); disco com fendas abertas (b); disco perfurado (c); disco excêntrico (d);</p><p>agitador de pinos (e).</p><p>Figura 3.8: Disposição dos discos usados nos agitadores dos moinhos de bolas: discos</p><p>concêntricos (a); discos excêntricos (b); agitador de pinos (c); discos oblíquos (d).</p><p>Valores de eficiência do rompimento celular de até 90 % são reportados na literatura</p><p>empregando-se moinho de bolas, vinculados a fatores como: tipo de câmara de</p><p>rompimento; velocidade de rotação; tipo de agitador; tamanho das esferas; carga de</p><p>esferas; concentração celular; velocidade de alimentação e temperatura. Uma variação</p><p>possível é o uso de ímãs próximos ao moinho de esferas de metal, com o objetivo de gerar</p><p>maior energia no impacto das colisões entre as esferas, em função da atração magnética</p><p>e, consequentemente, maior eficiência no rompimento.</p><p>3.3.4.1 Tipo de câmara de rompimento</p><p>As câmaras dos moinhos de bolas podem ser horizontais ou verticais. As câmaras</p><p>horizontais proporcionam maior eficiência no rompimento, pois comportam maiores</p><p>cargas de esferas e abrigam mais eficientemente esferas de diâmetros reduzidos. Em</p><p>moinhos de câmaras verticais, devido à vazão de fluido ocorrer na direção ascendente,</p><p>observa-se a fluidização das esferas. Comercialmente os moinhos de bolas apresentam</p><p>diferentes relações comprimento/diâmetro (L/D), sendo que a relação ótima é de 2,5 a 3,5.</p><p>3.3.4.2 Velocidade de agitação e tipo de agitador</p><p>A velocidade do agitador permite o controle do número de contatos entre as células</p><p>e as esferas, sendo que quanto maior a velocidade de rotação, mais rápido será o</p><p>rompimento celular. Porém, a eficiência depende também do tamanho da célula:</p><p>organismos menores, como as bactérias, necessitam de velocidades maiores que</p><p>leveduras. O tipo de agitador também influencia a eficiência de rompimento, sendo que o</p><p>projeto de agitadores tem por objetivo a máxima transferência de energia cinética para as</p><p>esferas. Os agitadores podem estar dispostos no eixo central (discos concêntricos, Figura</p><p>3.8 (a)) ou fora dele (discos excêntricos, Figura 3.8 (b)), perpendicular (agitadores de pinos,</p><p>Figura 3.8 (c)) ou oblíquo (discos oblíquos, Figura 3.8 (d)).</p><p>Para uma melhor agitação, eles podem conter sulcos, pequenos cortes ou furos.</p><p>Embora haja uma grande variedade de agitadores, não é possível fazer uma correlação</p><p>direta entre o tipo de agitador e a eficiência de rompimento. A prática tem demonstrado</p><p>que a utilização de agitadores com discos rotativos de poliuretano dotados de fendas</p><p>abertas é mais eficiente que a de discos fechados.</p><p>3.3.4.3 Bolas ou esferas</p><p>As esferas utilizadas em processos de rompimento celular geralmente são de vidro,</p><p>embora elas também possam ser constituídas de outros materiais, como aço inox e</p><p>cerâmica. Estudos indicam que o tamanho médio ótimo das esferas está relacionado ao</p><p>tamanho da célula a ser rompida. Para leveduras, recomenda-se diâmetro maior que 0,5</p><p>mm. Esferas cujos diâmetros estejam entre 0,10 e 0,15 mm são indicadas para a ruptura</p><p>de células bacterianas. No caso do bioproduto desejado estar localizado no espaço</p><p>periplasmático, indica-se o uso de esferas com diâmetros maiores, pois auxiliarão na</p><p>liberação sem o rompimento total da célula.</p><p>As esferas devem ocupar entre 80 % e 85 % do volume se a câmara de rompimento</p><p>for horizontal, e entre 50 % e 60 % se a câmara for vertical. Se a carga da câmara for</p><p>reduzida (menor que 50 %) não haverá frequência de colisão suficiente para proporcionar</p><p>uma boa desintegração das células. Por outro lado, uma carga elevada de esferas irá</p><p>aumentar a frequência de choques entre as esferas, diminuindo a eficiência do processo,</p><p>além de aumentar a temperatura e o consumo de energia.</p><p>3.3.4.4 Concentração e velocidade de alimentação da suspensão de células</p><p>A concentração celular exerce influência na eficiência do rompimento,</p><p>e</p><p>recomenda-se utilizar suspensões celulares com concentrações entre 30 % e 50 % (v/v).</p><p>Concentrações celulares menores geram menos calor, mas aumentam o consumo de</p><p>energia por unidade de massa celular. A fração de células rompidas diminui com o</p><p>aumento da velocidade do fluxo de alimentação do moinho, uma vez que o tempo de</p><p>residência no rompedor é reduzido. A velocidade ótima do fluxo de alimentação depende</p><p>da velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das</p><p>propriedades do microrganismo.</p><p>3.3.4.5 Temperatura</p><p>O calor gerado pelos choques entre esferas e células demanda o controle da</p><p>temperatura da operação de rompimento e remoção do calor, a fim de prevenir a</p><p>destruição da molécula - alvo. Os moinhos são dotados de sistema de refrigeração como</p><p>camisa de resfriamento externa, para que o processo seja conduzido preferencialmente</p><p>em temperaturas inferiores a 10 ° C. Alternativamente, é possível adicionar nitrogênio</p><p>líquido à câmara de rompimento. Esse processo é geralmente denominado de processo</p><p>criogênico de rompimento em moinhos de bolas. A diversidade de moinhos de bolas</p><p>disponíveis compreende equipamentos de pequena ou larga escala que efetuam o</p><p>rompimento em regime contínuo ou descontínuo.</p><p>3. 4 CURVA DE ROMPIMENTO CELULAR</p><p>Considerando que o rompimento celular depende de uma série de parâmetros, é</p><p>importante obter uma curva de rompimento celular, avaliando parâmetros como</p><p>concentração de molécula-alvo liberada, concentração de proteínas totais no</p><p>homogeneizado celular e número de células intactas (contagem de células totais ou</p><p>densidade ótica). De forma a ilustrar melhor esses parâmetros, a Figura 3.10 apresenta um</p><p>modelo de curva de rompimento celular. Verifica-se nessa figura que no decorrer do</p><p>processo de rompimento celular ocorre redução do número de células intactas, dada pela</p><p>redução da densidade ótica, D.O., e, consequentemente, aumento do teor de proteína</p><p>total e concentração da molécula-alvo no meio processado. Assim, como o objetivo geral</p><p>dos processos de rompimento é recuperar determinada biomolécula-alvo, é importante</p><p>definir como tempo de rompimento ideal aquele que permita a maior massa de</p><p>biomolécula-alvo liberada no homogeneizado celular.</p><p>Figura 3.10 Diagrama modelar de um processo de rompimento celular: variação da</p><p>densidade ótica, D.O., da concentração de molécula - alvo e da concentração de proteína</p><p>total liberada.</p><p>Na ampliação da escala do processo de rompimento celular em moinho de bolas,</p><p>devem ser mantidos os valores empregados na escala de bancada para os seguintes</p><p>parâmetros: tamanho das esferas, proporção volumétrica entre a suspensão celular e as</p><p>esferas de vidro e velocidade periférica das pás do agitador. De modo geral, a velocidade</p><p>periférica das pás é da ordem de 10 a 15 m/s em qualquer escala, pois a energia cinética</p><p>transferida ao meio por um determinado modelo de pá independe do tamanho da câmara</p><p>de rompimento, razão pela qual é um dos parâmetros aplicados à ampliação de escala de</p><p>meios agitados</p><p>Existe uma tendência geral em romper excessivamente as células para se</p><p>assegurar que todo o produto intracelular foi liberado. No entanto, as partículas geradas</p><p>pela desintegração extrema das paredes celulares podem dificultar o processamento</p><p>posterior dos homogeneizados produzidos. Portanto, é importante otimizar os tempos de</p><p>residência ou o número de passagens para a liberação do produto no momento adequa-</p><p>do. A alta viscosidade dos homogeneizados celulares, causada pela liberação dos ácidos</p><p>nucleicos, pode ser controlada com a adição de DNAses. Alguns métodos mecânicos,</p><p>como o ultrassom ou o homogeneizador a alta pressão, que costumam ser operados por</p><p>vários ciclos, podem também contribuir com a degradação mecânica do DNA.</p>